CC BY
49
DOI: 10.24411/2074-1995-2019-10054
Диагностика патогенных возбудителей микробиоты влагалища
методом количественной ПЦР в реальном времени
М.Ю.Дмитрюкова1, М.Е.Сенина2, В.В.Суровцев1, А.Е.Гущин3 ФУДН, Москва 2«ООО НекстБио», Москва Государственное бюджетное учреждение здравоохранения г. Москвы «Московский научно-практический центр дерматовенерологии и косметологии
Департамента здравоохранения г. Москвы»
Была проведена валидация набора реагентов для качественного и количественного определения ДНК Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium и Trichomonas vaginalis методом полимераз-ной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в режиме «реального времени» «АмплиПрайм NCM(T)». Установлена граница обнаружения, линейный диапазон, повторяемость и воспроизводимость результатов. Для клинической валидации использованы биологические образцы - соскобы эпителия и отделяемое уро-генитального тракта. В качестве референсного теста использован прошедший регистрацию в Росздравнад-зоре набор «АмплиПрайм NCMT». Совпадение результатов с референсным тестом составило 100%. Стандартное отклонение при определении межсерийной воспроизводимости составило не более 0,13 lg ГЭ/мл, при сравнении количественных результатов, полученных с использованием референсного набора -не более 0,3 lg ГЭ/мл. Перекрестных реакций с другими микроорганизмами не обнаружено.
Ключевые слова: Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Trichomonas vaginalis, ПЦР в режиме «реального времени», АмплиПрайм.
Diagnosis of Pathogenic Microorganisms of the Vaginal Microbiota by Real-Time Quantitative
PCR Method
M.Yu.Dmitryukova1, M.E.Senina2, V.V.Surovtsev1, A.E.Gushchin3 1RUDN university, Moscow 2NextBio Ltd., Со., Moscow 3Moscow Scientific and Practical Centre of Dermatovenereology and Cosmetology,
Moscow, Russia
This study was aimed to evaluate new multiplex real-time PCR assay AmpliPrime NCM(T) for simulta-
neous detection and quantification of Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium u Trichomonas vaginalis DNA in clinical samples. The limit of detection, linear range, reproducibility, and repeatability were established during validation. Assay was tested against the AmpliPrime NCMT kit on clinical samples - epithelium cell scrapings and urogenital discharge. Concordance of both tested and reference assays' results was 100%. Standard deviation for inter-batch reproducibility was less than 0.13 lg GE/ml, for reference test quantitative result - less than 0.3 lg GE/ml. Cross-reactivity was not detected.
Keywords: Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Trichomonas vaginalis, real-time PCR, AmpliPrime.
Введение
Инфекции, передаваемые половым путем, являются важной социальной проблемой, ассоциированной с ухудшением репродуктивного потенциала популяции, снижением качества жизни, а также со значительной нагрузкой на бюджет здравоохранения.
По данным ВОЗ, за 2012 г. зарегистрировано 357 млн новых случаев ИППП, подавляющее большинство которых приходится на возбудителей гонореи (Neisseria gonorrhoeae), хламидиоза (Chlamydia trachomatis) и трихомониаза (Trichomonas vaginalis) [1]. Часто ИППП протекают бессимптомно, и нераспознанная инфекция может привести к таким осложнениям как бесплодие, мертворождение, врожденные инфекции у новорожденного [2]. Кроме того, наличие ИППП повышает риск инфицирования ВИЧ [3].
Молекулярно-биологические исследования, основанные на методе амплификации НК (полимеразной цепной реакции, ПЦР), рекомендованы для диагностики ИППП [4] и обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными культуральными и микроскопическими методами. ПЦР тестирование позволяет получить результат за достаточно короткое время, обладает высокой специфичностью и чувствительностью, что важно для выявления хронической инфекции, когда патоген персистирует в низкой концентрации [5]. Кроме того, метод позволяет проводить исследование в количественном формате, что имеет значение для мониторинга эффективности лечения [6].
Целью работы была разработка и валидация набора реагентов для качественного и количественного определения ДНК Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium и Trichomonas vaginalis методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в режиме «реального времени».
Материалы и методы
Клинические испытания набора были проведены с использованием биологического материала - соскоб-ного материала и отделяемого слизистых оболочек урогенитального тракта, как наиболее часто тестируемого материала для выявления ИППП. Всего было исследовано 500 образцов, в том числе: 185 образцов мазков со слизистой оболочки влагалища, 155 образцов соскоба эпителия цервикального канала и 160 образцов соскоба эпителия уретры) женщин с диагнозом вагинит, цервицит или уретрит. Медиана возраста составила 31 год (от 16 до 42 лет). Материал был получен после проведения значимых исследований.
