CC BY
13Диагностика внутриутробных инфекций у новорожденных в раннем неонатальном периоде
кжнтА.Н. Аксенов, д.м.н. И.И. Бочарова, к.м.н. Н.Ф. Башакин, к.м.н. М.В. Троицкая, А.А. Якубина, М.Ю. Букина, д.м.н. Т.С. Будыкина
ГБУЗ «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии» МО
Внутриутробная инфекция (ВУИ) занимает одно из
ведущих мест в структуре неонатальной смертности, являясь основной причиной смерти или осложняя течение основного заболевания у 37,5% умерших новорожденных. Достоверных данных об истинной распространенности ВУИ нет. Однако, согласно данным ряда исследований, инфекционные заболевания выявляют у 50-60% госпитализированных доношенных и 70% недоношенных новорожденных [1]. Основной причиной ВУИ являются инфекционные урогенитальные заболевания матери, частота которых в структуре заболеваемости беременных сохраняется высокой в течение последних 10 лет и составляет 88-100 на 1000 беременных. К сожалению, в настоящее время мы не имеем достоверных сведений о вероятности заражения плода от инфицированной матери, но риск инфицирования плода различными микроорганизмами, выделенными у матери, колеблется от 5 до 70%, а данные о частоте реализации инфекции у новорожденного недостаточны и крайне противоречивы [2, 3].
Ранняя диагностика инфекционно-воспалительных заболеваний у новорожденных остается актуальной до настоящего времени, в связи с чем в последние годы применяются новые информативные диагностические методики. К ним относятся исследование цитокинового статуса [4, 5], определение белков острой фазы (С-ре-активный белок) [6, 7] и прокальцитонина (ПКТ) [8, 9], а также другие диагностические тесты, характеризующиеся выявлением того или иного достоверно отличающегося параметра [10-14].
Большой интерес представляет исследование роли про- и противовоспалительных цитокинов в патогенезе инфекционных заболеваний у новорожденных [15-17]. Во многих работах [18-20] сообщается о высокой диагностической и прогностической ценности определения уровней ФНО и ИЛ-8 при неонатальном сепсисе. Некоторые авторы [21, 22] для повышения информативности теста на С-реактивный белок предлагают использовать его комбинацию с определением уровня ИЛ-6, который играет важную роль в запуске синтеза С-реактивного белка гепатоцитами, при диагностике неонатальных бактериальных инфекций.
Доказано, что ПКТ является чувствительным маркером системной воспалительной реакции у новорожденных на 3-7-е сут жизни, а после 14-го дня жизни отмечается увеличение диагностической значимости про-воспалительных цитокинов. Однако ПКТ может превосходить С-реактивный белок в определении и оценке тяжести инфекции, о чем свидетельствует опыт многих
исследований. Несмотря на большое число публикаций, посвященных диагностической значимости ПКТ при системных инфекциях, в т. ч. и у новорожденных, нет однозначного мнения о возможности использования этого показателя при диагностике инфекционно-воспали-тельных заболеваний в первые 2 сут жизни в связи с большим разбросом его контрольных диапазонов в данный возрастной период [8, 23, 24].
Цель настоящего исследования: повысить качество диагностики ВУИ и оптимизировать тактику ведения новорожденных высокого инфекционного риска в раннем неонатальном периоде путем применения алгоритма обследования с использованием доступных и информативных тестов.
Материалы и методы
Было проведено обследование 240 доношенных и 10 недоношенных новорожденных, родившихся у матерей с инфекционно-воспалительными заболеваниями урогенитального тракта. Среди беременных преимущественно вирусные инфекции отмечались в 35 (14%) наблюдениях, бактериальные - в 30 (12%), а в 185 (74%) -встречались смешанные вирусно-бактериальные инфекции. Урогенитальный хламидиоз диагностирован у 85 (34%) пациенток, уреаплазма выявлялась в 75 (30%) наблюдениях, микоплазмы - в 30 (12%) случаях. ВПГ-2 инфекция обнаружена у 135 (54%) матерей, цитомега-ловирусная инфекция (ЦМВИ) - у 180 (72%). Хронические заболевания почек и мочевыводящих путей имели 45 (18%) женщин, у каждой пятой пациентки (20%) к моменту родоразрешения сохранялись проявления кольпита, у 40 (16%) - цервицита.
