CC BY
260
Действие редко- и плотноионизирующего излучения на популяцию
Chlorella vulgaris
Ляпунова Е.Р., Комарова Л.Н.
ИАТЭ НИЯУ МИФИ, Обнинск, Россия
Несмотря на интенсивные исследования проблемы относительной биологической эффективности (ОБЭ) ионизирующих излучений, различающихся по линейной передаче энергии (ЛПЭ), механизмы, обуславливающие различие ОБЭ, не до конца выяснены. В работе представлен сравнительный анализ результатов действия редко- и плотноионизирующего излучения на культуру зелёной одноклеточной водоросли Chlorella vulgaris. Продемонстрировано, что кривые выживаемости для обоих видов излучения имеют экспоненциальный вид, что отличает хлореллу от других исследованных биологических объектов, у которых после действия редкоионизирующего излучения кривая выживаемости сигмоидна. При этом, как и у других объектов, облучение а-частицами вызывает значительно большую гибель клеток микроводоросли при условии облучения в одних и тех же дозах. Впервые для клеток Chlorella vulgaris обнаружены разные формы гибели в результате действия ионизирующего излучения: гибель «под лучом», апоптотическая гибель после нескольких делений и некротическая гибель, как до деления, так и после нескольких делений. Показано, что при изоэффективных дозах воздействия обоих видов излучения выход клеток, погибших «под лучом», практически в 2 раза выше такового после действия у-квантов для клеток в логарифмической фазе роста и 1,5 раза - в стационарной фазе. Полученные в работе экспериментальные результаты будут способствовать пониманию различия механизмов инактивации эукариотических клеток ионизирующим излучением с разной ЛПЭ.
Ключевые слова; у-излучение, а-частицы, линейная передача энергии (ЛПЭ), Chlorella vulgaris, относительная биологическая эффективность (ОБЭ), инактивация клеток, формы гибели клеток, кривые выживаемости, логарифмическая стадия роста, стационарная стадия роста, апоптоз, некроз.
Загрязнение значительных территорий радионуклидами в результате ядерных инцидентов приводит не только к увеличению внешнего фона излучения, но и их накоплению в тканях организма. Это предопределяет сложную картину радиационной нагрузки на биоту. Исследования биологических эффектов различных видов ионизирующего излучения в широком диапазоне доз, определение типичных изменений и особенностей структурных и функциональных нарушений в биологических системах актуальны в связи с всё возрастающим негативным техногенным влиянием на различные экосистемы. Особенную актуальность приобретает изучение действия редко- и плотноионизирующего излучения на биообъекты разной степени сложности, а также проблема относительной биологической эффективности (ОБЭ) ионизирующих излучений с разной линейной передачей энергии (ЛПЭ). Интенсивное изучение действия излучений, различающихся по ЛПЭ в широком диапазоне, на клетки про- и эукариот было начато в конце 50-х годов, после создания первых ускорителей многозарядных ионов. В результате этих исследований было установлено [1-3], что зависимость ОБЭ от ЛПЭ носит сложный и неоднозначный характер. Для её объяснения были предложены многочисленные математические модели, основанные на учёте особенностей передачи энергии излучений чувствительным мишеням клеток. Однако в рамках развитых представлений оказалось невозможным объяснить неоднозначную зависимость ОБЭ от ЛПЭ. Затем было установлено [4], что на величину ОБЭ излучений
Ляпунова Е.Р.* - зав. лаб.; Комарова Л.Н. - проф., д.б.н. ИАТЭ НИЯУ МИФИ.
*Контакты: 249040, Калужская обл., Обнинск, Студгородок, 1. Тел.: (484) 397-85-39; e-mail: lyapunovae@gmail.com.
