CC BY
40
УДК 618.14-006-074
ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПРИ ДОБРОКАЧЕСТВЕННЫХ И ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЯХ ТЕЛА МАТКИ
К.А. Шахова1, А.А. Бабаев2, О.С. Янченко1, ЕЮ. Конторшикова3,
К.Н. Конторшикова1, В.В. Новиков2, А.Ю. Барышников4,
'ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия»,
2ГБОУ ВПО «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»,
3ГУЗ НОКБ «Нижегородская областная клиническая больница им. Н.А. Семашко»,
4ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина Российской академии медицинских наук», г. Москва
Шахова Ксения Андреевна - e-mail: [email protected]
При раке эндометрия увеличена сывороточная концентрация IL-10 и растворимых комплексов молекул адгезии CD18-CD54. Содержание CD8+, CD25+, CD38+ и CD54+ мононуклеарных клеток, IL-12, IFN-7, растворимых молекул CD8, олигомерных молекул CD50, растворимых молекул CD54 увеличивалось при раке эндометрия и миоме матки. Количество CD18+ и CD50+ мононуклеарных клеток повышалось только при миоме матки.
Ключевые слова: растворимые дифференцировочные молекулы, олигомерные растворимые дифференцировочные антигены, цитокины, миома матки, рак эндометрия..
Endometrial cancer patients had higher serum concentrations of IL-10 and adhesion molecule soluble complexes CD18-CDS4. The content of CD8+, CD25+, CD38+ and CD54+ mononuclear cells, IL-12, IFN-7, soluble CD8 molecules, oligolmeric CD50 molecules and soluble CD54 molecules were elevated in endometrial cancer as well as in uteri myoma. Only uteri myoma patients had higher levels of CD18+ and CD50+ mononuclear cells.
Key words: soluble differentiation antigens, oligomeric soluble differentiation antigens,
cytokines, uteri myoma, endometrial cancer..
В механизмах реализации иммунологического ответа участвуют белки иммунокомпетентных клеток, называемые дифференцировочными молекулами и находящиеся как в мембранной, так и в растворимой форме. Нарушение их содержания приводит к модуляции межклеточных взаимодействий и, соответственно, иммунного ответа [1]. Кроме того, сохранение способности растворимыми дифференцировоч-ными молекулами связывать лиганд, характерный для их мембранных форм, приводит к образованию растворимых комплексов (ассоциатов). Эффекторные свойства молекул в составе подобных ассоциатов взаимно погашены. Ранее авторами были выявлены в крови здоровых лиц и при различных заболеваниях три таких растворимых комплекса, состоящих из молекул Н1_А I класса и молекул СЭ8, молекул СЭ54 и СР18, а также из молекул СЭ18 и СЭ50, соответственно [2, 3, 4].
Было обнаружено, что сывороточное содержание растворимых дифференцировочных молекул, молекул главного комплекса гистосовместимости, а также содержание выявленных комплексов меняется при различных заболеваниях [1, 3, 4, 5]. При этом характер изменения концентрации ассо-циатов может существенно отличаться как по величине, так и по направленности изменений концентрации суммарных фракций растворимых дифференцировочных молекул и имеет потенциальное диагностическое значение [6].
Целью настоящей работы явилась сравнительная оценка структурно-функционального состояния пула растворимых
дифференцировочных молекул периферической крови больных раком эндометрия и миомой матки в сопоставлении с цитокиновым статусом и популяционным составом мононуклеарных клеток крови.
Материалы и методы
В работе использованы образцы венозной крови пациенток с гистологически подтвержденным диагнозом I стадии рака эндометрия (I патогенетический вариант) (20 человек) и миомы матки (40 человек). Образцы крови были получены от больных, поступивших на лечение в Нижегородскую Областную клиническую больницу им. Н.А. Семашко. Возраст больных со злокачественными новообразованиями составил от 39 до 79 лет (в среднем 59 лет), с доброкачественными опухолями - от 30 до 59 (в среднем 46,4 года). В качестве контрольной группы исследовали кровь 30 клинически здоровых доноров сопоставимого возраста.
