CC BY
43
ISSN 2304-9081
Учредители: Уральское отделение РАН Оренбургский научный центр УрО РАН
Бюллетень Оренбургского научного центра
УрО РАН
2015 * № 4
Электронный журнал On-line версия журнала на сайте http://www.elmag.uran.ru
© Коллектив авторов, 2015 УДК 579.62
1 1 12 2 Т.М. Пашкова , Л.П. Попова , О.Л. Карташова , , А.С. Акжигитов
ФАКТОРЫ ПЕРСИСТЕНЦИИ ГРИБОВ РОДА MALASSEZIA, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ЗДОРОВЫХ СОБАК И СОБАК С НАРУЖНЫМ ОТИТОМ
1 Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, Оренбург, Россия
2 Оренбургский государственный аграрный университет, Оренбург, Россия
Цель. Изучение факторов персистенции грибов рода Malassezia, изолированных от собак с наружным отитом и здоровых животных.
Материалы и методы. В исследовании использовано 44 штамма грибов рода Malassezia, выделенных от здоровых собак и собак с наружным отитом. Идентификацию грибов осуществляли по J. Faergemann (2002). Способность микроорганизмов к образованию биопленок определяли по G. OToole et al. (2000); антилизоцимную, антикарнозино-вую, антигемоглобиновую и антицитокиновую активности микроорганизмов - по О.В. Бухарину и др. (1999, 2005, 2011).
Результаты. Установлена способность формировать биопленки, наличие антиге-моглобиновой активности и антицитокиновой активности в отношении ИЛ-8 у грибов рода Malassezia, выделенных у собак с наружным отитом, а также более высокий уровень выраженности антикарнозиновой и антицитокиновой активности в отношении ИЛ-4 по сравнению со штаммами, выделенными у здоровых животных.
Заключение. Полученные данные могут быть использованы для дифференциации патогенных штаммов.
Ключевые слова: грибы рода Malassezia, наружный отит, факторы персистенции
1 1 12 2 T.M. Pashkovа , L.P. Popova , O.L. Kartashovа ' , A.S. Akzhigitov
PERSISTENT FACTORS OF MALASSEZIA SPP., ISOLATED FROM HEALTHY DOGS AND DOGS WITH EXTERNAL OTITIS
1 Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, UrB RAS, Orenburg, Russia Orenburg State Agrarian University, Orenburg, Russia
Objective. The study of persistent factors of Malassezia spp., isolated from dogs with external otitis and healthy animals.
Materials and methods. The study used 44 strains of Malassezia spp., isolated from healthy dogs and dogs with external otitis. Identification of fungi was performed by J. Faergemann (2002). The ability of microorganisms to the biofilm formation was determined by G. OToole et al. (2000); antilysozyme, anticarnosine, antihaemoglobin and anticytokine activity of microorganisms - O.V. Bukharin et al. (1999, 2005, 2011).
Results. The ability to form biofilms, the presence of antihaemoglobin activity and anticytokine activity against IL-8 in Malassezia spp., isolated from dogs with external otitis, and a higher level of expression of anticarnosine and anticytokine activity against IL-4 compared with strains isolated from healthy dogs, were established.
Conclusion. The data obtained can be used to differentiate pathogenic strains.
Keywords: Malassezia spp., external otitis, persistent factors.
Введение
Грибы рода Ыа1а88в21а относятся к нормальной микрофлоре кожи человека и теплокровных животных, обеспечивающей колонизационную резистентность кожных покровов [1]. С другой стороны, при определенных условиях они могут явиться причиной развития патологических процессов в макроорганизме, в частности наружного отита [2]. Это объясняется наличием у грибов рода Ыа1а88в21а комплекса факторов патогенности и персистенции [3]. Ранее было показано, что штаммы, вызывающие наружные отиты у собак, характеризуются наличием антилизоцимной активности и способности формировать биопленки [4, 5], антикарнозиновой и антигемоглобиновой активности [6]. Вместе с тем, комплекс персистентных свойств (биопрофиль) грибов, выделенных у здоровых животных и собак с наружным отитом, не охарактеризован.
В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение факторов персистенции грибов рода Ма/а&^/а, изолированных от собак с наружным отитом и здоровых животных.
