CC BY
38Экология. РАЗЛИВЫ НЕФТИ
УДК 502.36
Р.В. Галиулин, д.г.н., в.н.с., e-mail: galiulin-rauf@rambler.ru; Р.А. Галиулина, н.с., Институт фундаментальных проблем биологии РАН; В.Н. Башкин, д.б.н., профессор, начальник лаборатории, ООО «Газпром ВНИИГАЗ», e-mail: V_Bashkin@vniigaz.gazprom.ru
ДИАГНОСТИКА РЕМЕДИАЦИИ ПОЧВЫ, ЗАГРЯЗНЕННОЙ УГЛЕВОДОРОДАМИ
Представлены характеристики ферментов каталазы и деги-дрогеназы как основных деструкторов углеводородов, методики диагностики ремедиации почвы, загрязненной нефтью и газовым конденсатом, посредством анализа активности данных ферментов, а также примеры диагностики ремедиации почвы с использованием биокомпоста.
В условиях функционирования нефтегазового комплекса на различных его производственно-технологических стадиях (поиск и разведка, добыча и транспортировка углеводородов) не исключены аварийные ситуации, приводящие к загрязнению окружающей среды нефтью и газовым конденсатом. К числу факторов, обусловливающих аварийное загрязнение окружающей среды углеводородами, следует отнести:
• коррозионные нарушения трубопроводов за счет агрессивной среды;
• разрывы трубопроводов при гидравлических ударах, при проседании или провале грунтов в результате вытаива-ния подземного льда (термокарст) или их течении в условиях зон с холодным климатом (солифлюкция) и т.д.;
• разгерметизацию трубопроводов при проведении ремонтных работ;
• несанкционированные врезки в трубопроводы и др.
Экологический ущерб от загрязнения углеводородами, в частности почвенного покрова, весьма велик, что выражается в снижении качества и продуктивности земель, вплоть до их вывода из сельскохозяйственного оборота. Это связано с негативным воздействием углеводородов на функционирование «живой фазы» почвы - микроорганизмов и их продуцентов - ферментов (катализаторов белковой природы), участвующих в создании плодородия почвы. Негативное воздействие углево-
дородов связано с закупоркой воздушных пор и полостей почвы, снижающей численность аэробных микроорганизмов, обволакиванием почвенных частиц углеводородной массой, препятствующим взаимодействию ферментов с субстратом (катализируемым веществом), образованием избытка органического вещества углеводородов, обогащенного серой и его соединениями, а также окисленных продуктов углеводородов, таких как гексадециловый спирт (С16Н33ОН), пальмитиновая (С15Н31СООН), бензойная (С6Н5СООН) и салициловая (НОС6Н4СООН) кислоты, вызывающие ингибирование активности ферментов [1]. Тем не менее почва обладает способностью самоочищаться от углеводородного загрязнения благодаря размножению микроорганизмов, способных существовать за счет одних лишь углеводородов, к которым относятся представители нескольких родов бактерий, дрожжей и мицелиальных грибов [2]. От других членов гетеротрофного микробиоценоза, питающегося органическими веществами, они отличаются способностью к поглощению гидрофобных углеводородных соединений и наличием углеводородокисляющих ферментов. И именно этот феномен используется при осуществлении ремедиации почвы, загрязненной нефтью и газовым конденсатом. При этом ремедиацию применяют в тех случаях, когда количество углеводородов в почве слишком мало, чтобы использовать механические спо-
собы, например «срезание» наиболее загрязненного поверхностного слоя и его утилизацию, но с другой стороны, слишком велико (до 5% от массы почвы), чтобы использовать загрязненные земли в сельскохозяйственных целях. В контексте сказанного следует выделить два принципиальных подхода к ремедиации почв, загрязненных углеводородами: 1) стимуляцию естественной углеводородокисляющей микрофлоры путем создания оптимальных условий для ее развития (аэрация, внесение азотно-фосфорных соединений и т.д.) и 2) интродукцию (введение) в загрязненную почву активных углеводородокисляющих микроорганизмов - например, в виде биокомпоста, представляющего собой торфо-навозную, торфо-пометную или другую смесь, изготавливаемую путем ускоренной ее переработки под воздействием ферментов и обогащения микроорганизмами (106 клеток/г) и питательными веществами [3]. Здесь указанная численность микробных клеток достаточна для их воспроизводства и положительного влияния на естественную углеводородокисляющую микрофлору.