Мононуклеарные клетки выделяли в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-верографина (1,077 мг/мл). Клетки выделяли не позднее двух часов после забора крови.
Иммунофенотипирование мононуклеарных клеток периферической крови проводили методом непрямой иммунофлуоресценции с помощью люминесцентного микроскопа ОНтриБ СХ31 (Япония). Для иммунофенотипирования моно-нуклеарных клеток использовали моноклональные антитела МКА серии ИКО против СЭ4, СЭ8, СР18, СЭ25, СЭ38, СЭ50, СЭ54, СЭ95 и Н1_А I антигенов.
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИК
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГHOCTИKА
Определение уровня растворимых дифференцировочных молекул CD8, CD25, CD38, CD50, CD54, CD18, олигомерных фракций растворимых CD8, CD25, CD38 и CD54 молекул, ассоциатов CD18-CD50 и CD18-CD54 в сыворотке крови больных проводили двухсайтовым иммуноферментным методом с использованием тех же моноклональных антител (МКА) серии ИКО, меченых пероксидазой хрена, и поликлональных антител против мононуклеарных клеток периферической крови человека в соответствии с ранее разработанным методами [6]. Результаты выражали в условных единицах (U/ml).
Определение сывороточного содержания интерлейкина-4 (IL-4), интерлейкина-10 (IL-10), интерлейкина-12 (IL-12) и интерферона-гамма (IFNy) проводили двухсайтовым имму-ноферментным методом с использованием коммерческих тест-систем для количественного определения IL-4, IL-10 и IFNy («Вектор-Бест», Новосибирск) и набора для количественного определения человеческого IL-12+p40 (BIOSOURS, США).
Статистический анализ проводили с использованием пакета программ Microsoft Excel, Statistica 6.0.
Результаты и их обсуждение
Уровень IL-10 в сыворотке крови больных миомой матки был достоверно повышен относительно здоровых доноров в 1,4 раза, что составило 10,5±1,0 pg/ml. Больные раком эндометрия характеризовались более выраженным увеличением содержания IL-10. Его концентрация составила 17,0±4,2 pg/ ml, что превышало норму в 2,3 раза и в 1,7 раза показатели больных миомой маки (таблица 1).
Статистически значимых изменений в содержании IL-4 не обнаружено как у больных миомой матки, так и у больных раком эндометрия. Повышение уровня IL-12 зарегистрировано как при миоме матки, так и при раке эндометрия в 1,9 и 1,8 раза соответственно. Сходный характер изменений носило увеличение сывороточного содержания IFNy. Концентрация IFNy у больных с доброкачественной опухолью матки составила 9,9±2,2 pg/ml, что в 23,6 раза превышало показатели здоровых доноров. Следует отметить, что содержание IFNy в сыворотке крови данной группы больных коррелировало с содержанием IL-10 (R=0,51, p<0,05). У пациенток со злокачественной опухолью эндометрия концентрация IFN-y была равна 8,25±2,6 pg/ml, что в 19,6 раза превышало норму (р<0,05) (таблица 1).
ТАБЛИЦА 1.
Сывороточное содержание цитокинов у больных миомой матки и раком эндометрия (pg/ml)
что составило 272,8 +20,1 и 224,9+18,6 и/т1, соответственно (рис. 1). Увеличение содержания обеих фракций растворимых молекул СЭ8 у больных с доброкачественной опухолью матки отмечалось совместно с повышением относительного содержания СЭ8+ мононуклеарных клеток периферической крови в 1,4 раза относительно здоровых доноров и составило 30,2+1,4% (таблица 2).
ТАБЛИЦА 2.
