CC BY
12
ч СПбГМУ
ЛИТЕРАТУРА
1. Владимиров, Ю. А. Физико-химические основы фотобиологических процессов / Ю. А. Владимиров, А. Я. Потапенко. - М. : Высшая школа, 1989.
2. Armstrong, D. A. Sulfur - centered reactive intermediates in chemistry and biology / D. A. Armstrong // Plenum Press. - 1990. - P. 121-341.
3. Faassen, E. Low-molecular weight S-nitrosothiols / E. Faassen, A. Vanin // Radicals for life : various forms of nitric oxide. - 2007. -P. 173-195.
4. Hart, T. W. Some observation concerning S-nitroso and phenyl-sulphonyl derivatives of L-cysteine and glutathione / T. W. Hart // Tetrahedron Lett. - 1985. - Vol. 26. - P. 2013-2016.
5. Hogg, N. Biological chemistry and clinical potential of S-nitrosothiols. Free Rad / N. Hogg // Biol. Chem. - 2000. - Vol. 28. -P. 1478-1486.
6. Hu, T. -M. The kinetics of thiol-mediated decomposition of S-nitrosothiols / T.-M. Hu, T.-C. Chou // AAPS. - 2006. - Vol. 8. -Article 57. - P. 485-492.
7. Leecharoen, R. Photodinamic release of nitric oxide from nitro-sothiols of glutathione, and serum albumin studied by transient absorption and transient circular dichroism spectroscopy / R. Leecharoen. -Pittsburg, 2005. - 58 p.
8. Liu, L. Essential roles of S-nitrosothiols in vascular homeostasis and endotoxic shok / L. Liu [et al] // Cell. - 2004. - Vol. 116. - P. 617-628.
9. Mutus, B. Evidence for peroxynitrite formation during S- nitro-soglutathione photolysis in air saturated solutions / B. Mutus, R. Redmond, S. Anter // FEBS Lett. - 1999. - Vol. 449. - P. 79-82.
10. Rodriguez, J. Chemical nature of nitric oxide storage forms in rat vascular tissue / J. Rodriguez [et al] // PNAS. -2003. - Vol. 100. -P. 336-341.
11. Rotta, J. C. G. Nitric oxide release from the S-nitrosothiol zink phthalocyanine complex by flash photolysis / J. C. G. Rotta [et al] // Braz. J. Med. Biol. Res. - 2003. - Vol. 36. - № 5. - P. 587-594.
12. Singh, R. Photosensitized decomposition of S-nitrosothiols and 2-methyl -2-nitrosopropane. Possible use for site-directed nitrite oxide production / R. Singh [et al] // FEBS Lett. - 1995. - Vol. 360. -P. 47-51.
РЕЗЮМЕ
Л. А. Александрова, И. В. Александров, Г. В. Папаян, А. А. Жлоба, Н. Н. Петрищев,
Влияние света оптического диапазона на декомпозицию S-нитрозоглютатиона
Изучали декомпозицию синтезированного S-нитрозоглютатиона (GSNO) in vitro в 5-минутном интервале времени в аэробной и анаэробной среде. В качестве источника света использовали ртут-но-кварцевую лампу типа ПРК-4. В анаэробной среде скорость декомпозиции была снижена на 20 %. В условиях экспозиции светом видимой области спектра излучения лампы, выделенной с помощью светофильтра ОС-11, декомпозиция GSNO происходила с одинаково низкой скоростью как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Преэкспозиция раствора GSNO светом УФ-диапазона, выделенного с помощью светофильтра УФС-6, в течение 1 мин приводила к достоверному (р<0,05) увеличению скорости декомпозиции GSNO. В аэробных условиях при этом скорость декомпозиции была на 14 % выше, чем в анаэробных. Предполагается возникновение в аэробной среде в результате первичной УФ-фото-химической реакции дополнительного хромофора, способного поглощать видимый свет в области 500 нм.
Ключевые слова: S-нитрозоглютатионы, УФ-облучение.