Практика показала, что диагностику ремедиации почвы,загрязненной углеводородами, можно осуществлять посредством анализа активности ферментов - каталазы и дегидрогеназы. Это не случайно, так как, согласно [1], каталаза и дегидрогеназа причислены к основным деструкторам углеводоро-
\\ ТЕРРИТОРИЯ НЕФТЕГАЗ \\
№ 10 \\ октябрь \ 2011
дов, и уровень их активности является критерием микробиологического самоочищения от этих химических веществ. Ниже даются характеристики каталазы и дегидрогеназы, а также излагаются простые и доступные методы анализа их активности [4, 5].
ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТОВ -КАТАЛАЗЫ И ДЕГИДРОГЕНАЗЫ КАК ОСНОВНЫХ ДЕСТРУКТУРОВ УГЛЕВОДОРОДОВ
Каталаза является широко распространенным ферментом, найденным, в частности, у всех аэробных бактерий. Каталаза инициирует окисление органических веществ, в данном случае углеводородов, посредством реакции разложения перекиси водорода (H2O2), приводящей к образованию кислорода:
2H2O2 -> O2 + 2H2O
Перекись водорода, как объект катализа, образуется в процессе дыхания микроорганизмов и в результате различных биохимических реакций окисления органических веществ [6]. На основании сравнения активности препарата каталазы (свободный фермент), внутриклеточного фермента (образующегося культурой бактерий Serratia marcescens), почвенного фермента, ортштейна (органо-минеральное новообразование, состоящее из окислов железа и марганца и органического вещества) и минерала пиролюзита (из группы окислов и гидроокислов марганца) был сделан вывод о том, что главную роль в процессе разложения перекиси водорода в верхних горизонтах почв играет внеклеточный почвенный фермент - каталаза, находящаяся в иммобилизованном состоянии [7]. Обычно иммобилизация ферментов в почве происходит путем адсорбции на ее частицах, образования химических связей или закрепления в ячейках почвенных коллоидов и т.д. Для всех почвенных микроорганизмов, получающих энергию за счет окисления разнообразных субстратов почвы, характерен фермент - дегидрогеназа, катализирующая реакцию отщепления водорода, т.е. дегидрирования органических веществ, в данном случае углеводородов [6]. Дегидрогеназа считается внутриклеточным ферментом, и поэтому
ее активность достаточно точно отражает функциональное состояние почвенной микрофлоры. При определении активности дегидрогеназы в почве реально анализируется соответствующая активность микрофлоры, чьи ферменты воздействуют на субстрат в течение опыта. Считается, что активность дегидрогеназы проявляется преимущественно внутри структурных частиц почвы, т.е. в условиях недостаточного содержания кислорода, и поэтому анаэробные условия в описываемой ниже методике анализа активности данного фермента создавали посредством использования насыщенного щелочного раствора пирогаллола - С6Н3(ОН)3, как абсорбента кислорода.
