CC BY
19
Диагностика внутриканального микробного пейзажа при помощи метода полимеразной цепной реакции
Манак Т.Н.
Белорусский государственный медицинский университет, Минск
Manak TN.
Belarusian State Medical University, Minsk
Diagnostics of an intracanal microbiotic scape using a polymerase chain reaction method
Резюме. Использование метода искусственного многократного копирования ДНК - полимеразной цепной реакции - позволило выявить маркеры пяти наиболее устойчивых патогенных микроорганизмов: P. intermedia, B. forsythus, T. dentico1а, A. аctinomycetemcomitans и P. gingivalis u их высокую распространенность в содержимом каналов зубов при заболеваниях пульпы и апикального периодонта - 93,33% от всех случаев. Статистически значимой зависимости между нозологической формой заболевания и наличием/отсутствием патогенных возбудителей установлено не было. У пациентов, нуждающихся в первичном лечении, чаще выявлялась поливидовая микросреда, а у нуждающихся в повторном - моновидовая, что позволяет говорить о неэффективном воздействии произведенной ранее терапии на один из патогенов. Выявлены статистически значимые различия микробного пейзажа после механической обработки ручными и ротационными инструментами: при ручной обработке от 60 до 88,9% выявленных микроорганизмов сохраняются в канале, тогда как при машинной обработке эти цифры не превышают 20%.
Ключевые слова: молекулярно-генетическая диагностика, полимеразная цепная реакция, эндодонтическая инфекция, микробный пейзаж, пульпит, апикальный периодонтит, эндодонтическое лечение.
Медицинские новости. — 2017. — №3. — С. 69—72. Summary. Usage of artificial repeated copying of DNA - polymerase chain reaction - allowed to identify the markers of the five most resistant pathogens: P. intermedia, B. forsythus, T. denticola, A. actinomycetemcomitans and P. gingivalis and their high prevalence in the root canals with diagnosted pulpitis and periodontitis - 93.33% of cases. Statistically significant relationship between the nosological form of the disease and the presence/ absence of pathogens in the test biological material has not been established. For the patients in need of primary endodontic treatment a multispecies microenvironment was more frequently detected, and in need of secondary treatment - monospecific. Suggesting that the impact of ineffective therapy produced previously towards one of the pathogens. Statistically significant differences were found in microbial scape after hand and rotary root canal instrumentation: the manual instrumentation leaves from 60 to 88.9% of identified microorganisms retained in the channel, where as when rotary machining used, these numbers do not exceed 20%.
Keywords: molecular-genetic diagnosis, polymerase chain reaction, endodontic infections, microbial scape, pulpitis, apical periodontitis, endodontic treatment.
Meditsinskie novosti. - 2017. - N3. - P. 69-72.
Своевременная точная диагностика ассоциативных форм возбудителей является одним из принципиальных этапов на пути к эффективному лечению любых инфекционных заболеваний. Традиционные бактериологические методы диагностики позволяют выявлять наличие жизнеспособных бактериальных клеток, точно идентифицировать микробный состав биологической пробы, а также определять чувствительность возбудителей к лекарственным препаратам [1]. Однако применение метода осложняется необходимостью длительного периода культивирования, трудоемкостью процесса. Также необходимо учитывать, что некоторые микроорганизмы являются труднокультивируемыми [11]. Методы молекулярно-генетического анализа, напротив, отличаются быстротой и чувствительностью (позволяют идентифицировать единичные молекулы ДНК в течение нескольких часов), упрощенной транспортировкой материалов в лабораторию (присутствие живых микробов не
обязательно) [6]. Тем самым снижаются и материальные, и временные затраты, а своевременность - один из решающих факторов, обусловливающих успешный исход лечения. Это способствует многократному повышению эффективности клинической диагностики патогенных возбудителей в любой области медицины [7, 8]. Стоматология, в частности эндо-донтия, - не исключение, ведь сегодня микробная этиология воспалительных процессов в пульпе и апикальном перио-донте является убедительно доказанной [3, 5].