SUMMARY
L. A. Alexandrova, I. V. Alexandrov, G. V. Papajan, A. A. Zhloba, N. N. Petrizhev
Influence of optical light irradiation on S-Nitrosogluta-thione decomposition
The photodecomposition of synthesized S-Nitrosoglutathione (GSNO) was investigated in aerated and deaerated solutions in vitro. The exposure was provided by mercury-quartz lamp «ПРК-4» type. The rate of GSNO decomposition in deaerated solution was 20 % lower than that in aerated solution. The visible light exposure through the light filter «OC-11» showed no differences in the GSNO decomposition rate either in aerated or in deaerated solutions. One minute preexposure of the GSNO solutions to UV-light emitted through the light filter «UVS-6» resulted in a significant (p<0.05) increase of GSNO decomposition rate. In aerated solutions the rate was 14 % higher than in deaerated ones. We assume that an additional chromophor absorbing visible light in the range of 500-550 nm may appear in the aerated solution as a result of primary UV-photochemicall reaction.
Key words: S-Nitrosoglutathiones, UV-irradiation.
© Н. А. Бархатова, 2009 г.
УДК 616-018:616.9-07: [616-006-002.54+615.276.2]
Н. А. Бархатова
ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ И РЕЦЕПТОРНОГО АНТАГОНИСТА ИНТЕРЛЕЙКИНА-1 ПРИ ЛОКАЛЬНОЙ И ГЕНЕРАЛИЗОВАННОЙ ФОРМАХ ИНФЕКЦИИ МЯГКИХ ТКАНЕЙ
Челябинская государственная медицинская академия
В настоящее время все большее число исследователей и врачей различных специальностей считают оправданным и необходимым внедрение в клиническую практику новой классификации септических состояний, принятой на Международной Согласительной конференции в г. Чикаго в 1991 г. [1, 2, 5, 6]. Однако использование предложенных критериев сепсиса и выделение синдрома системной воспалительной реакции требует пересмотра ранее устоявшихся в отечественной гнойной хирургии постулатов патофизиологии, клиники и диагностики сепсиса [1, 2, 5]. Ранее используемый диагноз токсико-резорб-тивной лихорадки на фоне гнойной инфекции теперь требует уточнения и разграничения с современным понятием сепсиса [3]. В последние годы при гнойно-некротических заболеваниях мягких тканей клиника синдрома системного воспалительного ответа, по различным дан-
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ СПбГМУ ИМ. АКАД. И. П. ПАВЛОВА • ТОМ XVI • №2 • 2009
ным, определяется в 62,5-77,6 %, при этом доля тяжелого сепсиса порой составляет от 2 до 18 % [2, 5]. Несмотря на современные достижения клинической медицины, при тяжелом сепсисе и септическом шоке показатель летальности остается на высоком уровне, составляя от 12 до 60 %, и не имеет тенденции к снижению [1, 3, 4].
Именно эти обстоятельства определяют необходимость всестороннего изучения генерализованных форм инфекции мягких тканей, поиск современных достоверных маркеров сепсиса, используемых для диагностики и мониторинга эффективности терапии, а также оправдывают разработку новых подходов и методов лечения и профилактики данной патологии.
Целью настоящего исследования было определение частоты встречаемости локальной и генерализованных форм инфекции при гнойно-некротических заболеваниях мягких тканей и определение диагностической ценности исследования уровня и динамики провоспалительных и противовоспалительных цитокинов крови при данной патологии.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Проанализированы результаты лечения 2250 больных с различными гнойно-воспалительными заболеваниями мягких тканей, получивших стационарное лечение в период с 1998 по 2007 гг. в условиях гнойного хирургического отделения МУЗ ГКБ № 1 г. Челябинска. Диагностику септических состояний у данных больных проводили согласно классификации, принятой в г. Чикаго в 1991 г. [6]. В ходе исследований все больные были разделены на две группы. Основную группу составили 1238 человек (55,1 %) с генерализованными формами инфекции, у которых регистрировали синдром системной воспалительной реакции различной степени тяжести (ССВР2-4) в течение 5,7±0,12 суток. В группу сравнения были включены 1012 пациентов (44,9 %) с локальной формой инфекции, при которой отмечали не более одного симптома системной воспалительной реакции (СВР0-1).