Материалы и методы
Материалом для исследования послужили 44 штамма грибов рода Ма/ал^/а, выделенных из наружного слухового прохода здоровых собак (п=20, 1 группа) и собак с наружным отитом (п=24, 2 группа). Исследуемый материал получали методом смывов с помощью тампона из наружного слухового прохода животных [7], засевали на питательные среды: среда Лимин-га-Нотманна и кровяной агар. Чашки со средой Лиминга-Нотманна инкубировали при температуре 37оС в течение 48 часов, чашки с кровяным агаром -при температуре 37оС в течение 18-24 часов. Идентификацию грибов осуществляли по морфологическим и культуральным характеристикам [8].
Способность микроорганизмов образовать биопленки (ОБ) определяли по методике О. 0'Тоо1е е1 а1. [9]. Коэффициент биопленкообразования (КБ) рассчитывали как отношение оптической плотности раствора кристаллического фиолетового, связавшегося с клетками микроорганизмов (опыт), к оптической плотности раствора в контроле. Положительными считали значения коэффициента более 1,1. Антилизоцимную активность (АЛА) микроорганизмов определяли по методике О.В. Бухарина [10], антикарнозиновую (АКрА) - по методике О.В. Бухарина с соавт. [11], антигемоглобиновую активность
(АНЬА) - по методике О.В. Бухарина с соавт. [12]. Антицитокиновую актив-
2
ность (АЦА) в отношении ИЛ-4, ИЛ-8, ИФН-у определяли по методике О.В. Бухарина с соавт. [13].
Статистическую обработку данных проводили с использованием параметрических методов. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента [14].
Результаты и обсуждение
На первом этапе исследования проведена идентификация грибов рода Malassezia, выделенных у здоровых собак и собак с наружными отитами. Установлено, что у здоровых животных доминировал вид M. pachydermatis (75%), M. obtusa изолировали в 25% случаев, при этом Malassezia spp. в 75% случаев выделяли в монокультуре и в 25% - в ассоциации с бактериями.
У собак с наружными отитами M. pachydermatis выделяли в 87,5%, M. furfur - в 8,3% и M. obtusa - в 4,2% случаев, причем грибы рода Malassezia в монокультуре выделяли в 29,2% случаев, а в ассоциации с бактериями - в 70,8%.
На следующем этапе исследования изучены распространенность и выраженность факторов персистенции (АЛА, АКрА, ОБ, AHbA) у грибов рода Malassezia, выделенных от животных 1 и 2 групп.
Распространенность АЛА среди грибов, выделенных как в норме, так и при патологии, составила 100%. Способность инактивировать карнозин обнаружена у 50% изолятов грибов, выделенных у животных 1 группы, и у 29,2% изолятов, выделенных у животных 2 группы. Грибы рода Malassezia, формирующие биопленки и обладающие AHbA, выявляли только у больных животных в 41,7% и 29,2% случаев, соответственно.
Выраженность персистентных характеристик у грибов рода Malassezia из сравниваемых групп представлена на рисунке 1.
Грибы рода Malassezia, выделенные у животных 1 и 2 групп, по уровню экспрессии антилизоцимного признака не отличались - их показатели составили 2,0±0,14 мкг/мл и 2,0±0,03 мкг/мл, соответственно, а выраженность у них АКрА равнялась 1,4±0,2 и 1,9±0,1 мг/мл (p<0,05), соответственно. КБ составил 1,2±0,02 у.е., а среднее значение выраженности антигемоглобиновой активности было равно 2,7±0,8 г/л; эти показатели регистрировались только у грибов рода Malassezia, выделенных только от больных животных.
3 1
2,5--
2---1
1,5--
1--
0,5--
0 -I--
Malassezia 8рр., выделенные от Malassezia 8рр., выделенные от
здоровых животных животных с наружным отитом
□ АЛА □ АКрА □ AHbA □ ОБ
Рис. 1. Выраженность факторов персистенции Ыа1а88в21а ¿рр., выделенных от здоровых собак и собак с наружным отитом.
Обозначения: * - p<0,05; достоверность различий в выраженности АКрА у Malassezia ¿рр., выделенных от здоровых собак и собак с наружным отитом.