оказывают влияние не только их физические характеристики, но и свойства клеток восстанавливаться от лучевых повреждений. В литературе широко представлены данные о биологических эффектах действия ионизирующих излучений с различной ЛПЭ на дрожжевые [1, 2, 5, 6], бактериальные [5] и клетки млекопитающих [7-10]. Причём, следует отметить, что большинство экспериментальных данных получены на клетках, которые облучали в логарифмической стадии роста. Кроме того, в таких исследованиях проводится классическая оценка гибели клеток по способности образовывать макроколонии на твёрдой питательной среде. Но, по мнению некоторых авторов [11-13], такая оценка гибели клеток не является адекватной для определения кинетики формирования радиационного поражения. При действии на клетки плотноионизирую-щих излучений, в том числе и альфа-частиц, повреждения чувствительных структур клетки возникают за счёт разных частей энергетического спектра с различными величинами ЛПЭ. Это приводит к появлению двунитевых разрывов ДНК, хромосомных аберраций, мутаций и клеточной гибели [5]. Оценку возникновения таких повреждений можно определить методом микроколоний на твёрдой питательной среде. Хорошо известны такие данные, полученные для разных штаммов дрожжевых клеток [6].
Однако в литературе почти полностью отсутствует информация о действии редко- и плотноионизирующего излучения на популяцию клеток растений, облучаемых как в логарифмической, так и в стационарной стадиях роста. Поэтому представляло интерес провести сравнительное изучение выживаемости клеток хлореллы, облучаемых в различных стадиях роста у-квантами 60Со, ЛПЭ=0,2 кэВ/мкм, и а-частицами 239Pu, ЛПЭ=125 кэВ/мкм. А также изучить формы гибели клеток и проанализировать их соотношение после действия ионизирующего излучения разного качества. Такие данные будут полезны как с теоретической точки зрения, так и при интерпретации норм радиационной безопасности.
Материалы и методы
В качестве объекта исследований выбрана одноклеточная зелёная водоросль Chlorella vulgaris. Выбор этого объекта был обусловлен рядом преимуществ, которыми он обладает. Молодые клетки - слабоэллипсоидные, размером от 1,5 до 2 мкм, взрослые - шаровидные, диаметром 6-9 мкм, что с лёгкостью позволяет наблюдать их с помощью светового микроскопа. Размножение хлореллы - бесполое, автоспорами, деление происходит 1-6 раз в сутки [14]. Клетки делятся на 2-8, реже на 16 автоспор, в результате культура водоросли на протяжении длительного времени сохраняется альгологически чистой без применения специальных приёмов очистки и стерилизации. Тем самым обеспечивается простота культивирования хлореллы в лабораторных условиях. Хлорелла - удобный объект биологического мониторинга состояния природных экологических систем [14, 15], поскольку имеет широкий ареал распространения и присутствует как в водоемах, так и на почвах. С использованием хлореллы получена уникальная информация о мутагенных и летальных эффектах высоких доз внешнего облучения, про-
ЛЛС О'ЗО
дуктов ядерного деления U разного возраста [16], Th [17] неорганических и органических соединений в модельных растворах [18], компонентов природных и промышленных вод [19].
На одноклеточных водорослях рода Chlorella были проведены первые теоретические и экспериментальные исследования биорегенеративных систем. Детальное изучение хлореллы позволило выявить и решить ряд проблем, связанных со специфическими требованиями биологических систем жизнеобеспечения человека. В экспериментах по хроническому облучению большого числа поколений одноклеточной водоросли хлореллы и высших растений была разработана математическая модель накопления и элиминации мутаций в облучаемых природных популяциях [16, 19].
Для клеток хлореллы характерны несколько типов инактивации. Во-первых, это гибель без предварительного роста на стадии молодой клетки, при облучении - гибель «под лучом». Во-вторых, клетка может погибнуть, увеличив свой объём до объёма материнских клеток и больше. При этом в клетке иногда видны контуры автоспор [14]. Наконец, клетка может несколько раз спорулировать и дать патологическую микроколонию.
Метод микроколоний [1, 2] применительно к клеткам хлореллы позволяет провести детальный анализ дозовой зависимости появления различных типов инактивации.