Для подтверждения диагноза больным обеих групп производили комплексное клинико-лабораторное обследование. Учитывая принятую в настоящее время концепцию системной цитокинемии как ведущей причины раз-
Таблица
Исходная концентрация ФНО и ИЛ-1РА крови при локальных и генерализованных формах инфекции мягких тканей
Форма инфекции Тяжесть СВР Количество больных в подгруппе Средняя концентрация цитокинов (пг/мл)
ФНО ИЛ-1РА
Локальная форма (п=25) СВР0 10 0,2±0,03*,0 321,22±45,1*
СВР1 15 1,4±0,15* 412,16±61,5*
Генерализованная форма ССВР2 26 3,5±0,25*,00 1292,3±37,3*,00
(п=75) ССВР3 27 8,6±0,68* 2009,9±60,6*
ССВР4 22 16,7±0,72* 1419,9±46,5*
Примечание: выделенные жирным шрифтом значения показателей превышают норму; * достоверное отличие показателей в зависимости от тяжести системной воспалительной реакции (СВР0 ССВР4), р<0,05; 0 достоверное отличие показателей между подгруппами (СВР0 1) с локальной формой инфекции, р<0,05; 00 достоверное отличие показателей между подгруппами (ССВР2 4) с генерализованными формами инфекции, р<0,05 (критерий Рускала Уоллиса).
вития сепсиса, у 100 пациентов из обеих групп дополнительно была исследована динамика концентрации фактора некроза опухоли (ФНОа) и рецепторного антагониста интерлейкина-1 (ИЛ-1РА). Исследования проводили методом иммуноферментного анализа с моноклональны-ми антителами.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Первоначальное исследование уровня цитокинов производили до выполнения оперативного вмешательства или в первые 10-12 часов после адекватного оперативного вмешательства (табл. 1).
Полученные данные указывают на наличие прямой зависимости между исходным уровнем цитокинов и степенью тяжести синдрома системной воспалительной реакции. При генерализованных формах инфекции уровень ФНОа увеличивался при синдроме легкой степени (ССВР2) в 1,5 раза, при синдроме средней степени (ССВР3) -в 3,5 раза и при тяжелой степени (ССВР4) - в 6,7 раза больше нормы (р<0,01). При локальных формах инфекции (СВР0-1) концентрация ФНОа оставалась в пределах нормы.
Увеличение уровня ИЛ-1РА также было связано с наличием системного воспалительного ответа, но максимальное повышение показателя в 2 раза от нормы мы наблюдали при синдроме системной воспалительной реакции средней степени (ССВР3), а при легкой (ССВР2) и тяжелой степени (ССВР4) системного ответа уровень ИЛ-1РА увеличивался соответственно на 30 и 40 % (р<0,01).
При определении взаимосвязи между исходным уровнем цитокинов и особенностями клинических проявлений инфекции мягких тканей следует учесть тот факт, что исследуемые регуляторные цитокины являются функциональными антагонистами. ФНОа - провоспалительный цитокин, а ИЛ-1РА - противовоспалительный. ФНОа выделяют макрофаги и моноциты, их доля среди клеточного состава периферической крови незначительна, при этом истинным биологическим действием обладает не свободная, а связанная с клетками-мишенями фракция ФНОа [5]. Циркулирующие в кровотоке «свободные молекулы» данного вещества обладают более слабым биологическим действием и лишь частично отражают степень активности клеток - их продуцентов. Иная ситуация с противовоспалительным цито-кином ИЛ-1РА. Данное вещество вырабатывается циркулирующими в крови активированными нейтрофи-лами. Доля нейтрофилов среди клеток крови значительна, а действие данного цитокина предполагает свободную его циркуляцию в системном кровотоке. Немаловажен тот факт, что, несмотря на противовоспалительный эффект рецепторного антагониста ИЛ-1, его
ч СПбГМУ
максимальное увеличение мы наблюдали в острой фазе воспаления, вероятно, за счет включения в биологический процесс компенсаторной противовоспалительной реакции.
Анализируя эти данные, можно предположить, что увеличение концентрации провоспалительных цитокинов приводит к развитию аутоагрессии в отношении собственных тканей и органов и определяет развитие синдрома системного воспалительного ответа, септического шока и ранней полиорганнной недостаточности. В то же время чрезмерная активность противовоспалительной системы может привести к гипоэргической ответной воспалительной реакции, которая проявится вялым течением раневого процесса, а при наличии достаточно высокой степени патогенности возбудителей инфекции приведет к стойкой бактериемии (септицемии), которую ранее считали одним из основных критериев сепсиса.