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является методическим подходом, с помощью которого можно доказать присутствие в биологическом образце некуль-тивируемых форм возбудителя. В основе метода лежит комплементарное достраивание участка геномной ДНК или РНК возбудителя, осуществляемое in Шо с помощью фермента термостабильной ДНК-полимеразы [6]. Специфичность метода определяется уникальностью
генетического материала выявляемых инфекционных агентов, к которому подобраны олигонуклеотидные праймеры, участвующие в процессе амплификации [10]. К тому же обнаружение ДНК/РНК возбудителей в биологическом материале молекулярно-биологическими методами позволяет проводить скрининговые исследования с выявлением нескольких возбудителей в одной пробе [9].
Известные молекулярно-генетиче-ские методики обладают рядом недостатков: их невозможно стандартизировать, они требуют дополнительных трудоемких этапов работы, не дают реальной возможности контролировать процесс амплификации, им свойственны сложности при проведении контроля качества исследований и интерпретации полученных результатов [2]. Но, несмотря на многочисленные трудности, молекулярно-генетическая лабораторная диагностика на данный момент достигла достаточно высокого уровня. Вместе с тем проблема полноценного обследования пациентов оста-
ется весьма актуальной, так как нередко вследствие неадекватно подобранной диагностической тактики наблюдается неэффективность эндодонтических мероприятий.
Цель исследования - сравнение микробного пейзажа корневых каналов (КК) в зависимости от клинического диагноза, вида лечения (первичное либо повторное) и способа механической обработки с использованием молекулярно-генетического метода ПЦР.
Материалы и методы
Исследование проводилось в три этапа. На первом этапе с целью сравнения микробного пейзажа КК в зависимости от клинического диагноза исследованные образцы биологического материала у 120 пациентов разделены на 4 равновеликие группы: острый пульпит, хронический пульпит, острый периодонтит и хронический периодонтит.
На втором этапе проводилось сравнение микробного пейзажа у 40 пациентов, нуждающихся в первичном (21 человек) и повторном (19 лиц) эндодонтическом лечении (ЭЛ).
На третьем этапе исследования для определения влияния на микробный пейзаж КК способа механической обработки зубы 60 пациентов были разделены на две группы (по 30 человек): в первой группе инструментальная обработка проводилась при помощи ручных инструментов (К-римеры, К-, Н-файлы), во второй - с использованием ротационного машинного инструмента (Protaper Universal (PTU)), методиками «StepBack» и «CrownDown» соответственно.
Забор и анализ материала на всех этапах проводился аналогично (данная методика, предложенная автором, в последствие была утверждена в качестве Инструкции Министерства здравоохранения Республики Беларусь).
Для забора материала готовились бумажные штифты, которые автоклави-ровались при температуре 134°С и давлении 2,2 атм. и помещались в пробирки с транспортной средой, которые до исследования хранились в холодильнике. Взятие материала исследования проводилось следующим образом: пациент полоскал рот 10 мл 0,05% раствора хлоргексидина биглюконата в течение 30-60 секунд, зуб очищался от налета, создавался прямолинейный доступ, зуб изолировался от слюны. Забор содержимого КК осуществлялся с помощью трех стерильных бумажных штифтов размера по ISO от 15 до 30 (размер бумажного штифта зависит от первона-
чального диаметра КК), каждый штифт погружался в канал на 10 секунд. При извлечении штифта не допускался его контакт со слюной, гноем или слизистой оболочкой рта. При повторном ЭЛ КК предварительно распломбировывались без применения антисептиков и сольвентов. Бумажные штифты, извлеченные из КК, помещали в пробирки с 100 мкл транспортной средой (изотонический раствор NaCl) и сывороткой крупного рогатого скота и в течение двух часов доставляли в лабораторию [4].
Лабораторные исследования проводились на базе группы ПЦР-диагностики НИЛ БелМАПО, используя диагностические наборы ООО НПФ «1ентех», производства Российской Федерации (чувствительность набора не менее 104 копий/мл).