Культивирование хлореллы проводили на 50% жидкой среде Тамия следующего состава: KNO3 - 5,0; MgSO4x7H2O - 2,5; KH2PO4 - 1,25; FeSO4 - 0,003 г/л. Для протококковых водорослей, к которым относится хлорелла, эта питательная среда считается [20] наиболее пригодной. Наращивание культуры водоросли производилось в специально разработанном для этих целей многокюветном культиваторе КВМ-05. Засев водоросли производится с начальной плотностью 0,1-0,15 единиц оптической плотности (Р), значение которой постоянно регистрируется в процессе культивирования измерителем плотности суспензии ИПС-03. При оптимальных условиях культивирования клетки выходят на стационарную фазу на 8 сутки с последующим постепенным замедлением эффективности роста.
Облучение проводили у-квантами 60Со на установке «Исследователь» (мощность дозы
239
28,3 Гр/мин) и а-частицами Pu (мощность дозы - 25 Гр/мин, ЛПЭ=125 кэВ/мкм). 0,1 мл суспензии клеток концентрацией 106 кл/мл помещали на поверхность голодного агара, после испарения воды монослой клеток облучали.
Результат облучения оценивали по выживаемости и типам инактивации клеток методом микроколоний. Выживаемость определяли по количеству клеток, сохранивших способность к делению относительно контрольного образца. Выжившими для репродуктивной формы гибели считали клетки, образовавшие микроколонии из 10 и более клеток. Для теста «гибель клеток без деления»: погибшими считали клетки, не делившиеся ни одного раза, а выжившими - клетки, поделившиеся за сутки хотя бы один раз.
Каждый опыт, описанный ниже, повторяли 3-5 раз, в каждой повторности анализировалось по 400 микроколоний.
Анализ выросших микроколоний производили под микроскопом БИОМЕД-3 при увеличении 10x40. Аномальными считались микроколонии, содержащие не эквивалентные по размерам клетки или колонии с числом клеток, не равным 2n.
Результаты
На рис. 1 представлены кривые зависимости выживаемости клеток хлореллы, облучённых в логарифмической стадии роста, от дозы облучения: кривая 1 получена после облучения клеток у-квантами, кривая 2 - после облучения a-частицами. Видно, что выживаемость хлореллы, облучённой a-частицами, ниже, чем кривая выживаемости клеток, облучённых у-квантами в такой же дозе. Поскольку кривые выживаемости после облучения обоими видами излучений были экспоненциальными, значение относительной биологической эффективности, определяемое отношением изоэффективных доз на кривых выживаемости после у- и a-излучения, не зависело от уровня выживаемости, для которого оно рассчитывалось. В данном случае ОБЭ a-излучения 3.
Доза, Гр
0 50 100 150 200 250 300
04
А Н и
о
§
<и а в Я
й
5 со
Рис. 1. Выживаемость клеток хлореллы после облучения у-квантами (кривая 1)
и а-частицами (кривая 2).
Ранее на дрожжевых клетках было показано [2, 3], что разные клетки, погибающие после облучения ионизирующим излучением, гибнут в разные сроки: не поделившись и не образовав колонию (интерфазная гибель); поделившись несколько раз и образовав потомство, не способное к размножению (репродуктивная гибель). Существует три формы инактивации: 1) класс М-| - микроколонии, состоящие из 10-40, а иногда и большего числа клеток; 2) класс М2 - микроколонии, содержащие 2-4 клетки; 3) класс М3 - одиночные клетки, т.е. гибель без деления [3]. Похожие исследования были выполнены и на клетках млекопитающих разного происхождения [8, 9, 13], облучённых ионизирующих излучением, однако данных по выявлению и анализу разных типов инактивации клеток хлореллы после действия у- и а-излучения нами не обнаружено.
На рис. 2 представлены данные, полученные в ходе нашего исследования, после облучения клеток микроводоросли гамма-квантами.
Видно, что для облучённых клеток хлореллы характерна гибель «под лучом», апоптоти-ческая гибель после нескольких делений (рис. 2В-Г) и некротическая гибель, как до деления (рис. 2А), так и после нескольких делений (рис. 2Б). Эти данные хорошо соотносятся с данными, представленными другими авторами [15, 18], полученными после действия тяжёлых металлов и некоторых химических препаратов на культуру водоросли.