Далее была изучена антицитокиновая активность АЦА) грибов рода Malassezia в отношении провоспалительных (ИЛ-8 и ИФН-у) и противовоспалительных (ИЛ-4) цитокинов. Способность к инактивации ИФН-у и ИЛ-4 регистрировалась у 100% изолятов, выделенных у животных 1 группы, и у 95,8% изолятов 2 группы, а АЦА в отношении ИЛ-8 была выявлена только у 21% штаммов грибов рода Malassezia, выделенных из наружного слухового прохода только больных животных 2 группы. Параметры выраженности АЦА у грибов рода Malassezia сравниваемых групп представлены на рисунке 2. % -
40--
30---ь
20--
10--
0 -I--
Malassezia spp., выделенные от здоровых Malassezia spp., выделенные от животных с животных наружным отитом
□ АЦА в отношении ИЛ-4 □ АЦА в отношении ИЛ-8 □ АЦА в отношении ИФН-у
Рис. 2. Выраженность антицитокиновой активности Malassezia ¿рр., выделенных от здоровых собак и собак с наружным отитом.
Обозначения: * - р<0,05; достоверность различий в выраженности АЦА в отношении ИЛ-4 у Malassezia ¿рр., выделенных от здоровых собак и собак с наружным отитом.
Среднее значение АЦА в отношении ИФН-у у изолятов грибов рода
Ма1а88в21а в 1 группе составляло 35,3±1,9%, во 2 группе - 33,6±2,2% (рис. 2). Выраженность АЦА в отношении ИЛ-4 у грибов рода Ма/а&^/а, выделенных из слухового прохода здоровых животных, была ниже, чем у грибов, выделенных у собак с наружными отитами: 30,5±1,6% против 39,6±1,3%, соответственно (р<0,05). Уровень АЦА в отношении ИЛ-8 у грибов рода Ма/ал^/а, выделенных из наружного слухового прохода животных 2 группы, составил 23,3±5,8%.
Таким образом, в результате проведенных исследований определены биологические свойства, по которым изученные группы штаммов рода Ма1а88в21а различались между собой. Так, грибы, выделенные при наружном отите у собак, обладали способностью инактивировать лизоцим, карнозин, формировать биопленки, а также антигемоглобиновая активность и антици-токиновая активность в отношении ИЛ-4, ИЛ-8, ИФН-у, тогда как штаммы грибов рода Ма/а&^/а, выделенные от здоровых собак, характеризовались наличием АЛА, АКрА, АЦА в отношении ИЛ-4 и ИФН-у.
Сравнение уровней экспрессии этих признаков показало, что у грибов рода Ма/а&^/а, выделенных из патологического материала, выраженность АКрА и АЦА в отношении ИЛ-4 в 1,3 раза выше, чем у грибов, изолированных у здоровых животных.
Заключение
Известно, что эндогенные инфекции, к которым относится отит, могут вызывать лишь представители аутофлоры, обладающие определенным набором патогенных свойств (биопрофилем), который позволяет им состояться в качестве возбудителя. В биопрофилях возбудителей эндогенных инфекций приоритетное место по своей патогенетической значимости занимают перси-стентные свойства, обеспечивающие «иммунорезистентность» микроорганизмов и их выживание при контакте с гуморальными и клеточными эффекторами антимикробной защиты хозяина [15].
Проведенные исследования показали, что все штаммы грибов рода Ма/ал^/а, выделенные при патологии, обладали комплексом изученных факторов персистенции, тогда как штаммы, выделенные от здоровых животных, характеризовались лишь способностью к инактивации лизоцима и кар-нозина, антицитокиновой активностью в отношении ИЛ-4 и ИФН-у, что свидетельствует о более выраженном патогенном потенциале грибов, выделенных у собак с наружными отитами.
Полученные в настоящей работе данные о способности грибов рода Malassezia изменять содержание цитокинов в условиях in vitro, в частности, наличие АЦА в отношении ИЛ-8 и высокие значения АЦА в отношении противовоспалительного цитокина ИЛ-4 у штаммов, выделенных от больных животных, свидетельствуют о возможном влиянии экзометаболитов липоли-тических грибов Malassezia на локальный цитокиновый баланс, что может поддерживать воспалительный процесс.
Установлено, что изоляты грибов, выделенные при патологии, характеризуются более высокими значениями АКрА и АЦА в отношении ИЛ-4. Эти данные согласуются с результатами [16-19], в которых показано, что штаммы микроорганизмов, выделенные при патологии, характеризуются более высоким уровнем выраженности факторов персистенции по сравнению с изолята-ми, выделенными от здоровых животных.
