CC BY
55
вэ
удк 616.33-002.44-07
диагностика h. pylori-инфекции
h.h. дехнич1, и.а. эденштейн 2
Смоленская государственная медицинская академия, кафедра факультетской терапии1; НИИ антимикробной химиотерапии2
Современные подходы к терапии H. pylori-инфекции основываются на выявлении возбудителя у пациента. Подтверждение наличия H. pylori является обязательным. Использование малочувствительных методов диагностики H. pylori приводит к неназначению эрадикационной терапии, прогрес-сированию заболевания и развитию осложнений у данного пациента.
Согласно рекомендациям Маастрихтского консенсуса III 2005 г., показаниями к проведению эра-дикации H. pylori являются состояния, при подтверждении наличия H. pylori [7,8]:
- язвенная болезнь (ЯБ) желудка и 12-перстной кишки в стадии обострения или ремиссии, включая осложненную ЯБ;
- мальтома;
- атрофический гастрит;
- состояние после резекции желудка по поводу рака;
- пациенты первой степени родства больных раком желудка;
- желание пациента после подробной консультации с врачом.
Кроме того, проведение эрадикации H. pylori считается целесообразным:
- у пациентов с идиопатической тромбоцитопе-нией и необъяснимой железодефицитной анемией при подтверждении наличия H. pylori [6];
- у пациентов, инфицированных H. pylori с неязвенной диспепсией;
- при длительной терапии ингибиторами протонной помпы у больных с гастроэзофагеальной рефлюксной болезнью при подтверждении наличия
H. pylori с целью регрессии H. pylor/'-индуцированного атрофического гастрита;
- при длительной терапии нестероидными противовоспалительными препаратами при подтверждении наличия H. pylori с целью профилактики ульце-рации и/или кровотечения [3, 7, 8].
Первыми методами диагностики H. pylori были способы ее обнаружения в биоптатах слизистой оболочки желудка с помощью гистологии, бактериологии или быстрого уреазного теста. Для выполнения этих диагностических тестов необходимо проведение эндоскопии. Однако существует значительная категория больных, которым эндоскопическое исследование с биопсией не рекомендуется. Это беременные женщины, больные, получающие антикоагулянты, пожилые пациенты с выраженной сердечной и дыхательной недостаточностью.
Если у пациентов нет иных показаний для использования эзофагогастродуоденоскопии (например, обследование, связанное с онкологической настороженностью), кроме диагностики H. pylori, то этим больным следует использовать методы диагностики H. pylori, не связанные с эндоскопией, т. е. неинвазивные.
При этом все методы диагностики, в которых в качестве исследуемого материала используются био-птаты, зависят от ряда факторов, таких, как место взятия биопсии, количество исследуемых биопта-тов, их размер. Имеет значение также то, используется ли данный метод диагностики первично или уже после проведенного лечения. Все эти факторы могут влиять на чувствительность и специфичность данных методов [5].
Таблица 1. Основные методы диагностики инфекции H. pylori
Метод диагностики Показания к применению Чувствительность,% Специфичность, %
Гистологический Первичная диагностика инфекции H. pylori 87,8 90,5
Быстрый уреазный тест Первичная диагностика инфекции H. pylori 87 86
Микробиологический Определение чувствительности H. pylori к антибиотикам 80-90 100
Серологический Скрининговая первичная диагностика H. pylori 95 86
Дыхательный тест Первичная диагностика H. pylori и контроль эффективности эрадикации H. pylori 100 100
3D
Вестник Смоленской медицинской академии Na1, 2009
Метод диагностики Показания к применению Чувствительность,% Специфичность, %
Определение антигена H. pylori в кале Первичная диагностика H. pylori и контроль эффективности эрадикации H. pylori |90 |90
Инвазивные методы диагностики H. pylori
Метод окрашивания H. pylori красителями в гистологическом препарате, полученном из слизистой оболочки желудка, являлся ранее «золотым стандартом» диагностики H. pylori. Гистологический метод позволяет охарактеризовать состояние слизистой оболочки желудка и обеспечивает возможность получения информации о наличии H. pylori. Гистологические препараты окрашивают по Гимзе, Вартину-Старри, толуидиновым синим, по Генте, что обеспечивает визуализацию как H. р^п, так и основные изменения слизистой оболочки желудка, и, что особенно важно, выявление кишечной метаплазии. Чувствительность гистологического метода для первичной диагностики H. pylori у больных с ЯБ 12-перстной кишки составляет 87,8%, специфичность - 90,5%. Таким образом, гистологический метод диагностики H. pylori 4-х биоптатов (2 из антрального отдела, 2 из тела желудка) обладает относительно высокой чувствительностью и специфичностью и может использоваться в первичной диагностике H. pylori.