Еще в 1994 г. R. Bone высказал гипотезу о наличии при бактериальной агрессии ответной активации не только провоспалительной системы, но и компенсаторной противовоспалительной реакции, уравновешивающей биологическое действие первой [6]. Если придерживаться данной позиции, становится очевидной клиническая и прогностическая значимость определения этих цито-кинов при гнойно-некротических заболеваниях мягких тканей.
На наш взгляд, наиболее важное клиническое и прогностическое значение из этих двух цитокинов имеет уровень рецепторного антагониста ИЛ-1. Его повышенная или нормальная концентрация при любых отклонениях от нормы провоспалительных цитокинов снижает риск развития системной воспалительной реакции, а при манифестации системного воспалительного ответа увеличивает вероятность благоприятного течения и быстрого купирования общей клинической симптоматики. В то же время относительно низкий уровень ИЛ-1 РА на фоне про-воспалительной цитокинемии значительно увеличивает риск быстрой генерализации инфекционного процесса с формированием вторичных очагов инфекции и септического шока, ввиду несостоятельности ответных компенсаторных противовоспалительных механизмов.
Следует отметить, что у больных, в зависимости от формы инфекции и продолжительности сохранения синдрома системного воспалительного ответа, отмечали различные сроки нормализации этих показателей. В ходе исследований была выявлена достоверная разница концентрации этих показателей у пациентов с продолжительностью сохранения синдрома системного воспалительного ответа менее и более 72 часов от начала адекватного комплексного лечения (табл. 2).
Согласно полученным данным, при локальной форме инфекции (СВР01)
уровень цитокинов оставался в пределах нормы, причем ФНО не превышал 1пг/мл и ИЛ-1РА был ниже 650 пг/мл. При кратковременном синдроме системного воспалительного ответа (ССВР2-4<72ч) исходно ФНО не превышал 3 пг/мл, а ИЛ-1РА был выше 1500 пг/мл в первые 5 суток лечения. В последующем в этой подгруппе ФНО с 3-х суток соответствовал норме, а ИЛ-1 РА достигал нормы лишь к 10-14-м суткам. При продолжительном сохранении синдрома системного воспалительного ответа (ССВР2-4>72 ч), которое мы расценивали как проявление сепсиса, уровень ФНО был выше 6 пг/мл в течение первых 10-ти суток лечения, а ИЛ-1РА не превышал 1400 пг/мл первые 3-е суток стационарного лечения или сохранял нормальный уровень. В последующем нормализация ФНО происходила к 15-20-м суткам, а ИЛ-1РА соответствовал норме у всех больных данной подгруппы уже со 2-3-х суток.
Максимальные отклонения всех исследуемых маркеров и цитокинов были отмечены в первые 3-е суток от момента госпитализации и имели характерную разницу, а также взаимосвязь с продолжительностью сохранения синдрома системного воспалительного ответа. Так, увеличение концентрации ИЛ-1РА более 1500 нг/мл при уровне ФНО не более 3 пг/мл чаще всего сопровождалось кратковременным (<72 ч) сохранением синдрома системного воспалительного ответа, возможно, за счет выраженной компенсаторной реакции противовоспалительной системы. В то же время при уровне ИЛ-1РА ниже 1500 пг/мл с концентрацией ФНО более 6 пг/мл, как правило, отмечали синдром системного воспалительного ответа, сохраняющийся более 72 часов от начала адекватного лечения. Сроки нормализации ФНО совпадают с динамикой клинической картины. Кратковременный синдром системного ответа сопровождает длительное увеличение ИЛ-1РА, а быстрая его нормализация в течение первых 2-3-х суток более характерна для сепсиса.
Сопоставление этих данных и особенностей клиники позволяет предполагать, что сохранение синдрома сис-
Таблица 2
Динамика уровня ФНО и ИЛ-1РА у больных с локальными и генерализованными
формами инфекции
Группа
1 2-е сут.
3 4-е сут.
5 9-е сут.
10 14-е сут.
15 20-е сут.