Также использовалось оборудование:
1) ПЦР-бокс с бактерицидной лампой UVC/T-M-AR (Латвия);
2) микроцентрифуга-вортекс «СотЫ-spin FVL 2400№ (Латвия);
3) микротермостат TDB 120 (Латвия);
4) высокоскоростная микроцентрифуга «MPW 55а» (Польша);
5) амплификатор многоканальный «Терцик» (РФ);
6) трансиллюминатор Н-2 (РФ).
Результаты и обсуждение
1-й этап. Сравнение микробного пейзажа в зависимости от диагноза
В ходе исследования проводилось выявление в биологическом материале пациентов с заболеваниями пульпы и апи-
кального периодонта ДНК/РНК бактериои-дов (Prevotella intermedia, Porhyromonas gingivalis, Bacteroides forsythus), спирохет (Treponema denticola), факультативных грамотрицательных палочек (Actinobacillus actinomycetemcomitans), способных быть этиологическими агентами воспалительного процесса. В результате исследований в клиническом материале пациентов, взятом до проведения ЭЛ, было установлено наличие патогенов в 112 пробах (93,3% (87,4; 96,6)) обследуемых групп пациентов.
Молекулярно-генетические исследования показали, что в КК зубов выявляются ДНК-маркеры от одного до трех наиболее вирулентных видов бактерий. Характеристика микробного состава патогенной микрофлоры в биологическом материале пациентов с острым и хроническим пульпитом, острым и хроническим периодонтитом представлена в табл. 1.
В общей массе проб наиболее часто выявлялся такой вид бактерий, как P. gingivalis: маркеры данного микроорганизма выявлялись в 56 (46,7% (38,0; 55,6)) образцах; ДНК таких видов бактерий, как P. intermedia, B. forsythus, Т. denticola и A. actinomycetemcomitans - в 35 (29,2% (21,8; 37,8)), 27 (22,5% (15,9; 30,7)), 31 (25,8% (18,2; 34,3)) и 33 (27,5% (20,3; 36,1)) соответственно.
В группе пациентов с острым пульпитом возбудитель P. gingivalis выявлялся чаще всего - в 19 (63,3% (45,5; 78,1)) из
ДЯИ Характеристика микробного состава КК зубов в биологическом материале обследуемых групп пациентов в зависимости от особенностей клинического течения патологии
Возбудитель Пульпит Периодонтит
острый хронический острый хронический
n % (95% ДИ) n % (95% ДИ) n % (95% ДИ) n % (95% ДИ)
P. intermedia 9 30,0 (16,7; 47,9) 10 33,3 (19,2; 51,2) 9 30,0 (16,7; 47,9) 7 23,3 (11,8; 40,9)
B. forsythus 6 20,0 (9,5; 37,3) 6 20,0 (9,5; 37,3) 7 23,3 (11,8; 40,9) 8 26,7 (14,2; 44,4)
T. denticola 11 36,7 (21,9; 54,5) 9 30,0 (16,7; 47,9) 4 13,3 (5,3; 29,7) 7 23,3 (11,8; 40,9)
A. actinomycetemcomitans 13 43,3 (27,4; 60,8) 6 20,0 (9,5; 37,3) 5 16,7 (7,3; 33,6) 9 30,0 (16,7; 47,9)
P. gingivalis 19 63,3 (45,5; 78,1) 12 40,0 (24,6; 57,7) 9 30,0 (16,7; 47,9) 16 53,3 (36,1; 69,8)
ДЯИ Встречаемость патогенов у пациентов, нуждающихся в первичном и повторном ЭЛ
Возбудитель Лечение первичное (n=21) Лечение повторное (n=19)
n % (95% ДИ) n % (95% ДИ)
Р. intermedia 5 23,8 (10,6; 45,1) 1 5,3 (0,9; 24,6)
B. forsythus 3 14,3 (4,9; 34,6) 4 21,1 (8,5; 43,3)
T. denticola 6 28,6 (13,8; 50,0) 3 15,8 (5,5; 37,6)
A. actinomy-cetemcomitans 7 33,3 (17,2; 54,6) 3 15,8 (5,5; 37,6)
P. gingivalis 10 47,6 (28,3; 67,3) 6 31,6 (15,4; 54,0)
И1ЯЯ Частота выявления маркеров патогенных микроорганизмов до и после различных видов механической обработки КК зубов