А
и
я ж*.
( V ^ <з)
, , и » ^
л
и
В Г
Рис. 2. Вторая стадия некроза - набухание мембранных органоидов, лизис хроматина ядра (кариолизис) до деления клетки (А), после нескольких делений (Б). Третья стадия апоптоза -фрагментация тела клетки на ряд апоптических телец после нескольких делений (В, Г).
Увеличение 10x40.
Нами было оценено количественное соотношение форм гибели клеток после облучения, кроме того, представляло интерес выяснить, зависит ли это соотношение от стадии культивирования клеток водоросли. На рис. 3 представлены результаты, демонстрирующие выход клеток, погибших без деления, после действия у-излучения на клетки хлореллы, находящиеся на разных стадиях культивирования.
Видно, что при облучении клеток водоросли, находящихся на стационарной стадии роста, у-квантами 60Со в дозах от 10 до 50 Гр выход клеток, погибших без деления, превышает выход таких клеток, облучённых в логарифмической стадии роста. Гибель клеток в этом случае наступала в первые часы после облучения и под микроскопом через 2-6 ч можно было наблюдать клетки с резким пикнозом ядра. Полученные нами результаты согласуются с исследованиями Дудченко [21], проведёнными на различных линиях клеток £ (фибробластов мыши), где было показано, что клетки, находящиеся в 5 и периоде, были более радиочувствительны, чем делящиеся клетки. Это может быть связано первоначально с временной задержкой первого пострадиационного деления у клеток, находящихся в стационарной стадии роста, в связи с «попытками» клеток репарировать появившиеся повреждения. И в этом случае происходит уплотнение ядерного вещества, которое проявляется сморщиванием ядра, после чего клетка погибает, так и не поделившись. При облучении клеток микроводоросли в дозах свыше 150 Гр выход клеток, погибших без деления, не зависит от стадии роста хлореллы.
£
к
В о
Ч
о
«
м о ю У, В
а
ю -
О В
£ о н о
3
«
о и 2 со
100
80
60
40
20
50
100
150
200
Доза, Гр
Рис. 3. Выход клеток хлореллы, погибающих без деления, после облучения у-квантами. Кривая 1 - облучение в стационарной фазе роста, кривая 2 - облучение в логарифмической
стадии роста.
0
0
Количественное соотношение форм гибели менялось с увеличением дозы облучения. Так, при дозах от 10 до 50 Гр преобладала гибель после второго деления, а при дозах от 100 до 300 Гр - гибель клеток до деления. Кроме того было отмечено, что после облучения популяции хлореллы, клетки способны формировать патологические «гигантские клетки», но механизм образования таких клеток и их дальнейшая судьба существенно отличались в зависимости от дозы облучения. При действии гамма-излучения в небольших дозах (10-50 Гр) «гигантские клетки» возникали в результате слияния двух соседних клеток. Такие клетки были способны не более чем к 2-3 делениям, после чего они погибали. При действии больших доз излучения (свыше 200 Гр) гигантские клетки возникали без слияния и погибали без деления. Это согласуется с данными, полученными ранее другими исследователями [14-16], показавшими, что при облучении хлореллы редкоионизирующим излучением гибель после первой споруляции преобладала вплоть до дозы в 250 Гр.
Аналогичные данные получены нами и после облучения клеток водоросли а-частицами. Результаты представлены на рис. 4.
Доза, Гр
Рис. 4. Зависимость поражения клеток хлореллы, облучённых в стационарной (кривая 1) и логарифмической (кривая 2) стадиях роста, от дозы излучения.
Видно, что гибель клеток без деления, после облучения а-частицами в диапазоне доз от 100 до 300 Гр, как и в случае с у-квантами, мало зависит от стадии роста. При сравнении действия у- и а-излучения на клетки хлореллы видно, что гибель клеток без деления после а-облучения превышает выход таких же клеток после у-излучения более, чем в два раза, что, конечно же, связано с большим поражающим действием а-частиц по сравнению с у-квантами.