Относительное содержание субпопуляций лимфоцитов у больных миомой матки и раком эндометрия (%)
Антигенположительные клетки Норма Миома Рак эндометрия
CD4+ 37,2±1,4 37,0±1,4 33,6±1,5
CD8+ 21,2+0,5 30,2+1,4* 28,0±2,0*
HLA I+ 54,8+1,9 51,0±3,7 43,2±6,2*
CD18+ 32,9+2,1 47,9+2,7*Т 37,34±2,8
CD50+ 27,4+1,3 42,24+2,4* 33,2±3,4
CD54+ 23,2+0,9 42,5±3,0* 33,5±4,4*
CD25+ 15,5+0,9 32,31+2,3*Т 26,14±2,8*
CD38+ 15,7+0,9 39,9+2,9*Т 20,1±1,5*
CD95+ 39,5+1,9 45,0±2,2 34,3±3,5
Примечание: * - статистически значимые различия с нормой (р<0,05), ▼ - статистически значимые различия между миомой матки и раком эндометрия (р<0,05).
У больных раком эндометрия на фоне достоверного увеличения относительной концентрации СР8+ клеток в 1,3 раза
(28,0+2,0%) также наблюдалось увеличение сывороточных уровней суммарной и олигомерной фракций молекул СЭ8 в 1,3 и 1,9 раза соответственно (рис. 1). При этом относительное содержание СЭ8+ мононуклеарных клеток коррелировало с сывороточным уровнем 1Р1\1у (г=0,78, р<0,05).
Сывороточный уровень суммарной фракции растворимых молекул СЭ38 существенно не отличался от нормы как у больных миомой матки, так и раком эндометрия, имея лишь тенденцию к увеличению. Относительная концентрация растворимых молекул СЭ38 составляла величины, равные 297,9+34,6 и/т1 и 225,3+21,5 и/т1, соответственно (рис. 2). Обнаружена корреляция между сывороточным содержанием растворимых молекул СЭ38 и 11.-10 (г=0,57, р<0,05).
Содержание олигомерной фракции молекул СЭ38 не изменялось у больных обеих групп. Однако в крови как женщин с миомой матки, так и женщин, больных раком эндометрия, выявлено увеличение относительного содержания СЭ38+ мононуклеарных клеток, которое повышалось в сравнении с показателями здоровых волонтеров соответственно в 2,5 и 1,3 раза (р<0,05). Заметим, что уровень СЭ38+ клеток у больных миомой матки в 1,9 раза превышал относительное содержание данных клеток в периферической крови больных раком эндометрия (р<0,05) (таблица 2).
У больных с доброкачественной и злокачественной опухолью тела матки на фоне нормального содержания суммарной и олигомерной фракций молекул СЭ25 было зарегистрировано увеличение относительного содержания СЭ25+ мононуклеарных клеток периферической крови (рис. 2, таблица 2). Относительное содержание СЭ25+ клеток у больных миомой матки составило 32,3+2,3%, у больных раком эндометрия -26,1+2,8%, что превышало показатели нормы в 2,1 и 1,7 раза, соответственно. При этом относительная концентрация данной популяции клеток у больных миомой матки была в 1,2
Цитокин Норма Миома Рак эндометрия
IL-4 0,89+0,33 1,94+0,36 2,79+1,08
IL-10 7,31+1,27 10,15+1,00 16,99+4,18*Т
IL-12 59,22+1,44 112,7+2,95* 105,01+17,94*
IFN 0,42+0,42 9,91+2,22* 8,25+2,63*
Примечание: * - статистически значимые различия с нормой (р<0,05), ▼ - статистически значимые различия между миомой матки и раком эндометрия (р<0,05).
Наряду с исследованием сывороточного содержания цитокинов в двух группах больных было исследовано содержание ряда растворимых дифференцировочных молекул.
В сыворотке крови больных миомой матки наблюдалось увеличение по сравнению с нормой содержание суммарной и олигомерной фракций растворимых молекул СЭ8 в 1,6 раза,
раза выше уровня CD25+ мононуклеарных клеток в периферической крови больных раком эндометрия (р<0,05).