Совокупность изученных биологических свойств (биопрофиль) - ОБ, АНЬА, АЦА в отношении ИЛ-8, вкупе с данными о более выраженной экспрессии АКрА и АЦА в отношении ИЛ-4 у штаммов грибов Malassezia, выделенных от больных животных, могут быть использованы для дифференциации патогенных вариантов грибов данного семейства.
ЛИТЕРАТУРА
1. Литвинов А.М., Ивченко О.В., Касьянов А.И. Малассезиозы животных. Ветеринария. 2010. 6: 13-15.
2. Овчинников Р.С., Маноян М.Г., Ершов П.П.. и др. Грибы рода Malassezia в заболеваниях животных. Vetpharma. 2013. 1(12): 30-38.
3. Акжигитов А.С., Капустина О.А., Пашинин Н.С. Биологические свойства Malassezia pachydermatis, выделенных от собак. Вестник ветеринарии. 2013. 1(64): 53-55.
4. Уткина Т.М., А.С. Акжигитов, Р.М. Нургалиева Видовой состав и факторы персистенции микроорганизмов, выделенных от собак с отитами. Вестник ветеринарии. 2014. 2: 47-49.
5. Акжигитов А.С., Пашкова Т.М., Карташова О.Л. Антилизоцимная активность микроорганизмов - возбудителей отитов у собак. Проблемы медицинской микологии. 2015. 17. (2): 35.
6. Пашкова Т.М., Акжигитов А.С., Карташова О.Л. и др. Антикарнозиновая и антигемо-глобиновая активности микроорганизмов, выделенных от собак с наружными отитами. Материалы международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы ветеринарной науки». Ульяновск, 2015: 60-62.
7. Ершов П.П. Изучение клинико-эпизоотологических особенностей Malassezia-инфекций собак и кошек в Московском регионе. Ветеринарная медицина. 2008. 1: 23-24.
8. Faergemann J. Atopic Dermatitis and Fungi. Clinical Microbiology Reviews. 2002. 15. (4): 545-563.
9. OToole G., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development. Annu Rev Microbiol. 2000. 54: 49-79.
10. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М.: Медицина, 1999. 366 с.
11. Бухарин О.В., Чернова О.Л., Матюшина С.Б. Способность стафилококков к инактивации карнозина. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1999. 5: 545-546.
12. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Ханина Е.А. Определение антигемоглобиновой активности. Патент РФ 2262705. Бюл., 2005. №29.
13. Бухарин О.В., Перунова Н.Б., Чайникова И.Н. и др. Антицитокиновая активность микроорганизмов. Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2011. 4: 56-61.
14. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз, 1962. 182 с.
15. Гриценко В.А., Иванов Ю.Б. Роль персистентных свойств микроорганизмов в патогенезе эндогенных инфекций. Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2009. 4: 66-71.
16. Сычева М.В., Карташова О.Л. Биологические свойства энтерококков различного происхождения. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2015. 4: 17-21.
17. Пошвина Д.В., Щепитова Н.Е., Сычева М.В. и др. Видовая характеристика и факторы персистенции энтерококков, выделенных в норме и при патологии. Ветеринария. 2015. 6: 26-29.
18. Сычева М.В., Пашкова Т.М., Карташова О.Л. и др. Характеристика антицитокиновой активности энтерококков. Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН. 2015. 3: 1-6 [Электронный ресурс]. (URL: http://elmag.uran.ru:9673/magazine/Numbers/2015-3/ Articles/SMV-2015-3.pdf).
19. Пашинина О.А., Карташова О.Л., Пашкова Т.М. и др. Характеристика биопрофилей Candida albicans, выделенных у здоровых лиц и при патологии. Проблемы медицинской микологии. 2015. 17. (3): 46-49.
Поступила 16.11.2015
(Контактная информация: Карташова Ольга Львовна - д.б.н., зав. лабораторией
по изучению механизмов и регуляции персистенции бактерий Института клеточного и
внутриклеточного симбиоза УрО РАН; адрес: 460000, г. Оренбург, ул. Пионерская, 11,
тел/факс (3532)774463, e-mail: labpersist@mail.ru)
LITERATURA
1. Litvinov A.M., Ivchenko O.V., Kas'janov A.I. Malasseziozy zhivotnyh. Veterinarija. 2010. 6: 13-15.
2. Ovchinnikov R.S., Manojan M.G., Ershov P.P.. i dr. Griby roda Malassezia v zabolevanijah zhivotnyh. Vetpharma. 2013. 1(12): 30-38.