ФНО (0 2,5 пг/мл)
Сравнения (n=25) 0,72±0,04 0,5±0,06 0,2±0,02 0
Основная (n=75) 7,8±0,7 * 6,2±0,5 * 4,1±0,4 * 2,3±0,2 * 1,3±0,7
ССВР2 4<72 ч (n=27) 2,7±0,08 0 2,1±0,06 0 1,3±0,08 0 0,4±0,08 0 0
ССВР2 4>72 ч (n=48) 10,6±0,6 9,7±0,3 6,2±0,3 3,4±0,1 1,3±0,1
ИЛ-1 РА (50 1000 пг/мл)
Сравнения(n=25) 386±51 343±32 287±24 275±25 258±21
Основная (n=75) 1432±43 * 1437±37 * 1032±45 * 784,6±30 * 537±12 *
ССВР2 4<72ч (n=27) 1706±400 1645±340 1325±300 976±230 520±16
ССВР2 4>72ч (n=48) 1280±23 1211±19 894±18 503±11 576±12
Примечание: выделенные жирным шрифтом показатели превышают норму; * достоверное отличие показателей между группами с локальной и генерализованной инфекцией, р<0,01; 0 достоверное отличие показателей между подгруппами с различной продолжительностью синдрома системного воспалительного ответа (ССВР2 4<72 ч и ССВР2 4>72 ч), р<0,05 (критерий Манна Уитни).
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ СПбГМУ ИМ. АКАД. И. П. ПАВЛОВА • ТОМ XVI • N02 • 2009
темного ответа в течение 24-72 часов после адекватного оперативного вмешательства является проявлением остаточного системного действия медиаторов воспаления, поступивших в системный кровоток из очага инфекции в острой фазе воспаления, на фоне незавершенного процесса их метаболизма. В то же время сохранение синдрома системного ответа более 72 часов после адекватной санации очага инфекции говорит о развитии плохоуправ-ляемой вторичной системной провоспалительной цито-кинемии, при неспецифической генерализованной активации иммунокомпетентных клеток вне очага воспаления, что соответствует клинике различных форм сепсиса. При локальных формах инфекции уровень цитокинов в крови изменяется незначительно или остается в пределах нормы, что и определяет отсутствие системных проявлений воспалительного ответа или быстрое купирование отдельных его симптомов.
ВЫВОДЫ
Среди больных с гнойно-некротическими заболеваниями мягких тканей в 13 % случаев имел место кратковременный (<72 ч) синдром системной воспалительной реакции, у 42 % больных отмечали клинику сепсиса, а у 45 % пациентов была локальная форма инфекции. Проведенные исследования подтверждают тот факт, что клинические проявления синдрома системного воспалительного ответа сопровождаются увеличением концентрации ФНОа и рецепторного антагониста ИЛ-1 от 1,5 до 7 раз. Причем тяжесть системного воспалительного ответа и клиническая форма инфекции зависят не столько от степени увеличения показателей, сколько от соотношения уровня данных показателей. Наличие дисбаланса показателей со значительным превалированием провоспалительного цитокина ФНОа при нормальной или сниженной концентрации противовоспалительного ИЛ-1РА чаще сопровождается клиникой сепсиса. При этом для кратковременного (<72 ч) синдрома системного воспалительного ответа характерна быстрая нормализация уровня ФНОа при длительном сохранении повышенной концентрации противовоспалительного ИЛ-1РА. При локальных формах инфекции уровень цитокинов остается в пределах нормы на протяжении всего периода лечения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ерюхин, И. А. Инфекция в хирургии. Старая проблема на кануне нового тысячелетия. Ч. 1 / И. А. Ерюхин // Вестник хирургии. - 1998. - Т. 157. - № 1. - С. 85-91.
2. Исаков, Ю. Ф. Сепсис у детей / Ю. Ф. Исаков, Н. В. Белобо-родова. - М. : Мокеев, 2001. - 368 с.
3. Костюченко, А. Л. Интенсивная терапия послеоперационной раневой инфекции и сепсиса / А. Л. Костюченко, А. Н. Бельс-ких, А. Н. Тулупов. - СПб. : Фолиант, 2000. - 448 с.