Исследовано сывороточное содержание растворимых молекул адгезии. У больных миомой матки сывороточное содержание суммарной фракции растворимых молекул CD54 было повышено по сравнению с нормой в 2,1 раза при неизменном содержании олигомерной фракции молекул CD54 и увеличении в 1,7 раза относительного содержания CD54+ клеток крови (40,0±3,0%) (рис. 3, таблица 2). У больных раком эндометрия уровень sCD54 был повышен относительно нормы в 2,2 раза. Сывороточное содержание олигомерной фракции молекул CD54 оставалось в пределах нормы, имея лишь тенденцию к увеличению. При этом относительное содержание клеток крови, положительных по CD54 антигену, у больных злокачественной опухолью эндометрия оставалось в пределах нормы. В данной группе больных обнаружена положительная корреляционная взаимосвязь между сывороточным содержанием ^-4 и суммарной фракции растворимых молекул CD54 ^=0,74, р<0,05), а также между ^-4 и содержанием олигомерного CD54 ^=0,65, р<0,05).
Сывороточный уровень растворимых молекул CD18 не отличался от нормы как у больных миомой матки, так и раком эндометрия, составляя величины, равные 189,5±24,8 U/ml и 237,6±19,3 U/ml, соответственно (рис. 3). При этом в крови больных миомой матки выявлено достоверное увеличение относительного содержания CD18-положительных лимфоцитов, которое повышалось в 1,6 раза в сравнении с нормой. Относительное содержание CD18+ мононуклеарных клеток у больных раком эндометрия сохранялось в пределах нормы и было в 1,3 раза ниже относительного содержания данных клеток в периферической крови больных миомой матки (р<0,05) (таблица 2). У больных миомой матки уровень суммарной фракции растворимых молекул CD18 положительно коррелировал с содержанием ^-10 ^=0,57, р<0,05) и ^N7 ^=0,64, р<0,05), в то время, как у больных со злокачественной опухолью эндометрия содержание растворимых молекул CD18, как и содержание CD18+ мононуклеарных клеток, положительно коррелировало с концентрацией ^-10.
Наряду с оценкой содержания суммарных фракций диф-ференцировочных молекул адгезии CD54 и CD18 был определен сывороточный уровень растворимых ассоциатов CD18-CD54. Обнаружено, что при миоме матки он не изменялся, а при раке эндометрия его уровень увеличивался в 1,8 раза. Больные миомой матки и раком эндометрия характеризовались статистически достоверными различиями в содержании растворимых ассоциатов CD18-CD54 (р<0,05) (рис. 4). При этом у больных миомой матки содержание ассоциатов коррелировало с концентрацией ^-10 ^=0,57, р<0,05) и ^N7 (Р=0,64, р<0,05). При злокачественной опухоли эндометрия сывороточный уровень комплексов CD18-CD54 положительно коррелировал с концентрацией IЬ-4 ^=0,68, р<0,05).
Сывороточный уровень суммарной фракции молекул адгезии CD50 у женщин с доброкачественной опухолью матки был достоверно увеличен в 3,1 раза по сравнению с нормой (178,4±48,3 U/ml) и коррелировал с концентрацией ^N7 ^=0,61, р<0,05). Сывороточное содержание молекул CD50 у женщин, больных раком эндометрия, находилось в пределах нормальных значений (65,4±8,6 U/ml). При этом уровень растворимых молекул CD50 в сыворотке крови таких больных был в 2,7 раза ниже, чем у больных миомой матки (рис. 3).
350
U/ml
*
Г*1 *
-ь
1+
1
sCD8 olsCD8
□ Здоровые доноры □ Миома матки □ Рак эндометрия
РИС. 1.
Содержание растворимых молекул CD8 в сыворотке крови больных миомой матки и раком эндометрия.