Заключение
Проведённый в работе анализ действия ионизирующего излучения с различными ЛПЭ на культуру зелёной одноклеточной водоросли Chlorella vulgaris показал, что зависимость выживаемости клеток от дозы облучения экспоненциальна. Такой тип зависимости реализуется в том случае, когда в процессе репарации каждого возникающего повреждения в клетке при облучении остаются не восстановленные повреждения, подчиняющиеся пуассоновскому распределению. Угол наклона экспоненты, отражающий радиочувствительность клеток, соответствует в этом случае выходу не репарируемых повреждений ДНК. При этом, облучение а-частицами вызывает значительно большую гибель клеток микроводоросли при условии облучения в одних и тех же дозах. Впервые обнаружены разные формы гибели клеток Chlorella vulgaris: гибель «под лучом», апоптотическая гибель после нескольких делений и некротическая гибель, как до деления, так и после нескольких делений для Chlorella vulgaris. Показано, что при изоэффек-тивных дозах воздействия обоих видов излучения выход клеток погибших «под лучом» практически в 2 раза выше такового после действия у-квантов для клеток в логарифмической фазе роста и 1,5 раза - в стационарной фазе.
Литература
1. Капульцевич Ю.Г. Количественные закономерности лучевого поражения клеток. М.: Атомиздат, 1978. 230 с.
2. Корогодин В.И. Формы инактивации дрожжевых клеток ионизирующей радиацией //Биофизика. 1958. Т. 3, № 2. С. 206-214.
3. Капульцевич Ю.Г., Корогодин В.И., Петин В.Г. Анализ радиобиологических реакций дрожжевых клеток //Радиобиология. 1972. Т. 12, № 2. С. 267-274.
4. Корогодин В.И. Проблемы пострадиационного восстановления. М.: Атомиздат, 1966. 391 с.
5. Красавин Е.А. Проблемы ОБЭ и репарация ДНК. Л.: Энергоатомиздат, 1989. 192 с.
6. Петин В.Г., Кабакова Н.М. Сравнительное изучение ОБЭ а-облучения дрожжевых клеток в различных стадиях роста //Радиобиология. 1977. Т. 17, Вып. 1. С. 31-36.
7. Говорун Р.Д., Смирнова O.A., Рыжов Н.И. Действие тяжёлых ионов на клетки млекопитающих. Сообщение 2. Оценка ОБЭ ускоренных ионов гелия, углерода и неона по цитогенетическим показателям //Радиобиология. 1982. Т. 22, № 6. С. 791-794.
8. Barendsen G.W. The relationships between RBE and LET for different types of lethal damage in mammalian cells: biophysical and molecular mechanisms //Radiat. Res. 1994. V. 139, N 4. P. 257-270.
9. Brooks A.L., Newton G.J., Shyr L.J. The combined effects of а-particles and X-rays on cell killing and mi-cronuclei induction in lung epithelial cells //Int. J. of Radiat. Biol. 1990. V. 58. P. 799-811.
10. Nagasawa H. Response of X-ray-sensitive CHO Mutant Cells to radiation. II. Relationship between cell survival and the induction chromosomal damage with low doses of а-particles //Radiat. Res. 1991. V. 126. P. 280-288.
11. Бычковская И.Б. Проблема отдалённой радиационной гибели клеток. М.: Энергоатомиздат, 1986. 160 с.
12. James A.P. Lethal sectoring in yeast //Genetics. 1973. V. 73. P. 165-166.
13. Dertinger H., Jung H. Molecular radiation biology. Berlin: Springer-Verlag, 1970. 250 p.
14. Шевченко В.А. Радиационная генетика одноклеточных водорослей. М.: Наука, 1979. 256 с.
15. Векшина Л.И., Коган И.Г., Кудряшов Е.И., Маренный А.Н., Пятышев Д.Р., Сакович И.С., Шевченко В.А. Относительная биологическая эффективность многозарядных ионов при однократном облучении хлореллы //Космическая биология и медицина. 1970. Т. 5. С. 39-42.