Использование цитологического метода для первичной диагностики H. pylori и контроля за эрадика-цией, по данным различных исследований, приводит к гиподиагностике инфекции. Связано это с тем, что H. pylori в зависимости от условий окружающей среды может выраженно менять свою морфологию, а в этих условиях визуальная диагностика H. pylori на основе только тинкториальных свойств невозможна. Важным компонентом морфологической диагностики является расположение H. pylori относительно покровно-ямочного эпителия, которое при приготовлении мазка-отпечатка исключается из анализа. Таким образом, использование цитологического метода для контроля за эрадикацией H. pylori является нерациональным, так как уменьшается популяция возбудителя в слизистой оболочке желудка после проводимой антигеликобактерной терапии.
Быстрый уреазный тест заключается в том, что, гидролизуя мочевину непосредственно в слизистой оболочке желудка, H. pylori образует аммиак, который нейтрализует соляную кислоту и создает оптимальные условия для роста и колонизации. При рН 3-7 H. pylori благодаря уреазе поддерживает внутриклеточный рН, близкий к нейтральному.
Основой разработки уреазных тестов для диагностики H. pylori является тот факт, что никакая другая бактерия, кроме H. pylori, не способна продуцировать уреазу в условиях желудка в таких количествах,
чтобы она накапливалась в его слизистой оболочке. Поэтому используются методы, определяющие исключительно тканевую уреазу, а не бактериальную, то есть методы, работающие при комнатной температуре и содержащие добавки, уничтожающие любую микрофлору в биоптате.
При гидролизе мочевины под действием уреазы происходит следующее:
NH2
i
C = O + 2H2O + H+ ^ 2NH4+ + HCO3-
i
NH2
Образующийся в результате ион аммония приводит к выраженному увеличению рН среды, что можно зафиксировать с помощью индикатора, а следовательно и визуально по изменению окрашивания среды.
По данным исследования, в котором сравнивались различные уреазные методы диагностики H. pylori, их чувствительность и специфичность примерно одинаковая--87% и ~86% соответственно. К недостаткам следует отнести то, что, несмотря на относительно высокую чувствительность, у ряда больных H. pylori с помощью данных тестов не определяется. Это связано с тем, что в биопта-те бактерии отсутствуют в необходимом количестве для продукции уреазы, достаточном для изменения рН-теста.
Материалом для микробиологической диагностики H. pylori является 4 биоптата слизистой оболочки желудка. В качестве транспортных сред используются: для короткого хранения - 0,5 мл стерильного физиологического раствора; для более длительного хранения (до 48 ч) - транспортные среды Portagerm pylori, Stuarts.
Перед посевом биопсийный материал помещают в 0,5 мл Бруцелла бульона и гомогенизируют электрическим гомогенизатором при 10 000 об/мин в течение 10-20 секунд. Затем по две капли гомогенизированного раствора помещают на поверхности чашек с питательными средами: 1 неселективной -сердечно-мозговой агар с добавлением 10% овечьей крови и 2 селективной - Pylori agar и сердечно-мозговой агар с добавлением 10% овечьей крови, полимиксина В, ванкомицина, триметоприма, амфо-терицина В. Посев производят сплошным газоном с помощью стеклянного шпателя/бактериологической петли. Чашки инкубируются в течение 7-12 дней в микроаэрофильных условиях (О2 - 11%, СО2 - 9%,
N2 - 80 %) с использованием газогенерирующих пакетов при температуре +37°С и влажности 95%.
При получении золотисто-желтых колоний, по морфологии сходных с H.pylori, проводится их идентификация с окраской мазка по Граму (грамотрица-тельные изогнутые S/V-образно палочки) и наличием уреазной, каталазной и оксидазной активности.