МЕТОДИКИ ДИАГНОСТИКИ РЕМЕДИАЦИИ ПОЧВЫ, ЗАГРЯЗНЕННОЙ УГЛЕВОДОРОДАМИ, ПОСРЕДСТВОМ АНАЛИЗА АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ По данной методике анализируется активность ферментов почвы, как загрязненной углеводородами, так и
ремедиируемой биокомпостом. С этой целью производится отбор проб почвы со всей площади искомого участка методом «конверта», т.е. в пяти точках из слоя 0-15 см, где обычно локализуется основная масса углеводородов нефти или газового конденсата. Из отдельных проб почвы путем многократного перемешивания и квартования составляется один усредненный образец, достаточный для анализа. Далее усредненный образец почвы высушивают на воздухе, измельчают и просеивают через сито диаметром ячеек 1-2 мм. Анализ активности каталазы почвы проводится по методу известного российского почвенного энзимолога Ф.Х. Хазиева с использованием прибора его же конструкции [6] (рис. 1). С этой целью навеску почвы (1 г) помещают в каталазник (пробирка с двумя боковыми отростками со шлифами), туда же добавляют навеску карбоната кальция (СаС03, 0,1 г) и смесь перемешивают. Затем газометр, каталазник и коленчатую пробирку со шлифом с предварительно внесенными 5 мл 3%-ного
WWW.NEFTEGAS.INFO
\\ экология. разливы нефти \\ 65
Экология. РАЗЛИВЫ НЕФТИ
Рис. 1. Прибор Ф.Х. Хазиева для анализа активности каталазы почвы: 1 - газометр; 2 - краник газометра; 3 - каталазник; 4 - коленчатый сосуд: а) подкрашенная вода; б) смесь почвы и карбоната кальция; в) раствор перекиси водорода [6]
водного раствора перекиси водорода герметично соединяют друг с другом. После установления в газометре уровня подкрашенной воды на нулевой отметке закрывают его краник и поворачивают коленчатую пробирку по оси (на 1800) для слива раствора перекиси водорода в почву, находящуюся в каталазнике. Происходит реакция с выделением молекулярного кислорода, объем которого измеряют по шкале газометра в течение 1 минуты, фиксируя время секундомером. Активность каталазы выражают в единицах мл 02 /мин./г. Для количественного определения активности дегидрогеназы используют 2,3,5-трифенилтетразолийхлорид, 2,3,5-
ТТХ (С19Н15^С1, бесцветное вещество), который, акцептируя мобилизованный дегидрогеназой водород, превращается в почве в 2,3,5-трифенилформазан, 2,3,5-ТФФ (С19Н16^, вещество красного цвета) [6]:
При анализе активности дегидрогеназы навеску почвы (1 г) помещают в модифицированную колбу Эрлен-мейера ^=20 мл) с коленчатым боковым отростком (У=3 мл) со шлифами и туда же добавляют навеску карбоната кальция (0,1 г), затем последовательно приливают по 1 мл 1%-ных водных растворов глюкозы (С6Н1206) и 2,3,5-ТТХ и это все перемешивают, а в коленчатый отросток вводят шприцом 2,5 мл насыщенного щелочного раствора пирогаллола, приготавливаемого с использованием гидроксида калия (КОН) (рис. 2). Колбу и его коленчатый отросток герметично закрывают и помещают в термостат на инкубацию при температуре 30 0С на 1 сутки. После этого образующееся в почве вещество 2,3,5-ТФФ из внесенного в нее 2,3,5-ТТХ многократно экстрагируют этиловым спиртом (С2Н5ОН) до достижения бесцветной вытяжки с последовательным ее пропусканием через бумажный фильтр в мерные пробирки. Интенсивность окраски объединенных фильтратов этилового спирта измеряют на спектрофотометре при А=490 нм. Концентрацию 2,3,5-ТФФ вычисляют по калибровочному графику, составленному для этого вещества в диапазоне, например, 1-25 мкг 2,3,5-ТФФ/мл. Активность дегидрогеназы выражают в единицах мг 2,3,5-ТФФ /г/сут.