Течение настоящей беременности осложнилось присоединением преэклампсии у 50 (20%) матерей, с такой же частотой была диагностирована анемия беременных, угроза прерывания беременности имела место примерно у половины (46%) пациенток. По результатам комплексной оценки нарушения функции фетоплацентарного комплекса были диагностированы у 100 (40%) беременных, многоводие - в 30 (12%) наблюдениях.
Роды были самопроизвольными в 160 (64%) наблюдениях, путем операции кесарева сечения родоразре-шение было выполнено 86 (34,4%) беременным, у 4(1,6%) рожениц была применена вакуум-экстракция плода. Продолжительность родов колебалась от 2,75 до 18 ч, длительность безводного промежутка - от 2,5 до 24 ч. Роды осложнились слабостью родовой деятельности в 40 (16%) наблюдениях, дородовое излитие около-
плодных вод отмечалось у 30 (12%) рожениц. У 20 (8%) пациенток в родах развился хориоамнионит.
Для выявления клинико-лабораторных корреляций новорожденные были разделены на 6 групп в зависимости от основного клинического диагноза.
1-ю группу составили 45 (18%) новорожденных с генерализованными и тяжелыми локализованными формами ВУИ, которые включали сепсис, менингоэнцефа-лит, пневмонию, гастроэнтероколит.
2-я группа состояла из 30 (12%) новорожденных с локализованными инфекционными процессами средней степени тяжести, а именно: везикулопустулез, конъюнктивит, ринит, омфалит, вульвовагинит, локальные формы кандидоза.
3-я группа объединила 25 (10%) новорожденных с выявленными при ультразвуковых исследованиях морфологическими изменениями в центральной нервной системе (ЦНС) и внутренних органах, что позволило предположить перенесенную ВУИ.
4-ю группу составили 30 (12%) новорожденных с ги-поксическими повреждениями ЦНС разной степени тяжести.
5-я группа включала 28 (11,2%) новорожденных с задержкой внутриутробного развития (ЗВУР).
6-я группа состояла из 92 (36,8%) клинически здоровых новорожденных.
Наряду со стандартным клинико-лабораторным обследованием, которое проводилось всем новорожденным, 158 детям было проведено ультразвуковое исследование вилочковой железы (ВЖ) - ультразвуковая ти-мометрия, у 90 новорожденных в рамках иммунологического обследования было проведено исследование ин-терферонового статуса (ИФС) и концентрации цитоки-нов (ФНО-а, ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, а- и у-ИФН) в сыворотке крови, спонтанных и стимулированных культурах клеток крови, у 50 детей определялся уровень ПКТ экспресс-методом.
Частота выделения представителей аэробной микрофлоры в мазках со слизистой носоглотки, из ануса у новорожденных высокого инфекционного риска в момент рождения составила от 40,2% (у клинически здоровых новорожденных) до 62,2% (у детей с тяжелыми формами ВУИ). Для тяжелых форм ВУИ была характерна высокая частота контаминации новорожденных представителями инфекций, передающихся половым путем: ВПГ-2 - 43,6%, ЦМВИ - 58,2%, хламидии -41,8%, уреаплазма - 52,7%, микоплазма - 32,7%.
Результаты исследования
На основании оценки клинических данных и показателей иммунитета с использованием перцентильной шкалы основных иммунологических показателей у обследованных новорожденных были выделены следующие варианты иммунного реагирования и состояния ци-токинового статуса в раннем неонатальном периоде.
У новорожденных с тяжелыми формами ВУИ (обследовано 14 детей) были выявлены два варианта иммунного реагирования. Первый вариант (8 новорожденных) характеризовался активацией клеток врожденного и адаптивного иммунитета в сочетании с их незрелостью, повышением ИФН в сыворотке крови и способности лейкоцитов к продукции а-ИФН при низкой способности лимфоцитов к выработке у-ИФН. У 2-х новорожденных, умерших в раннем неонатальном периоде, выявлялось наиболее выраженное угнетение как а-(4-8 МЕ/мл), так и у-(<4 МЕ/мл) интерфероногенеза при низкой концентрации ИФН в сыворотке крови (<4 МЕ/мл), что позволяет рассматривать эти показатели в качестве
прогноза неблагоприятного исхода (р=0,03) у новорожденных с ВУИ. В сыворотке крови у всех детей определялся ИЛ-8 (в 75% наблюдений его количество превышало 50 пкг/мл), имело место снижение продукции ИЛ-6, ИЛ-1, ФНО-а.