Показанием к проведению микробиологического исследования является неэффективность антиге-ликобактерной терапии с целью определения чувствительности H. pylori к антимикробным препаратам и дальнейшей тактики лечения. Определение чувствительности H. pylori к антимикробным препаратам проводится методом Е-тестов или методом разведения в агаре.
Для обнаружения фрагментов генов H. pylori в био-птате слизистой оболочки желудка используют по-лимеразную цепную реакцию (ПЦР). В зависимости от используемого праймера и особенностей методики, чувствительность метода варьирует в пределах 10-100 микробных тел. ПЦР используется как диагностический метод, а также как метод генотипирования H. pylori, исследуя чистую культуру или непосредственно биоптаты слизистой оболочки желудка.
При первичной диагностике чувствительность и специфичность ПЦР составляет 100%. При контроле за эрадикацией H. pylori через 4 недели определение фрагмента гена ureC с помощью ПЦР в биоптатах из антрального отдела желудка после проведенной антигеликобактерной терапии при малой обсеменен-ности H. pylori превосходит по чувствительности гистологический и бактериологический методы.
Важным отличием ПЦР является то, что выделенная в процессе диагностики ДНК H. pylori может использоваться для определения резистентности H. pylori к антимикробным препаратам. Используя в качестве материала исследования биопсии слизистой оболочки желудка, можно, минуя стадию получения чистой культуры, определять мутации в гене 23S рРНК, которая ответственна за возникновение у H. pylori резистентности к макролидам. Обнаруженная комбинация мутаций в генах rdxA и frxA у штаммов H. pylori, резистентных к нитроимидазо-лам, позволяет определять резистентность H. pylori к этой группе препаратов. Однако в силу высокой стоимости такая диагностика H. pylori имеет скорее научное значение [1].
Неинвазивные методы диагностики H. pylori Дыхательный уреазный тест Принцип метода напоминает тот, что используется в описанном выше быстром уреазном методе. Мочевина, меченная 13С, после попадания в желудок человека, инфицированного H. pylori, под воздействием уреазы подвергается гидролизу, в результате чего образуется углекислый газ, содержащий меченый атом углерода, который попадает в кровоток, а затем выделяется через легкие (рис. 1).
Увеличение экскреции меченого углекислого газа в выдыхаемом воздухе используется как маркер наличия H. pylori в желудке. Для его определения используются масс-спектрометр или инфракрасный спектрофотометр. Данный метод может использоваться у детей и беременных женщин. Чувствительность и специфичность метода составляет 100%.
СО2 в выдыхаемом воздухе
Прием мочевины, меченной 13С
Диффузия СО2 через альвеолы
ffW» H-ffyi.lri MvrgrifcH ■- -* (703 + NH:-.
Абсорбция СО2 в кровь
Рис. 1. Принцип действия дыхательного уреазного теста
32
Вестник Смоленской медицинской академии Na1, 2009
На сегодняшний день дыхательный тест с мочевиной, меченной 13С, является стандартом первичной диагностики H. pylori и используется для контроля за эрадикацией H. pylori после проведения антигеликобактерной терапии [5].
Иммунологические методы используются для определения антигенов H. pylori в кале и для первичной серологической диагностики H. pylori.
Иммуноферментный анализ концентрации антигена H. pylori в кале может использоваться как для первичной диагностики H. pylori, так и в качестве альтернативного метода для контроля эрадика-ции H. pylori через 4-6 недель. Чувствительность и специфичность данного метода в обоих случаях более 90% в сравнении с набором инвазивных методов и дыхательным тестом. Суть метода заключается в том, что на носитель нанесены антитела против антигенов H. pylori. При инкубации взвеси исследуемой пробы кала в плашке антигены H. pylori связываются с антителами, и после последующей обработки проб на стандартном фотометре и по изменению оптической плотности образца определяется концентрация антигена H. pylori в кале. Тест позволяет количественно оценить концентрацию антигена H. pylori в кале, так как не зависит от продукции метаболитов микроба, а зависит лишь от количества микробных тел в образце.
