CC BY
19
Научни трудове на Съюза на учените в България - Пловдив. Серия Г. Медицина, фармация и дентална медицина т. ХХ. ISSN 1311-9427 (Print), ISSN 2534-9392 (On-line). 2017. Scientific works of the Union of Scientists in Bulgaria-Plovdiv, series G. Medicine, Pharmacy and Dental medicine, Vol. ХХ. ISSN 1311-9427 (Print), ISSN 2534-9392 (On-line). 2017.
ДИФЕРЕНЦИАЛНА ЕКСПРЕСИЯ НА ПРОТЕИН-КОДИРАЩИ
ГЕНИ ПРИ ДЕЦА СЪС СПЕЦИФИЧНО НАРУШЕНИЕ В РЕЧЕВОТО РАЗВИТИЕ И РАЗСТРОЙСТВО ОТ АУТИСТИЧНИЯ
СПЕКТЪР
Христо Иванов1, Николай Попов4, Тихомир Въчев5, Ралица Йорданова1, Илиана Пачева1,2, Фани Гълъбова1, Иван Иванов1,2, Вили Стоянова1,3. 1. Катедра по педиатрия и медицинска генетика, Медицински Факултет, Медицински университет Пловдив. 2. Клиника по детски и генетични заболявания, УМБАЛ "Св. Георги", Пловдив 3. Отделение по Медицинска генетика, УМБАЛ „Св. Георги", Пловдив
4. Държавна психиатрична болница - Пазарджик - гр. Пазарджик
5. Катедра по физиология на растенията и молекулярна биология,
Пловдивски университет "П. Хилендарски" - гр. Пловдив
DIFFERENTIAL EXPRESSION OF PROTEIN-CODING GENES IN CHILDREN WITH SPECIFIC LANGUAGE IMPAIRMENT AND AUTISTIC SPECTRUM DISORDERS Hristo Ivanov1, Nikolai Popov4, Tihomir Vachev5, Ralitsa Yordanova1, Iliana Pacheva1,2, Fani Galabova1, Ivan Ivanov1,2, Vili Stoyanova1,3. 1. Department of Pediatrics and Medical Genetics, Faculty of Medicine,
Medical University -Plovdiv. 2. Department of Pediatric and genetic diseases, University Hospital "St. George", Plovdiv
3. Department of Medical Genetics, University Hospital "St. George ", Plovdiv 4. State Psychiatric Hospital - Pazardzhik - Pazardzhik 5. Department of Plant Physiology and Molecular Biology, University of Plovdiv "P. Hilendarski "- Plovdiv
Abstract
Autistic spectrum disorders is characterized by deficits in social and communicative interactions and stereotyped behavior, interests and activities.
Specific language impairment is characterized by disproportionately delayed speech development with normal nonverbal intelligence. As with almost all psychiatric disorders,
there are no known molecular or physiological markers.
Advances in molecular genetics allow for a large-scale gene expression analyzes that help to evaluate possible transcriptomic variations in these disorders
The study included 30 children with autistic spectrum disorders, 30 children with specific language impairment and 30 healthy children (control group).
The gene expression profiles were analyzed in a pool probe for each group of the study. By conducting sequencing of copy DNA we obtained information for the quantitative change in the expression of the protein coding genes.
Based on the conducted expression analysis were identified differentially expressed genes with statistically significant change (p <0.01 and FDR <0.001)
If the results of this work are confirmed in future studies and the identified changes in the study groups are individually validated in other independent cohorts, we can assume that the differentially expressed genes may help clarify the etiology and pathogenesis of these disorders and the dysregulated pathways may also provide targets for the experimental treatments in ASD and SLI.
Key words: Autism, transcriptome, gene expression, specific language impairment
Въведение
Разстройството от аутистичният спектър (РАС) е едно от най-тежките невропсихиатрични разстройства, започващо в детството (Picciotto, 2009), с честота 1:88 деца. Субективното оценяване и трудностите в изследването на тези пациенти предполага нуждата от по-точни, биологични маркери за диагностицирането и прогнозирането на разстройството. Специфично нарушение в речевото развитие (СНРР) е друго често социално-значимо нарушение с честота около 7% от децата в предучилищна възраст, което се характеризира с диспропорционално забавено речево развитие при нормален невербален интелект (Tomblin,1996).