16. Шевченко В.А., Визгин В.П., Алексеенок А.Я. О мутационном процессе в популяциях одноклеточных водорослей при остром и хроническом облучении ионизирующей радиацией //Генетика. 1969. № 9, Вып. 5. С. 61 -73.
17. Евсеева Т.И., Майстренко Т.А., Гераськин С.А., Белых Е.С. Механизмы действия 232Th и Ce (III) на Chlorella vulgaris Beijer. Оценка вклада радиационного воздействия 232Th в индуцируемый эффект //Радиационная биология. Радиоэкология. 2008. Т. 48. С. 370-377.
18. Wong M.H. Effects of cobalt and zinc to Chlorella pyrenoidosa in soft and hard water //Microbiosis. 1980. V. 28. P. 19-25.
19. Шевченко В.А., Абрамов В.И., Кальченко В.А., Федотов И.С., Рубанович А.В. Генетические последствия для популяций растений радиоактивного загрязнения окружающей среды в связи с Чернобыльской аварией //Радиационная биология. Радиоэкология. 1996. Т. 36. С. 531-545.
20. ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.10-2004. Токсикологические методы анализа. Методика определения токсичности питьевых, природных и сточных вод, водных вытяжек из почв, осадков сточных вод и отходов производства и потребления по изменению оптической плотности культуры водоросли хлорелла (Chlorella vulgaris Beijer).
21. Дудченко Т.М. Совместное действие ионизирующей радиации и тяжёлых металлов на фибробласты мышей в культуре. Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Киев, 2001. 20 с.
Effects of sparsely and densely ionizing radiation on monocellular green
alga chlorella vulgaris
Lyapunova E.R., Komarova L.N.
OINPE MEPhI, Obninsk, Russia
Though relative biological effectiveness (RBE) of different types of ionizing radiation is intensely studied, mechanisms responsible for difference in the relative biological effectiveness are still not clear. Comparative analysis of effects of sparsely and densely ionizing radiation on monocellular green alga Chlorella vulgaris is presented in the paper. It is shown that survival curves of cells exposed to both types of radiation have exponential shape. In contrast to Chlorella cells, survival curves of other studied biological objects exposed to sparsely ionizing radiation have sigmoid shape. The death of both the alga cells and other objects from exposure to a-particles is significantly higher than after delivery the same dose of sparsely ionizing radiation. Chlorella vulgaris cells have several modes of radiation induced cell death, such as interphase death, apoptosis and necrosis, observed before cells division or after several cell division cycles. If doses of exposure of cells in log to both types of radiation are isoeffective, the number of interphase cell death caused by exposure of log-phase cells to alpha-particles is twofold higher than after gamma-radiation, the ratio is 1.5 for stationary-phase cells. Results of the study will improve understanding of mechanisms of eukaryotic cells inactivation induced by ionizing radiation with different LET.
Key words: y-radiation, a-particles, LET, Chlorella vulgaris, relative biological effectiveness (RBE), inactivation of cells, modes of cell death, survival curve, logarithmic stage of growth, stationary phase of growth, apoptosis, necrosis.
References
1. Kapultcevich Yu.G. Quantitative principles of radiation damage to the cells. Moscow, Atomizdat, 1978. 230 p. (In Russian).
2. Korogodin V.I. Forms inactivation of yeast cells to ionizing radiation. Biofizika - Biophysics, 1958, vol. 3, no. 2, pp. 206-214. (In Russian).
3. Kapultcevich Yu.G., Korogodin V.I., Petin V.G. Analysis of radiobiological reactions of yeast cells. Radiobiologiya - Radiobiology, 1972, vol. 12, no. 2, pp. 267-274. (In Russian).
4. Korogodin V.I. Problems of post-radiation recovery. Moscow, Atomizdat, 1966. 391 p. (In Russian).
5. Krasavin Е.А. Problems RBE and DNA repair. Noscow, Energoatomizdat, 1989. 192 p. (In Russian).
6. Petin V.G., Kabakova N.M. Comparative study of RBE and radiation yeast cells in various stages of growth. Radiobiologiya - Radiobiology, 1977, vol. 17, no. 1, pp. 31-36. (In Russian).