Второй вариант (6 новорожденных) отличался отсутствием активации иммунитета и повышения ИФН, дефицитом фагоцитов, зрелых Т- и В-лимфоцитов. Способность лейкоцитов к продукции а-ИФН была в пределах нормативных значений, а способность лимфоцитов к продукции у-ИФН - несколько выше, чем при первом варианте. ИЛ-8 в сыворотке крови определялся в 30% наблюдений (уровень не превышал 50 пкг/мл). Данный вариант иммунного реагирования был характерен для таких форм течения заболевания, которые возникали в результате аспирации и заглатывания околоплодных вод с развитием аспирационных пневмоний, что больше свидетельствовало об интранатальном инфицировании и подтверждалось высокой частотой осложнений в родах, более поздними сроками манифестации ВУИ в раннем неонатальном периоде, отсутствием генерализованных форм инфекции и летальных исходов.
Отличительными чертами иммунного ответа у новорожденных с локализованными инфекционно-воспали-тельными заболеваниями средней степени тяжести (обследовано 10 новорожденных) являлись: отсутствие изменений количества и зрелости клеток врожденного и адаптивного иммунитета с преобладанием провоспали-тельного иммунного ответа в виде повышения уровня 1дМ и сывороточного ИФН, высокой способности к продукции а-ИФН, преобладанием продукции у-ИФН над продукцией ИЛ-4 (<10 пкг/мл) без иммунологических критериев системной инфекции (отсутствие ИЛ-8 и про-воспалительных цитокинов в сыворотке крови, неизмененная продукция лимфокинов и монокинов).
Состояние иммунитета у новорожденных с выявленными при ультразвуковых исследованиях морфологическими изменениями в ЦНС и внутренних органах (обследовано 8 детей) характеризовало законченный к моменту рождения инфекционный процесс. Иммунный ответ характеризовался повышением числа зрелых имму-нокомпетентных клеток и уровня 1дО, показатели ИФС не отличались от нормативных значений. Была снижена индуцированная продукция ИЛ-1 и ФНО-а, повышена продукция а-ИФН и ИЛ-4, преобладала противовоспалительная направленность иммунного ответа.
Результаты микробиологического исследования у матерей (герпес-вирусная этиология инфекции в 90,9% случаев) и их новорожденных (выделение ВПГ-2 в 43,6%, ЦМВИ - в 58,2%) в сочетании с нарушениями в цитокиновом статусе в виде усиления продукции а-ИФН, снижения продукции ИЛ-1 и ФНО-а подтверждали вирусную этиологию заболевания. Изменения со стороны ЦНС и внутренних органов, выявленные при рождении, в сочетании с показателями иммунитета позволяют предположить раннее внутриутробное инфицирование, преимущественно вирусной этиологии, с благоприятным исходом для жизнеспособности плода на фоне проводимой этиотропной терапии в антенатальном периоде, но с формированием стойких структурных изменений, преимущественно ЦНС, к моменту рождения.
У новорожденных с гипоксическими повреждениями ЦНС (обследовано 15 новорожденных) гипоксия являлась дополнительным повреждающим фактором, способствующим увеличению антигенной нагрузки, и в условиях низкого риска внутриутробного инфицирования (у 8 детей) приводила к активации клеток врожден-
ного иммунитета без изменений в цитокиновом статусе. При сочетании гипоксии с микробной контаминацией у 7 новорожденных иммунный ответ характеризовался повышенным потреблением макрофагов из кровеносного русла, увеличением уровня 1дМ в сыворотке крови, усилением продукции провоспалительных цитокинов, снижением способности лимфоцитов к продукции у-ИФН, что не исключало манифестацию ВУИ, клинические проявления которой на фоне симптомов повреждения ЦНС и проводимой противоинфекционной терапии могли быть стертыми.