Нарушението на развитие на речта е ключова черта, ядрен симптом и за двете разстройства. В този смисъл двете нарушения могат да бъдат приети в континуум, където нарушенията на експресивната реч са най-леки при СНРР, последвани от смесените нарушения в експресивната и рецептивната реч, а най-тежкото нарушение е детския аутизъм.
Независимо от интензивните проучвания и двете невропсихични разстройства са с неизяснена етиология, при сигурни данни за генетична основа (Geschwind,2008; Bishop, 1995).
Както при почти всички психиатрични разстройства, и при РАС и СНРР липсват познати молекулярни или физиологични маркери. Обсъждани са множество наследствени маркери и са налични множество изследвания със сигурни доказателства за ролята на генетични фактори в етиопатогенезата на тези разстройства. Предполага се, че евентуалните нарушения в експресионните модели могат да служат за молекулярни биомаркери на разстройствата. И докато съвременни изследвания при аутизъм показват, че редица протеин кодиращи гени са с променена експресия, то проучвания върху генната експресия при пациенти СНРР липсват (Tsankova, 2007).
Възможно е двете разстройства да имат значително различаваща се генетична основа. Това е предпоставка да се обсъди възможността при аутистичното разстройство да съществуват модифициращи молекулярно-биологични механизми, които са причина за появата на останалите ядрени симптоми на аутизма - нарушения в интерперсоналните взаимоотношения и стереотипното поведение.
Целта на проучването е да установи има ли промяна в експресията на протеин кодиращите гени при деца с РАС и СНРР сравнени с здрава контролна група.
Материали и методи
Участници
В проучването се включени 30 деца с РАС, 30 деца с СНРР и 30 здрави деца. За проучването използвахме тотална РНК от венозна кръв, взета и съхранена в Pax Gene Tube система според изискванията на производителя.
Методи
Изолирането и съхранението на проби от тотална РНК се проведе с използването на PAXgene Blood miRNA Kit според изискванията на производителя. Бяха създадени три комплексни пула проби за всяка група от проучването. След синтез на копи ДНК пробите са подложени на секвениране чрез Illumina HiSeqTM 2000.
Генната експресия се изчислява по RPKM (Reads Per kb per Million reads) (Mortazavi, 2008) метода.
За идентифицирането на диференцирано експресирани гени е използвана /-стойностга като показател за диференциална генната експресия и FDR стойността (False Discovery Rate) за оценка на прага на /»-стойността. В настоящата работа е използвано FDR < 0.001 и абсолютната стойност на съотношението log2 > 1, като праг за преценка на разликата при генната експресия.
Резултати
Диференциално експресирани гени при деца с РАС и контролната група
Установихме 23 гена с променена експресия - 10 гена с повишена експресия и 13 с понижена експресия които отговарят на всички дискриминативни критерии заложeни при филтруването.
Гените с повишена експресия са: SLC8A1, ANKRD22, SCAND1, RAP1GAP, DPM3, CRB2, TPX2, HLA-DQA2, CD177, LTF.
Гените с понижена експресия са: TM4SF1, MAGEA4, FLNC, IGF2BP1, FOSL1, OTOF, TRIM17, TMEM40, SERPINE1, BIVM, BCYRN1, L0C653160
Диференциално експресирани гени между децата с СНРР и контролната група
Открихме 61 гена с променена експресия - 47 гена с повишена експресия и 14 с понижена експресия.
Гените с повишена експресия са: GINS2, GLDC, ISG15, RSAD2, CD177, IFI44L, IGJ, BATF2, ANKRD22, RAP1GAP, IGLL5, CMPK2, SERPING1, IFIT1, TPX2, HERC5, MRPL40, C22orf23, CD38, MX1, SMTNL1, USP18, MBNL1-AS1, IGLL3P, OAS3, ETV7, CHPF, IFI44, TXNDC5, MIR650, IFIT3, OASL, BUB1, EPSTI1, SIGLEC1, MYBL2, IFI6, OTOF, ELL2, IKZF3, LINC00852, SEC61G, MZB1, TOP2A, SPAG5, LY6E, OAS1.