Возбудитель Ручная обработка (n=30) Машинная обработка (n=30)
до после до после
n % (95% ДИ) n % (95% ДИ) n % (95% ДИ) n % (95% ДИ)
P. intermedia 8 26,7 (14,2; 44,4) 6 20,0 (9,5; 37,3) 9 30 (16,7; 47,9) 1 3,3 (0,6; 16,7)
B. forsythus 6 20,0 (9,5; 37,3) 4 13,3 (5,3; 29,7) 6 20,0 (9,5; 37,3) 0 0 (0; 11,3)
T. denticola 10 33,3 (19,2; 51,2) 6 20,0 (9,5; 37,3) 10 33,3 (19,2; 51,2) 1 3,3 (0,6; 16,7)
A. actinomy-cetemcomitans 9 30,0 (16,7; 47,9) 8 26,7 (14,2; 44,4) 6 20,0 (9,5; 37,3) 1 3,3 (0,6; 16,7)
P. gingivalis 10 33,3 (19,2; 51,2) 7 23,3 (11,8; 40,9) 16 53,3 (36,1; 69,8) 2 6,7 (1,8; 21,3)
30 проб, что позволяет расценивать данный патоген в качестве одного из основных возбудителей острых форм пульпита. Реже всего выявлялся В. forsythus - 6 (20,0% (9,5; 37,3)) проб. Следует отметить, что в данной группе исследования в 3 образцах (10% (3,5; 25,6)) маркеров ДНК искомых микроорганизмов выявлено не было, то есть возбудителем воспалительных процессов в пульпе в данных случаях являлись другие микроорганизмы. Наиболее часто встречалось сочетание двух патогенов - 13 (43,3% (27,4; 60,8)) образцов; реже трех - 9 (30% (16,7; 47,9)) образцов; случаев, когда возбудителем острого пульпита становился один из исследуемых видов микроорганизмов, - 5 (16,7% (7,3; 33,6))
образцов. Также примечателен тот факт, что у пациентов с острым пульпитом часто обнаруживалось сочетание таких патогенов, как А. act№mycetemcomitans и Р. дтдт^ - такое сочетание обнаружено в 12 (40% (24,6; 57,7)) пробах, взятых из КК зубов.
Наиболее часто, как и в случаях острого пульпита, при хроническом пульпите выявлялись маркеры Р. gingivalis - 12 проб (40% (24,6; 57,7)); реже остальных - В. forsythus и А. act№mycetemcomitans - по 6 (20% (9,5; 37,3)) проб. В данной группе исследования было обнаружено 2 (6,7% (1,8; 21,3)) «чистых» образца, в которых ни один из искомых маркеров не был выявлен. Отличалась ситуация
с количеством идентифицированных патогенов в образце по сравнению с образцами, взятыми из КК зубов с острым пульпитом. Так, в группе хронических пульпитов в 13 (43,3% (27,4; 60,8)) случаях воспаление было вызвано одним видом микроорганизмов, а в 15 (50% (33,1; 66,8)) - двумя. Образцов с тремя и более маркерами в данной группе выявлено не было. То есть можно предположить, что хронические формы пульпита развиваются на фоне проникновения и постепенного размножения одного-двух видов патогенов.
В группе пациентов с острым периодонтитом чаще всего выявлялись маркеры P. gingivalis и P. intermedia - по 9 (30% (16,7; 47,9)) проб; реже остальных -Т. denticola -4 (13,3% (5,3; 29,7)) образца. В данной группе исследования в 3 (10% (3,5; 25,6)) пробах маркеров искомых патогенов выявлено не было, то есть возбудителем воспаления в этих случаях являлись микроорганизмы, отличные от данных пяти видов. Наиболее часто, в 20 (66,7% (48,8; 80,8)) образцах, присутствовал один из видов патогенов. В 7 (23,3% (11,8; 40,9)) пробах было обнаружено сочетание двух маркеров. Сочетание трех и более маркеров в данной группе исследования обнаружено не было.