Иммунный ответ у новорожденных со ЗВУР (обследовано 14 детей) характеризовался снижением количества клеток врожденного и адаптивного иммунитета (CD3+, CD20+, CD8+, CD16+, моноцитов). Были установлены два типа ИФС. Отличительными особенностями первого типа ИФС были отсутствие ИФН в сыворотке крови и высокая способность лимфоцитов к продукции у-ИФ. Второй тип ИФС был сопряжен с повышением сывороточного ИФН (16 МЕ/мл) и низкой способностью лимфоцитов к продукции у-ИФН (<4 МЕ/мл). Имелась статистически значимая зависимость (р=0,004) между вторым типом ИФС и частотой постнатальной инфекции у новорожденных со ЗВУР, которая составила 64,3% (заболели 9 новорожденных).
Показатели иммунитета и цитокинового статуса у клинически здоровых новорожденных без микробной контаминации (обследовано 17 детей) не отличались от нормативных значений. Микробная контаминация у клинически здоровых новорожденных (12 детей) иммуно-логически характеризовалась увеличением числа зрелых клеток адаптивного иммунитета (CD3+, CD20+, CD4+, CD8+, CD16+), уровня 1дО, уменьшением числа клеток врожденного иммунитета (нейтрофилов и моноцитов), повышением способности лейкоцитов к продукции а-ИФН (128 МЕ/мл и 545,3 пкг/мл), ИЛ-1 (329,6 пкг/мл) и ФНО-а (748,6 пкг/мл) в 1,5-2 раза. Продукция у-ИФН, ИЛ-6 и ИЛ-4 не отличалась от нормативных значений, сохранялся баланс продукции у-ИФН (22,5 пкг/мл) и ИЛ-4 (23,5 пкг/мл). Изменения показателей иммунитета у здоровых новорожденных от матерей с урогенитальными инфекциями зависели от наличия
микробной контаминации, которая характеризовалась повышением числа зрелых иммунокомпетентных клеток, способных к выработке про- и противовоспалительных цитокинов, поддержание баланса которых препятствовало манифестации ВУИ.
Иммунологическими критериями ранней диагностики тяжелых форм ВУИ у новорожденных являются: повышение уровня 1дМ более 1,0 г/л и снижение уровня 1дО менее 6,6 г/л в сыворотке крови; повышение в периферическом кровотоке ранних предшественников Т- и В-лимфоцитов - более 70,4%, незрелых Т-лимфоцитов - более 19,4%; повышение ИФН в сыворотке крови до 16 МЕ/мл и более в сочетании со снижением способности лимфоцитов к продукции у-ИФН менее 4 МЕ/мл или менее 3,0 пкг/мл; увеличение содержания ИЛ-8 в сыворотке крови более 50 пкг/мл и (или) снижение продукции у-ИФН менее 3,0 пкг/мл в сочетании с низкой продукцией ИЛ-4 (менее 10 пкг/мл).
Поскольку основным органом иммунной системы у плода и новорожденного является тимус, были сопоставлены морфологические особенности ВЖ и иммунного статуса новорожденных группы высокого инфекционного риска для выявления информативных и доступных критериев ранней диагностики ВУИ и иммунной недостаточности. Проведенные исследования показали четкую взаимосвязь между объемом ВЖ, наличием и тяжестью клинических проявлений ВУИ и дефектами иммунитета у новорожденных в раннем неонатальном периоде (табл. 1).
Выявленная эхоскопически тимомегалия с объемом ВЖ более 2,5 мл/кг была статистически значимой для тяжелых форм ВУИ с нарушениями иммунного ответа в виде незрелости и активации клеток врожденного и адаптивного иммунитета с глубоким нарушением их эффекторных функций. Уменьшение объема ВЖ менее 1 мл/кг коррелировало с дисфункцией иммунитета в виде дефицита зрелых иммунокомпетентных клеток и недостаточности провоспалительного иммунного ответа, что клинически характеризовалось затяжным течением ВУИ и высокой частотой постнатальных ин-фекционно-воспалительных заболеваний у новорожденных.