Гените с понижена експресия са: FLNC, L0C100505716, LOC284379, LINC00470, LINC00470, RND2, HSD17B13, DET1, MORN4, NKX3-1, TMEM254-AS1, HEXA-AS1, SLITRK4, PRELP, L0C440335.
Диференциално експресирани гени между деца с РАС и СНРР
Списъка с диференциално експресираните гени включва 42 гена - 10 с повишена експресия и 32 с понижена експресия.
Гените с повишена експресия са: SLC8A2, MGC50722, HYAL3, LOC284379, L0C100505716, MYEOV2, SPNS3, CXCL14, SLITRK4, HEXA-AS1.
Гените с понижена експресия са: TM4SF1, BEND3, OTOF, RSAD2, MBNL1-AS1, IFI44L, HPGD, MCM10, USP18, IFI44, SMTNL1, IFIT1, HERC5, IFI6, SERPING1, OAS3, IGLL5, MX1, CMPK2, OASL, ISG15, IGLL3P, IFIT3, IFI27, EPSTI1, SIGLEC1, TNFAIP6, IFIT2, IKZF3, OAS1, OAS2, TUBB4A.
Дискусия
В настоящото проучване, за първи път в България е проведен цялостен транскрипционен анализ при пациенти с разстройство от аутистичния спектър, специфично нарушение в
15
речевото развитие и здрави контроли.
Някои от диференциално експресираните гени са асоциирани с РАС и при други проучвания търсещи етиопатогенезата му. CD177, CRB2, DPM3, MAGEA4 и OTOF са нови кандидат гени.
Установихме четири гена с повишена експресия и при децата с РАС и СНРР при сравнение с контролната група: ANKRD22, RAP1GAP, TPX2 и CD177.
От гените с променена експресия само FLNC е с намалена експресия и при двете разстройства сравнени с контролната група.
В обобщение установихме различни диференциално експресираните гени при РАС и при СНРР. Но и при двете разстройства гените са свързани с основни киназни и/ или сигнални пътища, свързани с развитието и функциите, както на нервната, така и на имунната система. Резултатите ни подкрепят участието на различни генетични фактори (хетерогенност) в развитието на РАС и на СНРР, които се свързват с основни пътища свързани с диференциация, клетъчно оцеляване, междуклетъчна сигнализация, развитийни процеси, реагиране на оксидативен стрес, имунни процеси и синаптична структура и пластичност. Можем да спекулираме, че откритите сходни промени в диференциалната генна експресия имат отношение към изоставане в речевото развитие.
Резултатите от нашето изследване показват, че съществуват ясни и съществени нарушения в генната експресия в периферни кръвни проби на деца с РАС и СНРР в сравнение със здрави контроли. Проучването е потвърждение, че периферната кръв е потенциално полезен източник на диагностични биомаркери за нарушения на мозъка и други недостъпни тъкани. Настоящите резултати са основание да предположим, че диференциално експресираните гени могат да бъдат използвани като потенциални биомаркери, а дисрегулираните пътища, в които те участват да се превърнат в таргети за прицелни терапии при тези разстройства. За потвърждение на нащата теза са необходими бъдещи проучвания в тази насока.
Настоящото изследване е все още в начален етап, но получените резултати са предизвикателство за по-задълбочени проучвания в по-големи групи от пациенти.
Литература:
1.Hertz-Picciotto I., Delwiche L. The rise in autism and the role of age at diagnosis. Epidemiology, 2009;20(1):84-90.
2.Tomblin JB, Records NL, Zhang X. A system for the diagnosis of specific language impairment in kindergarten children. J Speech Hear Res. 1996 Dec;39(6):1284-94.
3.Geschwind DH. Autism: many genes, common pathways? Cell. 2008; 135(3):391-5
4.Bishop DV, North T, Donlan C. Genetic basis of specific language impairment: evidence from a twin study. Dev Med Child Neurol. 1995;37(1):56-71.
5.Tsankova N, Renthal W, Kumar A, Nestler EJ. Epigenetic regulation in psychiatric disorders. Nat Rev Neurosci. 2007;8(5):355-67.
6.Mortazavi, A., B. A. Williams, et al . (2008). Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5(7): 621-8.