4. Кузин, М. И. Раны и раневая инфекция / М. И. Кузин, Б. М. Костюченок. - М. : Медицина, 1990. - 447 с.
5. Мороз, В. В. Сепсис : клинико-патофизиологические аспекты интенсивной терапии / В. В. Мороз [и др.]. - Петрозаводск : ИнтелТек, 2004. - 291 с.
6. Bone, R. G. Let's agree on terminology : definition of sepsis / R. G. Bone // Crit. Care Med. - 1991. - Vol. 19. - № 7. - P. 973-976.
РЕЗЮМЕ
Н. А. Бархатова
Диагностическая ценность исследования фактора некроза опухоли и рецепторного антагониста интерлейкина-1 при локальной и генерализованной формах инфекции мягких тканей
Приведены результаты исследования 2250 больных с различными формами инфекции мягких тканей. Среди них в 13 % случаев имел место синдром системной воспалительной реакции, у 42 % больных отмечали клинику сепсиса, а у 45 % пациентов была локальная форма инфекции. У 100 случайно выбранных пациентов дополнительно исследовали концентрацию ФНОа, и ИЛ-1 РА методом иммуноферментного анализа с моноклональными антителами. Было выявлено, что клинические проявления синдрома системного воспалительного ответа сопровождаются достоверным увеличением концентрации ФНОа и ИЛ-1РА от 1,5 до 7 раз от нормы. Наличие дисбаланса показателей со значительным превалированием ФНОа при нормальной или сниженной концентрации ИЛ-1РА сопровождается сохранением синдрома системной воспалительной реакции более 72 часов после адекватной операции, что является признаком сепсиса. Сопоставимое по уровню увеличение обеих показателей характерно для синдрома системного воспалительного ответа, продолжительностью не более 48-72 часов. А при локальных формах инфекции мягких тканей уровень цитокинов остается в пределах нормы. Эти данные определяют диагностическую и прогностическую ценность исследования данных маркеров в клинике.
Ключевые слова: фактор некроза опухоли, рецепторный антагонист интерлейкина-1, инфекции мягких тканей.
SUMMARY
N. A. Barkhatova
Diagnostic value of TNF-a and IL-1RA assessment in local and generalized forms of the soft tissue infection
The paper presents 2250 patients with various forms of the soft tissue infection: systemic inflammatory response syndrome (13 %), clinically pronounced sepsis (42 %), and local infection (45 %). Concentrations ofTNFa and IL-1RA were assessed by method oflFA with monoclonal antibodies in 100 randomized patients. Clinical manifestations of systemic inflammatory response were found to be accompanied by significant increase of TNFa and IL-1RA concentration - 1.5 up to 7 times vs the norm. Disbalance in the indices with marked prevalence of TNF-a values versus normal or lowered concentration of IL-1 RA was accompanied by stable systemic inflammatory response syndrome of more than 72 hours duration after an adequate operation - the fact attributable to sepsis. The comparable increase of both parameters is characteristic of the systemic inflammatory response syndrome of48-72 h duration. In local forms of the soft tissue infection the IL-1 RA level remained within normal limits. The findings prove diagnostic and prognostic value of assessment of the markers in hospital settings.
Key words: tumour necrosis factor, IL-1RA, soft tissue infections.
V*/
ч СПбГМУ
© Коллектив авторов, 2009 г. УДК 616.441-07:575.224
М. И. Зарайский, Д. Ю. Семенов, М. Е. Борискова, И. Ю. Сабурова, П. А. Панкова, Н. С. Фещенко, В. Г. Чаусова, У. В. Фарафонова, О. А. Пестерова
ЗНАЧЕНИЕ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИИ ГЕНА ВЯДР В ДООПЕ-РАЦИОННОЙ ДИАГНОСТИКЕ РАКА ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Кафедра клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины, кафедра общей хирургии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И. П. Павлова
Узловые образования щитовидной железы (У ОЩЖ) обнаруживают у 5-70 % населения [1, 2]. Актуальность проблемы дифференциальной диагностики УОЩЖ заключается в том, что, по некоторым данным, от 10 до 22 % солитар-ных узлов щитовидной железы являются злокачественными, а почти в 90 % случаев рак щитовидной железы на ранних стадиях развивается под маской узлового зоба [3].