7. Govorun R.D., Smirnova O.A., Ryzhov N.I. Effect of heavy ions in mammalian cells. Message 2. Assessment of RBE accelerated ions of helium, carbon and neon by cytogenetic indices. Radiobiologiya -Radiobiology, 1982, vol. 22, no. 6, pp. 791-794. (In Russian).
8. Barendsen G.W. The relationships between RBE and LET for different types of lethal damage in mammalian cells: biophysical and molecular mechanisms. Radiat. Res., 1994, vol. 139, no. 4, pp. 257-270.
9. Brooks A.L., Newton G.J., Shyr L.J. The combined effects of a-particles and X-rays on cell killing and mi-cronuclei induction in lung epithelial cells. Int. J. of Radiat. Biol., 1990, vol. 58, pp. 799-811.
10. Nagasawa H. Response of X-ray-sensitive CHO Mutant Cells to radiation. II. Relationship between cell survival and the induction chromosomal damage with low doses of a-particles. Radiat. Res., 1991, vol. 126, pp. 280-288.
Lyapunova E.R.* - Head of Lab.; Komarova L.N. - Prof., D.Sc., Biol. OINPE MEPhI.
*Contacts: Studgorodok 1, Obninsk, Kaluga region, Russia, 249040. Tel.: (484) 397-85-39; e-mail: lyapunovae@gmail.com.
11. Bychkovskaya I.B. The problem of distant radiation cell death. Moscow, Energoatomizdat, 1986. 160 p. (In Russian).
12. James A.P. Lethal sectoring in yeast. Genetics, 1973, vol. 73, pp. 165-166.
13. Dertinger H., Jung H. Molecular radiation biology. Berlin, Springer-Verlag, 1970. 250 p.
14. Shevchenko V.A. Radiation genetics of unicellular algae. Moscow, Science, 1979. p. 256. (In Russian).
15. Vekshina L.I., Kogan I.G., Kudryashov E.I., Marenny A.N., Pjatyshev D.R., Sakovich I.S., Shevchenko V.A. The relative biological effectiveness of heavy ions in a single exposure of Chlorella. Kosmicheskaya Biologiya i Meditsina - Space Biology and Medicine, 1970, vol. 5, pp. 39-42. (In Russian).
16. Shevchenko V.A., Vizgin V.P., Alexeenok A.Ya. About the mutation process in populations of unicellular algae in acute and chronic exposure to ionizing radiation. Genetika - Genetics, 1969, vol. 9, no. 5, pp. 6173. (In Russian).
17. Evseeva T.I., Maistrenko T.A., Geras'kin S.A., Belykh E.S. Mechanisms of action of 232Th and Ce (III) on Chlorella vulgaris Beijer. Assessment of the contribution of radiation exposure 232Th in the induced effect. Radiatsionnaya biologiya. Radioekologiya - Radiation biology. Radioecology, 2008, vol. 48, pp. 370-377. (In Russian).
18. Wong M.H. Effects of cobalt and zinc to Chlorella pyrenoidosa in soft and hard water. Microbiosis., 1980, vol. 28, pp. 19-25.
19. Shevchenko V.A., Abramov V.I., Kalchenko V.A., Fedotov V.S., Rubanovich A.V. Genetic consequences for plant populations of radioactive contamination of the environment after the Chernobyl accident. Radiatsionnaya biologiya. Radioekologiya - Radiation Biology. Radioecology, 1996, vol. 36, pp. 531-545. (In Russian).
20. PND F T 14.1:2:3:4.10-2004. Toxicological analysis methods. The method of determining the toxicity of drinking water and waste water, water extracts from soils, sewage sludge and waste of production and consumption on the change in optical density of the culture of algae Chlorella vulgaris Beijer. (In Russian).
21. Dudchenko T.M. Joint action of ionizing radiation and heavy metals on mice fibroblasts in culture. Cand. biol. sci. diss. synopsis. PhD biol. Kyiv, 2001. 20 p.