Таблица 1. Объем ВЖ у новорожденных в зависимости от клинического состояния
в раннем неонатальном периоде
Группы новорожденных (п) Объем вилочковой железы
Менее 1 мл/кг, п (%) От 1 до 2,5 мл/кг, п (%) Более 2,5 мл/кг, п (%)
1-я группа, вариант 1 (15) 3 (20) 3 (20) 9 (60)
1-я группа, вариант 2 (14) 1 (7) 9 (64,5) 4 (28,5)
2-я группа (19) 1 (5) 15 (80) 3 (15)
3-я группа (16) 2 (12,5) 14 (87,5) -
4-я группа (19) 2 (10,5) 17 (89,5) -
5-я группа (18) 5 (28) 13 (72) -
6-я группа (57) - 57 (100) -
Таблица 2. Уровень ПКТ у новорожденных высокого инфекционного риска
в раннем неонатальном периоде
ПКТ на 1-е сут ПКТ на 2-е сут ПКТ на 3-е сут
Параметр (тест проведен впервые) (тест проведен впервые) (тест проведен впервые)
Больше 2 нг/мл Общее число исследований Больше 2 нг/мл Общее число исследований Больше 2 нг/мл Общее число исследований
1-я группа (п=21) 10 (67%) 15 2 (67%) 3 2 (67%) 3
2-я группа (п=6) 3 (60%) 5 0 1 0 0
3-я группа (п=13) 0 7 0 4 0 2
4-я группа (п=10) 0 6 0 4 0 0
Учитывая диагностическую значимость ПКТ при системных инфекциях, в т. ч. и у новорожденных, а также большой разброс контрольных диапазонов этого показателя в первые 2 сут жизни, было проведено исследование уровня ПКТ экспресс-методом у 40 доношенных и 10 недоношенных новорожденных.
Новорожденные были разделены на 4 группы с учетом характера патологии.
1-я группа состояла из 21 новорожденного с внутриутробной пневмонией.
2-я группа включала 6 новорожденных, у которых по сумме данных анамнеза, клинических симптомов и результатов лабораторного обследования была диагностирована ВУИ без четко установленного очага.
3-я группа объединила 13 новорожденных с патологией неинфекционного характера.
В 4-ю группу были включены 10 клинически здоровых новорожденных.
Исследование ПКТ у новорожденных проводилось на 1-е, 2-е и 3-и сут жизни (табл. 2).
Повышение уровня ПКТ более 2 нг/мл в первые сутки жизни было статистически значимым для тяжелых форм ВУИ, сопровождающихся системной воспалительной реакцией и симптомами органной недостаточности. В то же время у новорожденных без симптомов инфекционно-воспалительных заболеваний не отмечалось повышения уровня ПКТ в сыворотке крови в первые 48 ч жизни. Полученные результаты исследования позволяют использовать повышение уровня ПКТ более 2 нг/мл в качестве раннего диагностического критерия тяжелых форм ВУИ у новорожденных, начиная с первых суток жизни.
Заключение
Таким образом, в нашем исследовании показана четкая взаимосвязь между наличием и тяжестью клинических проявлений ВУИ, дефектами иммунитета, состоянием ВЖ и результатами полуколичественного экспресс-теста на определение ПКТ. Предложенные иммунологические показатели нарушений цитокинового статуса и ультразвуковые критерии патологии ВЖ, повышение ПКТ более 2 нг/мл с первых суток жизни могут быть использованы в качестве критериев ранней диагностики и тяжести ВУИ.
Литература
1. Сидорова И.С., Макаров И.О., Матвиенко Н.А. Внутриутробные инфекции. М.: МИА, 2006. 176 с.
2. Фризе К., Кахель В. Инфекционные заболевания беременных и новорожденных. Пер. с нем. М.: Медицина, 2003. 424 с.
3. Неонатология - национальное руководство / Под ред. Н.Н. Володина. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. 749 с.
4. Ахматова Н.К., Киселевский М.В. Врожденный иммунитет: противоопухолевый и противо-инфекционный. М.: Практическая медицина, 2008.256 с.
5. Akira S., Uematsu S., Takeuchi O. Pathogen recognition and innate immunity // Cell. 2006. Vol. 124 (4). P. 783-801.
6. Липагина А.А. Диагностическое и прогностическое значение исследования белков острой фазы и иммуноглобулинов у новорожденных детей из группы риска по развитию гнойно-септических заболеваний: автореф. дис. на соиск. учен. степ. к.м.н. М., 2000.19 с.
7. Hofer N., Zacharias E, M ller W., Resch B. An update on the use of C-reactive protein in early-onset neonatal sepsis: current insights and new tasks // Neonatol. 2012. Vol. 102(1). P. 25-36.