В биологическом материале, взятом из КК зубов с диагнозом хронический периодонтит, как и в остальных, наиболее часто - в 16 (53,3% (36,1; 69,8)) образцах - выявлялись маркеры P. gingivalis. Маркеры остальных исследуемых патогенов встречались от 23,3 (11,8; 40,9) до 30,0% (16,7; 47,9) случаев. Следует также отметить, что в данной группе исследования «чистых» образцов выявлено не было, то есть патогены встречались во всех 100% (88,6; 100) образцов. Чаще всего при хроническом периодонтите выявлялись маркеры одного - 15 (50% (33,1; 66,8)) или двух - 13 (43,3% (27,4; 60,8)), из исследуемых патогенов. В 2 (6,7% (1,8; 21,3)) пробах выявлены маркеры трех патогенов.
Не установлено статистически значимой зависимости между нозологической формой заболевания и наличием/ отсутствием патогенных возбудителей в исследуемом биологическом материале (по критерию х2 Пирсона р>0,05).
2-й этап. Сравнение микробного пейзажа в зависимости от вида лечения
Следующим этапом исследования было сравнение результатов ПЦР-диагностики у пациентов, нуждающихся в первичном и повторном ЭЛ (табл. 2).
У пациентов, нуждающихся в первичном ЭЛ, по данным проведенного исследования состава патогенов, наиболее часто выявлялись ДНК P. gingivalis - в 47,6% (28,3; 67,3) случаев и A. actinomycetemcomitans - в 33,3% (17,2;
54.6). Один патоген встречался в 38,1% (20,7; 59,1) случаев, два и более патогена - в 61,9% (40,9; 79,2). При первичном ЭЛ чаще других (в 28,6% (13,8; 49,9) случаев) встречалось сочетание ДНК микроорганизмов A. actinomycetemcomitans и P. gingivalis.
У пациентов, нуждающихся в повторном ЭЛ, по данным проведенного исследования состава патогенов, чаще других выявлялись ДНК P. gingivalis - в 31,6% (15,4; 54,0) случаев и B. forsythus - в 21,1% (8,5; 43,3). Один патоген встречался в 42,1% (23,1;
63.7) случаев, два и более патогена - в 31,6% (15,4; 54,0).
Примечательно то, что при повторном ЭЛ растет частота встречаемости только B. forsythus, что может говорить об устойчивости данного патогена к традиционным методам лечения и большей сложности воздействия на него по сравнению с другими видами.
3-й этап. Сравнение микробного пейзажа в зависимости от метода механической обработки КК зубов
На данном этапе исследования была проведена ПЦР-диагностика маркеров пяти наиболее устойчивых видов перио-донтальных патогенов до и после механической обработки КК зубов. Данные по частоте выявления микроорганизмов после ручной и машинной обработки отражены в табл. 3.
Результаты механической обработки КК зубов ручными инструментами нельзя назвать удовлетворительными - не выявлено статистически значимых различий в частоте выявления маркеров патогенных микроорганизмов до и после обработки.
После ручной обработки маркеры P. intermedia сохранились в 75%, B. forsythus - в 66,7%, T. denticola - в 60%, A. actinomycetemcomitans - в 88,9%, а P. gingivalis - в 70% случаев. Данные цифры говорят о крайне низкой эффективности ручной механической обработки.
В случае машинной обработки наблюдается обратная ситуация. При машинной
обработке отмечалось статистически значимое снижение частоты выявления P. intermedia, T. denticola, P. gingivalis после обработки КК зубов в сравнении с исходными данными. Использование ротационных инструментов позволило снизить P. intermedia - в 88,9%, B. forsythus - в 100%, T. denticola - в 90%, A. actinomycetemcomitans - в 83,3%, а P. gingivalis - в 87,5% случаев.
Интерес вызывают данные о наличии так называемых «чистых» образцов, то есть образцов, в которых не был выявлен ни один маркер ДНК из исследуемых патогенов после механической обработки КК зубов. При ручной обработке КК зубов доля «чистых образцов» статистически значимо меньше, чем при машинной обработке - 20,0% (9,5; 37,3) против 83,33% (62,7; 90,5) соответственно.