* - статистически значимые различия с нормой (р<0,05).
600-
и/т| 500 -
400-1_____Т______________I____гН I________гЬ
■ь
ЙІ
300200100 о
бС038 оібС038 вС025 оібС025
□ Здоровые доноры □ Миома матки □ Рак эндометрия
РИС. 2.
Содержание растворимых дифференцировочных молекул в сыворотке крови больных миомой матки и раком эндометрия.
300
U/ml
250
200-
150-
100-
50-|— 0
ft
ж
[ЇІ
ffl
БСОІв эС050 оІвСОбО зСй54 о1вС054
□ Норма □ Миома матки □ Рак эндометрия
РИС. 3.
Содержание растворимых форм молекул адгезии в сыворотке крови больных миомой матки и раком эндометрия.
* - статистически значимые различия с нормой (р<0,05),
▼ - статистически значимые различия между миомой матки и раком эндометрия (р<0,05).
U/ml
500
400
300
200
100
0
*
■ ■
—і— Т
1
SCD18-50
SCD18-54
□ Норма □ Миома матки □ Рак эндометрия
РИС. 4.
Содержание растворимых комплексов молекул адгезии в сыворотке крови больных миомой матки и раком эндометрия.
* - статистически значимые различия с нормой (р<0,05),
▼ - статистически значимые различия между миомой матки и раком эндометрия (р<0,05).
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
Как в первом, так и во втором случае обнаружено статистически достоверное повышение относительного содержания CD50+ мононуклеарных клеток. При миоме матки оно было повышено в 2,2 раза, при раке эндометрия - в 1,5 раза (р<0,05). Различий в содержании CD50+ клеток у больных с доброкачественной и злокачественной патологией не выявлено (р<0,05) (таблица 2).
Уровень ассоциатов CD18-CD50 как в сыворотке крови больных миомой матки, так и раком эндометрия, не обнаруживал статистически достоверных изменений в сравнении с нормой. Однако при миоме матки была выявлена значительная тенденция к увеличению этого показателя, характеризующаяся большим разбросом данных и коррелирующая с содержанием в сыворотке крови ^N7 ^=0,6, р<0,05) (рис. 4). Несмотря на отсутствие достоверных изменений в содержании CD18-CD50 комплексов у больных раком эндометрия была выявлена связь между данным показателем и концентрацией IЬ-4 ^=0,68, р<0,05).
Как следует из представленных данных, характер изменения сывороточного уровня растворимых форм мембранных антигенов и цитокинов различается при доброкачественных и злокачественных новообразованиях матки. Так, концентрация ^-10 по сравнению с нормой увеличивалась только у больных раком эндометрия, при миоме она оставалась в пределах нормы. Схожим образом изменялся сывороточный уровень растворимых комплексов CD18-CD54, при миоме он оставался в пределах нормы, а при раке эндометрия увеличивался почти вдвое. Кроме того, при раке эндометрия снижалось относительное содержание Ь^А 1+ мононуклеарных клеток. Падение относительного содержания таких клеток крови у больных раком эндометрия отражает снижение плотности экспрессии молекул ЫА I класса в условиях иммунодефицита, развивающегося на фоне злокачественного неопластического процесса.
Концентрация ^-12 и ^N-7 увеличивалась как при раке эндометрия, так и при миоме матки. Сходным образом менялось сывороточное содержание суммарной и олигомерной фракций растворимых молекул CD8, олигомерной формы молекул CD50 и суммарной фракции растворимых молекул СР54. Кроме того, выявлено повышение относительного содержания CD8+, CD25+, CD38+ и CD54+ мононуклеарных клеток. Однако, относительное содержание CD18+ и CD50+ мононуклеарных клеток повышалось только при миоме матки.