8. Бирюкова Т.В., Солдатова И.Г., Милева О.И. и др. Диагностическая информативность уровня прокальцитонина в сыворотке крови новорожденных при раннем неонатальном сепсисе // Вопросы практической педиатрии. 2007. № 3. С. 5-11.
9. Casado-Flores J., Blanco-Quir s A., Asensio J. et al. Serum procalcitonin in children with suspected sepsis: a comparison with C-reactive protein and neutrophil count // Pediatr. Crit. Care Med. 2003. P.190-195.
10. Дегтярева М.В. Современные возможности иммунокорригирующей терапии тяжелых ин-фекционно-воспалительных и иммунопатологических состояний у новорожденных // Иммуно-коррекция в педиатрии / Под ред. М.П. Костинова, М.: Медицина для всех, 2001. С.182-194.
11. Ганковская Л.В., Макаров О.В., Ковальчук Л.В. и др. Система цитокинов амниотической жидкости при внутриутробной инфекции // Новые технологии в перинатологии: материалы ежегодного конгресса специалистов перинатальной медицины. М., 2008. С. 19.
12. Shozushima T., Takahashi G., Matsumoto N. et al. Usefulness of presepsin (sCD14-ST) measurements as a marker for the diagnosis and severity of sepsis that satisfied diag-nostic criteria of systemic inflammatory response syndrome// J. Infect. Chemother. 2011. Vol.17(6). P. 764-769.
13. Adly A.A., Ismail E.A, Andrawes N.G., B-Saadany M.A. Circulating soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (sTREM-1) as diagnostic and prognostic marker in neonatal sepsis // Cytokine. 2014. Vol. 65(2). P.184-191.
14. Fanos V., Caboni P., Corsello G. et al. Urinary (1)H-NMR and GC-MS metabolomics predicts early and late onset neonatal sepsis// Early Hum. Dev. 2014. Vol. 90 (Suppl. 1). S78-S83.
15. Дегтярева М.В. Современные возможности иммунокорригирующей терапии тяжелых ин-фекционно-воспалительных и иммунопатологических состояний у новорожденных // Иммуно-коррекция в педиатрии / Под ред. М.П. Костинова. М.: Медицина для всех, 2001. С.182-194.
16. Hoebe K., Janssen E, Beutler B. The interface between innate and adaptive immunity // Nat. Immunol. 2004. Vol. 5. P. 971-974.
17. Ng P.C., Li K., Wong R.P. Proinflammatory and anti-inflammatory cytokine responses in preterm infants with systemic infections //Arch. Dis. Child. Fetal. Neonatal. Ed. 2003. P. 209-213.
18. Володин Н.Н., Дегтярева М.В., Симбирцев А.С. и др. Роль про- и противовоспалительных цитокинов в иммунной адаптации новорожденных детей // Intern. J. Immunorehabilit. 2000. Vol.2, № 1. P.175-185.
19. Santana C., Guindeo M.C., Gonzakz G. Cord blood levels of cytokines as predictors of early neonatal sepsis // Acta Paediatr. 2001. Vol. 90. P.1176-1181.
20. Witt A, Berger A., Gruber C.J., Petricevic L. et al. IL-8 concentrations in maternal serum, amniotic fluid and cord blood in relation to different within the amniotic cavity// J. Perinatal. Med. 2005. Vol. 33 (1). P. 22-26.
21. Mehr S., Doyle L.W. Cytokines as markers of bacterial sepsis in newborn infants: a review// Pe-diatr. Infect. Dis. J. 2000. Vol. 19. P. 879-887.
22. Pavcnik-Arnol M., Hojker S., Derganc M. Lipopolysaccharide-binding protein in critically ill neo-nates and children with suspected infection: comparison with procalcitonin, interleukin-6, and C-re-active protein // Intens. Care Med. 2004. Vol. 30(7). P.1454-1460.
23. Черняховский О.Б., Абрамова И.В., Полянчикова О.Л. Внутриутробные инфекции у новорожденных, факторы риска // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2009. № 1. С. 80-88.
24. McGuire W, Clerihew L., Fowlie P.W. Infection in the preterm infant // BMJ. 2004. Vol. 2. P. 329-341.