Предел обнаружения, линейный диапазон, воспроизводимость и повторяемость определяли с использованием модельных образцов, представляющих собой разведение стандартных образцов предприятия (СОП), содержащих фрагмент ДНК возбудителя
сл
о
сл I
00
го
-О
.о.
Диагностическая чувствительность и специфичность набора реагентов АмплиПрайм NCM(T)
Возбудитель Диагностическая чувствительность (с доверительной вероятностью 95%), не менее, % Диагностическая специфичность (с доверительной вероятностью 95%), не менее, %
N. gonorrhoeae 97,4 99,2
C. trachomatis 97,1 99,3
M. genitalium 97,3 99,2
T. vaginalis 97,1 99,3
о
I
00
J
го
-О
.CP
в известном концентрации, в клиническом материале, не содержащем ДНК выявляемых патогенов. Для определения предела детекции тестировали 10-кратные разведения СОП в концентрации от 10 до 1000 ГЭ/мл в 6 повторах. Линейный диапазон определяли путем пятикратного тестирования разведений СОП в пределах от границы обнаружения до 1х108 ГЭ/мл. Воспроизводимость и повторяемость количественных результатов определяли путем тестирования 80 модельных образцов, в трех концентрациях (от 5х103 до 1х104 ГЭ/мл, 5х104 до 1х105 ГЭ/мл и более 5х105 ГЭ/мл).
Аналитическую специфичность набора определяли тестированием ДНК и геномной ДНК человека. ДНК микроорганизмов в концентрации не менее 1х106 ГЭ/мл и геномную ДНК человека в концентрации 1 мкг/мл вносили в образцы биологического материала, не содержащие определяемые с помощью набора микроорганизмы. В исследование были включены следующие микроорганизмы: Treponema pallidum, Toxoplasma gondii, Herpes simplex virus type 1, Herpes simplex virus type 2, Human papilloma virus 16, Cytomegalovirus, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, Escherichia coli, Candida albicans, Enterococcus faecium, Neisseria flava, Neisseria subflava, Neisseria sicca, Neisseria mucosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Lactobacillus casei, Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum.
Экстракция ДНК из 100 мкл клинического материала проводилась с использованием набора реагентов «МагноПрайм ФАСТ» (НекстБио, Россия), согласно инструкции по применению набора.
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием ПО Excel (пакет MS Office).
В качестве набора сравнения использован набор реагентов «АмплиПрайм NCMT» (РУ № ФСР 2015/3168).
Результаты
На основании проведенного probit-анализа, предел обнаружения выявляемых патогенов составил: N. gonorrhoeae - 5,0х102 ГЭ/мл (95% ДИ 3,1х102-8,8х102 ГЭ/мл), C. trachomatis - 5,0 102 ГЭ/мл (95% ДИ 2,9х102-7,9х102 ГЭ/мл), M. genitalium - 1,0х103 ГЭ/мл 95%ДИ 7,0х102-1,7х103 ГЭ/мл), T. vaginalis - 50 ГЭ/мл (95% ДИ 3,6х101-7,6х101 ГЭ/мл).
Линейный диапазон составил: для N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium - 2х103-1х107 ГЭ/мл, для T. vaginalis - 2х102-1х107 ГЭ/мл.
Коэффициент вариации при исследовании повторяемости измерения на основании тестирования 40 модельных образцов в трех концентрациях в одних условиях (в один день, одним лаборантом) составил:
• В диапазоне концентраций от 5х103 до 1х104 ГЭ/мл: 1,5% (N. gonorrhoeae), 2,0% (C. trachomatis), 2,5% (M. genitalium) и 1,1% (T. vaginalis).
• В диапазоне концентраций от 5х104 до 1х105 ГЭ/мл: 1,9% (N. gonorrhoeae), 1,8% (C. trachomatis), 1,9% (M. genitalium) и 0,8% (T. vaginalis).
• В диапазоне концентраций более 5х105 ГЭ/мл: 1,2% (N. gonorrhoeae), 1,4% (C. trachomatis), 1,5% (M. genitalium) и 1,1% (T. vaginalis). Воспроизводимость определяли путем тестирования
80 модельных образцов в трех концентрациях в разных условиях (в разные дни, разными лаборантами):
Диаграмма Бленда-Альтмана сравнения количественных результатов двух наборов.
N. допопЬосас
м.-
у 0,6
4,4
С. trachomatis
3-oj
3 00 -21
err-
f
EL -&Я -
* * ;
•** i
Среднее значение, 1дГЭ/мл
М. genitalium
Среднее значение, Ig ГЭ/мл T.vagonalts
^ 0,2 Я С
f-o.s
| -о.«
-
■ » . *■
*
V ■ * * * < 1 ** f" "
......