При первичной серологической диагностике инфекции H. pylori с помощью иммуноферментного анализа пользуются наборами для определения антигеликобактерных иммуноглобулинов класса IgG в крови. Чувствительность метода ~ 95%, специфичность ~ 86%. Уменьшение титра специфических антигеликобактерных антител наступает через 4-6 месяцев после уничтожения H. pylori, поэтому использовать данную методику для оценки эради-кации H. pylori после проведения антигеликобактерной терапии в сроки 4-6 недель не рекомендуется [6].
Молекулярно-биологические методы
ПЦР для качественного обнаружения ДНК H. pylori в кале в режиме реального времени является стандартом современной первичной диагностики H. pylori и высокочувствительным методом контроля эрадикации H. pylori через 4-6 недель после окончания антигеликобактерной терапии. В основе метода ПЦР лежит комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Методика проведения анализа с использованием метода ПЦР включает 3 этапа:
1 этап - выделение ДНК (РНК) из клинического образца;
2 этап - амплификация специфических фрагментов ДНК;
3 этап - детекция продуктов амплификации.
Для исследования собирают свежевыделенный
кал. За 3-4 дня до исследования следует отменить
прием слабительных препаратов, прекратить введение ректальных свечей. Кал, полученный после клизмы, а также после приема бария (при рентгеновском обследовании), для исследования непригоден. Материал доставляется в лабораторию в течение 3-х часов с момента сбора анализа. При взятии материала необходимо соблюдать стерильность.
Чувствительность и специфичность определения антигена H. pylori ПЦР для первичной диагностики H. pylori и контроля эрадикации H. pylori превышает 90% [4].
Таким образом, неинвазивные методы диагностики H. pylori являются более высокочувствительными, специфичными, простыми по сравнению с инвазив-ными способами определения H. pylori, в связи с чем рекомендованы для первичной диагностики H. pylori и для контроля за эрадикацией H. pylori.
Диагностика H. pylori в России
Надо отметить, что проблема диагностики H. pylori в России чаще связана с недоступностью высокочувствительных методов определения возбудителя.
Так, по данным исследования, проведенного на базе кафедры факультетской терапии и НИИ Антимикробной химиотерапии в 2005 г., при оценке 1398 амбулаторных карт взрослых пациентов с ЯБ желудка и 12-перстной кишки в 7 регионах России (Казань, Красноярск, Москва, Новосибирск, Ростов, Санкт-Петербург, Смоленск) диагностика H. pylori до назначения эрадикационной терапии была проведена лишь у 22,5% (n=315) пациентов. При этом наиболее часто использовались инвазивные методы обнаружения бактерий: уреазный тест с биопсийны-ми фрагментами - в 53% (n=161), гистологическое исследование - в 30% (n=93) и цитологическое исследование препаратов слизистой оболочки желудка - в 14% (n=45). Серологические методы использовались у 3% пациентов [2].
Контроль эрадикации H. pylori осуществлялся лишь у 6,7% (n=94) пациентов, т. е. у подавляющего числа больных врач не мог оценить эффективность проведенной терапии и тем более определиться с дальнейшей тактикой ведения пациента. Причем использовались в основном неадекватные методы диагностики: быстрый уреазный тест - 48%, цитологический метод - 11%, серологический метод -3%. Адекватные неинвазивные методы диагностики H. pylori были проведены у очень ограниченного числа больных. У 4% пациентов определялся H. pylori в кале путем ПЦР, у 2% использовался уреазный дыхательный тест с мочевиной, меченной 13С [2].
В настоящее время в Смоленске доступны как инвазивные методы диагностики H. pylori (быстрый уреазный тест, гистологический метод, определение гена ureC ПЦР в биоптате слизистой оболочки желудка), так и неинвазивный метод определения антигена H. pylori в кале ПЦР.
Использование ПЦР с целью определения H. pylori в кале у ограниченного числа пациентов клиники факультетской терапии на базе НИИ антимикробной химиотерапии в сентябре 2008 г. показало, что предварительный прием антибактериальных препаратов, в том числе ингибиторов протонной
помпы, накануне исследования ведет к получению ложноотрицательных результатов, что, в свою очередь требует тщательного сбора анамнеза перед назначением данного исследования. В случае отсутствия терапии до проведения диагностики H. pylori в кале допустимо назначение лишь антацидов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Исаков В.А., Домарадский И.В. Хеликобактериоз. - М.: ИД Медпрактика-М, 2003. - 412 с.