р
у 2
и I
\ 4 б
а
Рис. 2. Устройство для анализа активности дегидрогеназы почвы: 1 - модифицированная колба Эрленмейера; 2 - коленчатый отросток колбы: а) смесь почвы, карбоната кальция и растворов глюкозы и 2,3,5-трифенилтетразолийхлорида; б) насыщенный щелочной раствор пирогаллола
ПРИМЕРЫ ДИАГНОСТИКИ РЕМЕДИАЦИИ ПОЧВЫ, ЗАГРЯЗНЕННОЙ УГЛЕВОДОРОДАМИ, ПОСРЕДСТВОМ АНАЛИЗА АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ Оценивали эффект ремедиации образца серой лесной почвы (Московская обл.) из слоя 50-90 см с содержанием 50 и 100 г/кг нефти с помощью биокомпоста «Пикса» марки «Премиум», изготавливаемой из торфо-навозной смеси [8]. Диагностика ремедиации почвы, загрязненной нефтью, показала, что образцы контрольного варианта характеризовались самыми низкими значениями активности каталазы идегидрогеназы (табл. 1). При внесении биокомпоста в дозах 50-200 г/кг активность каталазы по сравнению с контрольным вариантом возрастала в 9-41 раз, а активность дегидрогеназы - в 3,5-17,0 раз, что подтверждает микробиологический характер разложения углеводородов
Таблица 1. Активность ферментов и время практически полного разложения (Т99) различных количеств углеводородов нефти, при ремедиации почвы биокомпостом
Вариант Активность каталазы, мл О2/мин./г Активность дегидрогеназы, мг ТФФ*/г/сут. Т99, сут.
Нефть, 50 г/кг (контроль) 0,1 0,1 329
Нефть, 50 г/кг + биокомпост, 50 г/кг 1,5 0,7 184
Нефть, 50 г/кг + биокомпост, 100 г/кг 2,7 1,4 69
Нефть, 50 г/кг + биокомпост, 200 г/кг 4,1 1,7 61
Нефть, 100 г/кг (контроль) 0,1 0,2 1150
Нефть, 100 г/кг + биокомпост, 50 г/кг 0,9 0,7 658
Нефть, 100 г/кг + биокомпост, 100 г/кг 2,2 2,3 288
Нефть, 100 г/кг + биокомпост, 200 г/кг 2,9 2,3 159
* 2,3,5-трифенилформазан
\\ ТЕРРИТОРИЯ НЕШТЕГАЗ \\
№ 10 \\ октябрь \ 2011
Таблица 2. Активность ферментов и продуктивность многолетних трав, при ремедиации биокомпостом почвы, загрязненной газовым конденсатом
Вариант Активность каталазы, мл О2/мин./г Активность дегидрогеназы, мг ТФФ*/г/сут. Продуктивность многолетних трав, сырая биомасса, г/м2
Без биокомпоста (контроль) 1,4 0,1 55
Биокомпост, 4 кг/м2 2,7 0,3 473
То же, 8 кг/м2 3,4 0,5 932
- « -, 12 кг/м2 3,5 0,5 243
- « -, 16 кг/м2 3,9 0,5 436
* 2,3,5-трифенилформазан
нефти. Параллельный анализ содержания углеводородов в почве методом инфракрасной спектрометрии и расчет времени практически полного разложения (Т99) углеводородов нефти показал, что с возрастанием значений показателей активности ферментов время разложения веществ сокращалось в 1,7-7,2 раза. Здесь Т99 рассчитывали по экспоненциальной зависимости: у = е-и, где у - остаточное содержание углеводородов на время ^ отнесенное к исходному (у0); е - основание натурального логарифма; к - константа скорости разложения углеводородов. Соответствующая формула для расчета выглядит как: Т99 = 1п 100/к, где к = 1п (Уо/у)Л.