1 _ * ' „ Jt_
Среднее значение, дГЭЛ<л
Среднее значение, дГЗ'мл
• В диапазоне концентраций от 5х103 до 1х104 ГЭ/мл коэффициент вариации (CV): 1,9% (N. gonorrhoeae), 2,1% (C. trachomatis), 2,6% (M. genitalium) и 1,3% (T. vaginalis).
• В диапазоне концентраций от 5х104 до 1х105 ГЭ/мл коэффициент вариации (CV): 2,0% (N. gonorrhoeae), 1,9% (C. trachomatis), 1,9% (M. genitalium) и 1,0% (T. vaginalis).
• В диапазоне концентраций более 5х105 ГЭ/мл коэффициент вариации (CV): 1,2% (N. gonorrhoeae), 1,5% (C. trachomatis), 1,5% (M. genitalium) и 1,2% (T. vaginalis).
При исследовании аналитической специфичности перекрестных реакций не выявлено.
Для исследования специфичности и чувствительности нового набора было исследовано 500 образцов биологического материала, одновременно с рефе-ренсным набором «АмплиПрайм NCMT». Все полученные результаты были признаны валидными на основании амплификации внутреннего контроля образца в исследуемом и референсном тестах.
При качественном исследовании с использованием контрольного набора «АмплиПрайм NCM(T)» образцов соскобного материала или отделяемого слизистых оболочек урогенитального тракта обнаружено 104 положительных образца, содержащих ДНК N. gonorrhoeae; 102 положительных образца, содержащих ДНК C. trachomatis; 108 положительных образцов, содержащих ДНК M. genitalium и 101 положительный образец, содержащих ДНК T. vaginalis.
Исследование с использованием референсного набора оказало полное совпадение положительных и отрицательных результатов. На основании полученных данных была рассчитана диагностическая чувствительность и специфичность с учетом 95% доверительной вероятности. Результаты представлены в таблице.
Сравнение количественного определения ДНК патогенов в биологическом материале с использованием тестируемого («АмплиПрайм NCM(T)») и рефе-ренсного наборов («АмплиПрайм NCMT») проводили с использованием корреляционного анализа Бленда-Альтмана. Полученные графические данные представлены на рисунке.
По оси ординат представлена разница количественных результатов, полученных с использованием тестируемого набора АмплиПрайм NCM(T) и рефе-
ренсного набора АмплиПрайм NCMT (CNCM(T) -CNCMT), по оси абсцисс - среднее значение полученных результатов ((CNCM(T) + CNCMT)/2). Черная прерывистая линия - границы 95% доверительного интервала (1,96 х стандартное отклонение), серая линия - среднее значение разницы между количественными результатами, ее расположение рядом с нулевой осью ординат свидетельствует о совпадении результатов обоих тестов.
Обсуждение
Выявление ИППП с использованием методов амплификации нуклеиновых кислот является важным этапом диагностики венерических заболеваний. ПЦР тесты позволяют с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять одновременно несколько патогенов в одном образце. До 10% пациентов с ИППП могут иметь микстинфекцию, среди которых наиболее распространенной комбинацией является коинфекция C.trachomatis и M. genitalium [7]. Поэтому использование тестов для одновременного определения наиболее распространенных возбудителей ИППП позволяет значительно повысить эффективность скрининга и снизить нагрузку на лабораторию.
Набор реагентов «АмплиПрайм NCM(T)» предназначен для качественного и количественного определения ДНК N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium и T. vaginalis в биологическом материале (соскобный материал или отделяемое слизистых оболочек уро-генитального тракта (влагалища, цервикального канала, уретры), прямой кишки, ротоглотки, конъюнктивы; моча; секрет предстательной железы) методом полимеразной цепной реакции. Для количественного измерения концентрации ДНК возбудителей в клиническом материале исследование проводят одновременно с образцом с известной концентрацией и на основании существования линейной зависимости между концентрацией ДНК и граничным циклом Ct, происходит определение концентрации ДНК мишени в исследуемом материале. Кроме того, исследование каждого образца проводится с использованием внутреннего контрольного образца - искусственно синтезированной последовательности, которая проходит через все этапы анализа и позволяет контролировать качество прохождения исследования в каждом отдельном образце.
Целью исследования было валидировать набор реагентов «АмплиПрайм NCM(T)» относительно рефе-ренсного набора «АмплиПрайм NCMT». Показано полное совпадение качественных и количественных результатов. Стандартное отклонение при сравнении количественных результатов двух тестов составило менее 0,3 lg ГЭ/мл, что является достаточным для количественного определения с использованием методов амплификации НК [8]. При этом стандартное отклонение при определении воспроизводимости и повторяемости не превышало 0,13 ^ГЭ/мл.