Очевидно, что хемомеханическая обработка с использованием машинных инструментов позволяет устранять в 4 раза больше патогенов, чем обработка ручными инструментами. При ручной обработке от 60 до 88,9% выявленных микроорганизмов сохраняются в КК, тогда как при машинной обработке эти цифры не превышают и 20%. Возвращаясь к табл. 2, следует отметить, что машинная механическая обработка эффективно действует в отношении B. forsythus (после обработки ротационным инструментом маркеров ДНК данного микроорганизма выявлено не было), который устойчив к традиционным методам лечения.
Заключение
В ходе исследования установлено, что при остром пульпите наблюдается поливидовая микробная среда с преобладанием A. actinomycetemcomitans (43,3%) и P. gingivalis (63,33%) или же их сочетанием (до 40% случаев). При хроническом пульпите чаще всего встречаются P. gingivalis (40%) и P. intermedia (33,3%). При острых формах периодонтита наиболее часто встречаются P. gingivalis и P. intermedia (по 30%), а для хронических периодонтитов характерна смешанная инфекция с преобладанием в образцах P. gingivalis.
Микробный пейзаж КК зубов пациентов, нуждающихся в первичном лечении, чаще является поливидовым, а у нуждающихся в повторном - моновидовым,
что говорит о неэффективной первичной терапии в отношении одного из патогенов (чаще всего это B. forsythus).
Машинная ротационная обработка значительно эффективнее для элиминации микроорганизмов: при ручной обработке от 60 до 88,9% выявленных микроорганизмов сохраняются в канале, тогда как при машинной обработке эти цифры не превышают 20%. При ручной обработке канала доля «чистых» образцов статистически значимо меньше, чем при машинной обработке - 20,0% против 80,0% соответственно.
Очевидно, что ПЦР-диагностика не является необходимым и целесообразным мероприятием с точки зрения каждодневной стоматологической практики, однако несет в себе определенный научный интерес. Полученные данные представляют ценность не только с точки зрения идентификации микрофлоры, но также и для выявления ее устойчивости к различным препаратам и методам лечения, что открывает новые возможности для проведения дифференцированной антибактериальной терапии.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. ЛукиныхЛ.М, Кокунова А.С., Тиунова Н.В. // Эн-додонтия Today. - 2013. - №1. - С.67-70.
2. Манак Т.Н., Юдина Н.А., Костюк С.А., Пиванко-ва Н.Н. // Современ. достижения азербайджан. медицины. - 2012. - №4. - С.141-147.
3. Митронин А.В. // Эндодонтия Ibday. - 2008. -№1. - С.26-32.
4. Обследования пациентов с заболеваниями пульпы и апикального периодонта и дифференцированный подход к выбору метода окончательной дезинфекции корневых каналов постоянных зубов пациентов: Инструкция по применению: утв. МЗ РБ 05.12.2013 №171-1113 / Н.А. Юдина, Т.Н. Манак, С.А. Костюк. - Минск, 2014. - 11 с.
5. Самохина В.И., Мацкиева О.В., Ландинова В.Д. // Эндодонтия Today. - 2015. - №4. - С.47-50.
6. Blome B, Braun A, Sobarzo V., Jepsen S. // Oral. Microbiol. Immunol. - 2008. - N23. - P.384-390.
7. Boutaga, K, van Winkelhoff A.J., Vandenbroucke-Grauls C.M., Savelkoul P.H. // J. Immunol. Med. Microbiol. - 2005. - Vol.45, N2. - P.191-199.
8. Conrads G, Gharbia S.E, Gulabivala K, et al. // J. Endod. - 1997. - N23. - P.433-438.
9. Foschi F, Cavrini F, Montebugnoli L, et al. // Oral. Microbiol. Immunol. - 2005. - N20. - P.289-295.
10. Fouad AI, Barry J,, Caimano M, et al. // Clin. Microbiol. - 2002. - N40. - P.3223-3231.
11. Siqueira J.F, Rocas I.N. // J. Endod. - 2005. -N31. - P.488-498.
Поступила 20.09.2016г.