3. Akzhigitov A.S., Kapustina O.A., Pashinin N.S. Biologicheskie svojstva Malassezia pachydermatis, vydelennyh ot sobak. Vestnik veterinarii. 2013. 1(64): 53-55.
4. Utkina T.M., A.S. Akzhigitov, R.M. Nurgalieva Vidovoj sostav i faktory persistencii mikroorganizmov, vydelennyh ot sobak s otitami. Vestnik veterinarii. 2014. 2: 47-49.
5. Akzhigitov A.S., Pashkova T.M., Kartashova O.L. Antilizocimnaja aktivnost' mikroorganizmov - vozbuditelej otitov u sobak. Problemy medicinskoj mikologii. 2015. 17. (2): 35.
6. Pashkova T.M., Akzhigitov A.S., Kartashova O.L. i dr. Antikarnozinovaja i antigemoglobinovaja aktivnosti mikroorganizmov, vydelennyh ot sobak s naruzhnymi otitami. Materialy mezhdunarodnoj nauchno-prakticheskoj konferencii «Aktual'nye voprosy veterinarnoj nauki». Ul'janovsk, 2015: 60-62.
7. Ershov P.P. Izuchenie kliniko-jepizootologicheskih osobennostej Malassezia-infekcij sobak i koshek v Moskovskom regione. Veterinarnaja medicina. 2008. 1: 23-24.
8. Faergemann J. Atopic Dermatitis and Fungi. Clinical Microbiology Reviews. 2002. 15. (4): 545-563.
9. OToole G., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development. Annu Rev
Microbiol. 2000. 54: 49-79.
10. Buharin O.V. Persistencija patogennyh bakterij. M.: Medicina, 1999. 366 s.
11. Buharin O.V., Chernova O.L., Matjushina S.B. Sposobnost' stafilokokkov k inaktivacii karnozina. Bjulleten' jeksperimental'noj biologii i mediciny. 1999. 5: 545-546.
12. Buharin O.V., Usvjacov B.Ja., Hanina E.A. Opredelenie antigemoglobinovoj aktivnosti. Patent RF 2262705. Bjul., 2005. №29.
13. Buharin O.V., Perunova N.B., Chajnikova I.N. i dr. Anticitokinovaja aktivnost' mikroorganizmov. Zhurnal mikrobiol., jepidemiol. i immunobiol. 2011. 4: 56-61.
14. Ashmarin I.P., Vorob'ev A.A. Statisticheskie metody v mikrobiologicheskih issledovanijah. L.: Medgiz, 1962. 182 s.
15. Gritsenko V.A., Ivanov Ju.B. Rol' persistentnyh svojstv mikroorganizmov v patogeneze jendogennyh infekcij. Zhurnal mikrobiol., jepidemiol. i immunobiol. 2009. 4: 66-71.
16. Sycheva M.V., Kartashova O.L. Biologicheskie svojstva jenterokokkov razlichnogo proishozhdenija. Zhurnal mikrobiologii, jepidemiologii i immunobiologii. 2015. 4: 17-21.
17. Poshvina D.V., Shhepitova N.E., Sycheva M.V. i dr. Vidovaja harakteristika i faktory persistencii jenterokokkov, vydelennyh v norme i pri patologii. Veterinarija. 2015. 6: 26-29.
18. Sycheva M.V., Pashkova T.M., Kartashova O.L. i dr. Harakteristika anticitokinovoj aktivnosti jenterokokkov. Bjulleten' Orenburgskogo nauchnogo centra UrO RAN. 2015. 3: 1-6 [Jelektronnyj resurs]. (URL: http://elmag.uran.ru:9673/magazine/Numbers/2015-3/ Articles/SMV-2015-3.pdf).
19. Pashinina O.A., Kartashova O.L., Pashkova T.M. i dr. Harakteristika bioprofilej Candida albicans, vydelennyh u zdorovyh lic i pri patologii. Problemy medicinskoj mikologii. 2015. 17. (3): 46-49.
Образец ссылки на статью:
Пашкова Т.М., Попова Л.П., Карташова О.Л., Акжигитов А.С. Факторы персистенции
грибов рода Malassezia, выделенных от здоровых собак и собак с наружным отитом. Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН. 2015. 4: 1-8 [Электронный ресурс]
(URL: http://elmag.uran.ru: 9673/ magazine/Numbers/2015 -4/Articles/PTM-2015-4.pdf).