В других исследованиях оценивали эффект ремедиации, также с помощью
биокомпоста «Пикса», черноземной почвы участка дожимной компрессорной станции (Ставропольский край), загрязненного экстремально высоким количеством газового конденсата [9]. С внесением биокомпоста активность каталазы и дегидрогеназы возрастала соответственно в 1,9-2,8 и 3-5 раз по сравнению с контрольным вариантом (табл. 2). Результаты посева и выращивания смеси многолетних трав (мятлика лугового - Poa pratensis, овсяницы красной - Festica rubra, райграса пастбищного - Loliumperenne и др.) на участке показали, что при использовании биокомпоста их продуктивность, выражаемая через сырую биомассу растений, была выше в 4,4-16,9 раз по сравнению с контрольным вариантом.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, диагностика ремедиации почвы, загрязненной углеводородами, заключается в анализе активности ее ферментов, отражающей процесс микробиологического самоочищения от данных химических веществ. Ключевым моментом диагностики является использование активностей ферментов - каталазы и дегидрогеназы, как основных деструкторов углеводородов нефти и газового конденсата. Корректность использования активности данных ферментов для диагностики ремедиации загрязненной почвы с использованием биокомпоста подтверждается значениями времени практически полного разложения углеводородов и продуктивностью многолетних трав, используемых для восстановления почвы, загрязненной углеводородами.
Литература:
1. Хазиев Ф.Х., Фатхиев Ф.Ф. Изменение биохимических процессов в почвах при нефтяном загрязнении и активация разложения нефти// Агрохимия. - 1981. - № 10. - С. 102-111.
2. Коронелли Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде (обзор)// Прикладная биохимия и микробиология. - 1996. - № 6. - С. 579-585.
3. Семенцов А.Ю. Применение суперкомпоста ПИКСА для реабилитации городских почв. - М.: ВНИИИА, 2006. - 32 с.
4. Патент на изобретение № 2387995, Российская Федерация/ Башкин В.Н., Бухгалтер Э.Б., Галиулин Р.В., Коняев С.В., Калинина И.Е., Галиулина Р.А. Способ контроля очистки почв, загрязненных углеводородами, и нейтрализации углеводородных шламов посредством анализа активности каталазы. Заявлено 22.09.2008 г. Опубликовано 27.04.2010 г. // Бюллетень. Изобретения. Полезные модели. - 2010. - № 12 (IV ч.) - С. 938.
5. Патент на изобретение № 2387996, Российская Федерация/ Башкин В.Н., Бухгалтер Э.Б., Галиулин Р.В., Коняев С.В., Калинина И.Е., Галиулина Р.А. Способ контроля очистки почв, загрязненных углеводородами, и нейтрализации углеводородных шламов посредством анализа активности дегидрогеназы. Заявлено 22.09.2008 г. Опубликовано 27.04.2010 г. // Бюллетень. Изобретения. Полезные модели. - 2010. - № 12 (IV ч.) - С. 938-939.
6. Хазиев Ф.Х. Ферментативная активность почв. Методическое пособие. - М.: Наука, 1976. - 180 с.
7. Тульская Е.М., Звягинцев Д.Г. Сравнительное изучение каталазной и каталитической активности верхних горизонтов почв// Почвоведение. - 1979. - № 10. - С. 92-97.
8. Галиулин Р. В., Галиулина Р.А., Башкин В. Н., Акопова Г. С., Листов Е.Л., Балакирев И. В. Сравнительная оценка разложения углеводородов газового конденсата и нефти в почве под действием биологических средств // Агрохимия. - 2010. - № 10. - С. 52-58.
9. Галиулин Р.В., Галиулина Р.А., Бухгалтер Э.Б., Башкин В.Н., Сидорова И.Е., Грунвальд А.В., Семенцов А.Ю. Биологическая индикация ремедиации почвы, загрязненной газовым конденсатом // Агрохимия. - 2008. - № 10. - С. 69-73. Ключевые слова: почва, углеводороды, нефть, газовый конденсат, ремедиация, биокомпост, диагностика, активность каталазы и дегидрогеназы.
WWW.NEFTEGAS.INFO \\ экология. разливы нешти \\ 67