Традиционно для дифференциальной диагностики УОЩЖ используется тонкоигольная аспирационная биопсия (ТАБ) под контролем УЗИ с последующим цитологическим исследованием биоптата. Однако цитологический метод имеет ряд ограничений, а именно - получение при ТАБ неинформативных и неопределенных результатов. Неопределенные результаты ТАБ составляют около 30 % [10, 12] и связаны с отсутствием точных цитологических критериев для дифференциальной диагностики ряда доброкачественных и злокачественных заболеваний щитовидной железы (ЩЖ). Невозможность на дооперационном этапе имеющимися методами исключить опухолевую природу узла ЩЖ является показанием к выполнению диагностической операции. При хирургическом вмешательстве лишь в 15-20 % неопределенных результатов цитологического исследования выявляется злокачественный процесс [5]. На сегодняшний день окончательный диагноз может быть установлен только в результате гистологического исследования.
Поиск новых методов дооперационной дифференциальной диагностики узловых образований ЩЖ является одной из актуальных проблем современной тироидоло-гии, что позволило бы улучшить диагностику рака ЩЖ и сократить количество диагностических операций. Исследование событий молекулярного уровня занимает ведущее место в определении патогенеза различных форм рака ЩЖ и, соответственно, может быть применено и в диагностических целях.
Целью настоящей работы являлось выявление значимости наличия мутации У600Е в гене БИЛЕ в доопераци-онной диагностике рака ЩЖ.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Характеристика групп пациентов. В исследование были включены 30 пациентов, обследованных на базе кафедры клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины и оперированных на кафедре общей хирургии СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова в период с 2007 по 2008 гг. Средний возраст пациентов составил 49 ± 8,5 года; соотношение мужчин и женщин - 1:9,7 соответственно. Всем пациентам было выполнено стандартное клиническое и ультразвуковое обследования. У 65 % пациентов узлы ЩЖ были выявлены впервые, 35 % пациентов наблюдались у эндокринолога по поводу доброкачественных заболеваний щитовидной железы, у 10 % из них в анамнезе имелись оперативные вмешательства на ЩЖ по поводу доброкачественных заболеваний в объеме гемитироидэктомия с истмусэктомией.
Всем пациентам до операции контролем УЗИ была выполнена ТАБ с последующим цитологическим исследованием аспирата в цитологической лаборатории ЦЛД СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова (табл. 1). На основании цитологического диагноза пациенты были разделены на три группы:
1) пациенты с коллоидным зобом;
2) пациенты с папиллярным раком;
3) пациенты, у которых на основании цитологического заключения нельзя было исключить злокачественную природу узла. Окончательная верификация диагноза проводилась по данным послеоперационного гистологического исследования.
Выявлениемутации V600E гена BRAF. Геномная ДНК выделялась из пункционного материала с помощью набора «ДНК-ГС» («ДНК-Технология», Россия).
Амплификация проводилась на приборе «Терцик» («ДНК-технология», Россия) по стандартной двухпрай-мерной схеме в конечном объеме 10 мкл. Реакционная смесь содержала 2 мкл ДНК, 14 pMол каждого праймера, смесь дНТФ в конечной концентрации 240 мкМол и 2,5 единиц термостабильной Taq ДНК-полимеразы (Helicon, Россия) в стандартном ПЦР буфере с содержанием 15 мМол Mg2+. Последовательности используемых праймеров: обратный праймер (общий для дикого и му-тантного аллелей гена BRAF) «RP-BRAF» 5'-GGCCAA AATTTAATCAGTGGA-3' и 2-а прямых праймера: «FW-BRAF» 5'-TAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGT-3' для «дикого» типа и «FM-BRAF» 5'-GGTGATTTTGGTCTAGCT ACAAA-3' для мутантного типа гена [15]. Программа амплификации состояла из начальной денатурации (96 оС, 3 мин), 40 циклов, включавших денатурацию (94 оС, 20 с), отжиг праймеров (61 оС, 30 с), элонгацию
Таблица 1
Распределение пациентов по группам в зависимости от цитологического диагноза
Количество пациентов Результат ТАБ
9 Доброкачественый (УКЗ)
12 Злокачественный (ПР)
9 Неопределенный (ФО)