Между сывороточным уровнем растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы и концентрацией цитокинов обнаружен ряд корреляционных взаимосвязей. При миоме матки отсутствовали корреляционные связи между сывороточным содержанием растворимых диффе-ренцировоных молекул и концентрацией ^-4. Однако, обнаруживались связи между сывороточным уровнем суммарных и олигомерных фракций молекул адгезии, а также их комплексов, и содержанием ^N7 и И-10. При раке эндометрия корреляции между сывороточным уровнем растворимых
молекул адгезии и ^N7 отсутствовали. Обнаруживались лишь корреляции между сывороточным содержанием растворимых молекул адгезии и концентрацией IЬ-4 и ^-10, отражающих состояние ТЬ2 звена иммунитета.
Заметим, что сывороточное содержание суммарной и олигомерной фракции растворимых молекул CD50 коррелировало с концентрацией ^N7 только при миоме матки, а содержание суммарной и олигомерной фракции растворимых молекул CD54 коррелировало с концентрацией И-4 только при раке эндометрия. Сывороточное содержание растворимых дифференцировочных молекул CD18 обнаруживало статистически значимую связь с содержанием ^-10 как при миоме матки, так и при раке эндометрия. В то же время сывороточные уровни растворимых ассоциатов CD18-CD54 и CD18-CD50 коррелировали с концентрацией ^N7 у больных миомой матки и с концентрацией IЬ-4 у больных раком эндометрия.
Таким образом, имеются различия в состоянии пула растворимых дифференцировочных молекул периферической крови больных миомой матки и раком эндометрия, ассоциированные с цитокиновым статусом больных.
ЛИТЕРАТУРА
1. Новиков В.В., Барышников А.Ю., Караулов А.В. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы. Иммунология. 2007. № 4. С. 249-252.
2. Бабаев А.А., Ятманова Т.А., Кравченко Г.А., Новиков В.В. Обнаружение растворимых комплексов молекул адгезии в сыворотке крови человека и их уровень у больных острым гепатитом В. Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, серия Биология. Н. Новгород: ННГУ, 2006. Вып. 1. № 11. С. 128-132.
3. Новиков В.В., Бабаев А.А., Кравченко Г.А., Манакова Э.А., Пашина Л.А., Марных С.А., Караулов А.В. Растворимые ассоциаты молекул адгезии CD54 и CD18 в сыворотке крови человека. Иммунология. 2008. № 4. С. 220-223.
4. Новиков В.В., Гостюжова Е.А., Караулов А.В., Самойлова О.С., Бабаев А.А., Волкова С.А., Новиков Д.В., Д.В. Кокушков, Барышников А.Ю. Состояние пула растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы при острых лейкозах. Российский иммунологический журнал. 2009. № 2. С. 164-170.
5. Варшавская Л.В., Алясова А.В., Барышников А.Ю., Новиков В.В. Мембранная и растворимая формы CD50 (!САМ-3)-антигена при раке молочной железы. Российский биотерапевтический журнал. 2004. № 2. С. 17-18.
6. Алясова А.В., Варшавская Л.В., Новиков В.В., Барышников А.Ю. Динамика растворимого CD50 антигена у больных раком молочной железы в процессе комплексного лечения. Клиническая и лабораторная диагностика. 2004. № 3. С. 42-43.
7. Варшавская Л.В., Алясова А.В., Кравченко Г.А., Тагиров О.Т., Козлов А.Ю., Новиков В.В., Барышников А.Ю. Повышенное содержание растворимых CD50 и CD38 антигенов в сыворотке крови при солидных опухолях. Вестник Нижегородского госуниверситета, Серия Биология. 2002. Вып. 1. № 4. С. 183-188.
8. Новиков В.В., Караулов А.В., Барышников А.Ю. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы. М.: Изд-во МИА, 2008. 243 с.
9. Новиков В.В., Караулов А.В., Барышников А.Ю., Кравченко Г. А., Бабаев А. А., Гостюжова Е. А. Особенности структурного состояния пула растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы. Молекулярная медицина. 2009. № 4. С. 27-32.