Совпадение истинноположительных и истинно-отрицательных результатов составило 100% для всех выявляемых патогенов. Тест показал высокую чувствительность и специфичность исследования.
Однако выявление возбудителей ИППП экстраге-нитальной локализации [9] требует введения дополнительных видов биологического материала и расширенной валидации набора, с использованием соскобов эпителия прямой кишки, ротоглотки, конъюнктивы; мочи; секрета предстательной железы).
Заключение
В ходе валидации набор реагентов «АмплиПрайм NCM(T)» показал высокую чувствительность и специфичность по выявляемым патогенам, а также хорошую воспроизводимость количественных результатов как между разными сериями набора, так и в сравнении с результатами, полученными с использованием референсного набора «АмплиПрайм NCMT».
Результаты исследований, представленные в статье, получены при финансовой поддержке Ми-нобрнауки России по договору №03.G25.31.0226 от 03.03.2017 г.
Литература
1. Report on sexually transmitted infections surveillance 2015. Geneva: World Health Organization; 2015. https://apps.who.int/iris/bitstream/ handle/10665/249553/9789241565301 -eng.pdf, дата обращения 10.07.2019).
2. Hammerschlag M.R. Chlamydial and gonococcal infections in infants and children clinical infectious diseases. Clin Infect Dis. 2011; 53 (Suppl 3): S99-102. https:// doi.org/10.1093/cid/cir699
3. Reda S., Gongalves F.A., Mazepa M.M., De Carvalho N.S. Women infected with HIV and the impact of associated sexually transmitted infections. Int J Gynaecol Obstet. 2018; 142 (2): 143-147. doi: 10.1002/ijgo. 12507
4. Федеральные клинические рекомендации. Дерматовенерология 2015: Болезни кожи. Инфекции, передаваемые половым путем. 5-е изд., перераб. И доп. М.: Деловой экспресс, 2016. - 768 с. / Fede-ral'nye klinicheskie rekomendacii. Dermatovenerologiya 2015: Bolezni kozhi. Infekcii, peredavaemye polovym putem. - 5-e izd., pererab. i dop. M.: Delovoj ekspress, 2016; 768 [In Russian].
5. Гомберг М.А., Гущин А.Е. Хламидийная инфекция в современной гинекологии: основные аспекты профилактики и лечения воспалительных заболеваний органов малого таза. Гинекология. - 2012. - Т 14. - №4. С. 19-22. / Gomberg M.A., Gushchin A.E. Chlamydial infection in modern gynecology: the main aspects of prophylaxis and treatment of pelvic inflammatory diseases. Gynecology. 2015; 14 (4): 19-22. [In Russian].
6. Muralidhar S. Molecular methods in the laboratory diagnosis of sexually transmitted infections. Indian J Sex Transm Dis AIDS. 2015; 36 (1): 9-17. doi: 10.4103/0253-7184.156686
7. Гущин А.Е., Рыжих П.Г, Савочкина Ю.А., Шипулина О.Ю., Шипулин Г.А. Изучение распространенности возбудителей ИППП (C. trachomatis, N. gonorrhoeae, М. genitalium, T. vaginalis) с помощью ПЦР в реальном времени в формате «МУЛЬТИПРАЙМ». Клиническая дерматология и венерология. - 2011. - № 4. - С. 90-93. / Gushchin A.E., Ryzhikh P.G., Savochkina Yu.A., Shipulina O.Yu., Shipulin G.A. Investigation the prevalence of the causative agents of STI (C. trachomatis, N. gonorrhoeae, М. genitalium, T. vaginalis) by real-time PCR using the MULTIPRIME system. Russian Journal of Clinical Dermatology and Venereology. 2011; 4: 90-93. [In Russian]
8. Karlen Y, McNair A., Perseguers S., Mazza C., Mermod N. Statistical significance of quantitative PCR. BMC Bioinformatics. 2007; 20; 8:131.
9. Chan P.A., Robinette A., Montgomery M., et al. Extragenital infections caused by Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. A review of the literature. Infect Dis Obstet Gynecol. 2016; 2016: 5758387. doi: 10.1155/2016/5758387.
Сведения об авторах:
Дмитрюкова Марина Юрьевна - старший научный сотрудник, РУДН, Москва
Сенина Мария Евгеньевна - руководитель управления разработки новой продукции ООО «НекстБио», Москва
Суровцев Виктор Васильевич - заместитель директора Медицинского института по инновационному развитию, РУДН, Москва
Гущин Александр Евгеньевич - ведущий научный сотрудник Государственного бюджетного учреждения здравоохранения г. Москвы «Московский научно-практический центр дерматовенерологии и косметологии Департамента здравоохранения г. Москвы»
О
I
оо
го
-О
•н
.а.