2. Страчунский Л.С., Ивашкин В.Т., Лапина Т.Л., Дехнич Н.Н. и др. Реальная практика ведения пациентов с язвенной болезнью желудка и 12-перстной кишки в России: результаты многоцентрового фармакоэпидемиологического исследования // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2005. - № 6. - С. 16-21.
3. Chey W.D., Wong B.C.Y. American College of Gastroenterologoy guideline on the management of Helicobacter pylori infection. Am J. Gastroenterol 2007. - Р. 102:1808.
4. Gisbert J.P., de la Morena F., Abraira V. Accuracy of monoclonal stool antigen test for the diagnosis of H. pylori infection: a systematic review and meta-analysis. Am J Gastroenterol. 2006. - Р. 101(8):1921-30.
5. Gisbert J.P.; Esteban C.; Jimenez I.; Moreno-Otero R. 13C-urea breath test during hospitalization for the diagnosis of Helicobacter pylori infection in peptic ulcer bleeding. Helicobacter. - 2007. - Р. 12(3):231-7.
6. Hershko, C., Offbrand A.V., Keret D., et al. Role of autoimmune gastritis, Helicobacter pylori and celiac disease in refractory or unexplained iron deficiency anemia. Haematologica 2005. - Р. 90:585.
7. Malfertheiner P., Megraud F., O'Morain C., Bazzoli F., El-Omar E., Graham D., Hunt R., Rokkas T., Vakil N., Kuipers E.J. Current concepts in the management of Helicobacter pylori infection: the Maastricht III Consensus Report. Gut. 2007. -Р. 56(6):772-81.
8. Malfertheiner P., Megraud F., O' Morain C. Guidelines for management of Helicobacter pylori infection. European gastroenterology review 2005; 59-62.
удк 616.36-004.34-008.7:615.382
применение дискретного плазмафереза в терапии алкогольного цирроза печени
т.г. морозова
Смоленская государственная медицинская академия, кафедра госпитальной терапии
Одно из ведущих мест среди причин госпитализации и утраты трудоспособности у больных с заболеваниями органов пищеварения в возрасте от 20 до 60 лет отводится циррозу печени, который является наиболее частой причиной летальных исходов при неопухолевых заболеваниях данной локализации [3, 4]. Летальность больных циррозом печени составляет 15-25% [5]. Уровень смертности у мужчин выше, чем у женщин, в 1,5-2 раза.
Хроническая интоксикация алкоголем, по мнению многих авторов, признается наиболее частой причиной развития цирроза печени (по разным данным, от 40-50% до 70-80%) [3, 4]. В последние годы в России отмечается увеличение доли алкогольного цирроза печени в сравнении с циррозом вирусной этиологии, что связано со многими особенностями жизни населения (злоупотребление алкоголем, употребление суррогатных пищевых продуктов алкоголя, омоложение алкоголизма) [3]. Рост заболеваемости циррозом печени связан и с тем, что больные алкогольной болезнью печени чаще всего попадают
в поле зрения врача уже на стадии цирроза. Это объясняется как многолетним бессимптомным течением алкогольных поражений печени, которые прогрессируют до цирроза не более чем в 20% случаев, так и отсутствием их специфических маркеров. Велик социально-экономический ущерб, наносимый циррозом печени, так как это заболевание приводит к стойкой утрате трудоспособности, ранней инвалидности и смертности. Социальная значимость алкогольного цирроза печени обусловила его интенсивное изучение и поиск эффективной комбинированной терапии этого заболевания.
Литературные данные свидетельствуют об эффективности эфферентных методов лечения при заболеваниях печени [1, 2], в частности плазмафе-реза, который является самой распространенной операцией экстракорпоральной гемокоррекции, используемой в клинике внутренних болезней [4, 6]. Один из вариантов плазмафереза - дискретный (центрифужный) плазмаферез. Он нашел широкое применение в трансфузиологии при получении ком-
