CC BY
21Токсикологический вестник №4 (115)
ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ТОКСИКОЛОГИЯ
УДК 615.917
Действие ацетальдегида на организмы свободноживущих почвенных нематод СаепогИаЬёШз е^аш линий N2 и 1РЕ1
Показано, что 30-минутная экспозиция к ацетальдегиду вызывает обратимые нарушения поведения нематоды С.е^апэ (0.08-1.2 мг/мл) и оказывает повреждающее действие на организм червей (5 мг/мл и выше). У червей линии 1РЕ1 повышена, по сравнению с червями линии N2, чувствительность к действию низких, но не высоких концентраций ацетальдегида. Ацетальдегид индуцирует специфическую форму нарушения поведения (скручивание червей в кольцо). Трехчасовая экспозиция С.е^апэ к ацетальдегиду (600 мкг/мл) вызывает изменения поведения, которые сохраняются после прекращения действия ацетальдегида на организм и проявляются как в нарушении поведения у части червей, так и в качественном изменении реакции поведения на повторное действие ацетальдегида.
Ключевые слова: Caenorhabditis elegans) ацетальдегид, поведение
Т.Б.Калинникова1, А.Х.Тимошенко1, Р.Р.Колсанова1, С.В.Захаров2, М.Х.Гайнутдинов1, Р.Р.Шагидуллин1
1Институт проблем экологии и недропользования Академии наук Республики Татарстан, г. Казань 2ООО «Новые научные технологии», г. Москва
Введенне. Ацетальдегид является первым метаболитом этанола [1] и токсикантом воздушной среды, который образуется и используется во многих производственных процессах [2-3]. Одной из самых чувствительных мишеней ацетальдегида, образующегося из алкоголя или поступающего в организм вместе с никотином при курении [4] и из загрязненной воздушной среды, является нервная система [2, 5-6]. В то же время клеточные и молекулярные механизмы нарушения функций нервных систем человека и грызунов, индуцированных ацетальдегидом, во многом остаются неизвестными. Одним из возможных подходов к изучению этих механизмов может быть использование в качестве модели простой нервной системы свободноживущей почвенной нематоды Caenorhabditis elegans, которая последние 30 лет широко используется как модельный организм для изучения механизмов многих сложных процессов, происходящих в нервной системе человека [7]. в связи с тем, что действие ацетальдегида на организм C.elegans ранее не изучалось, в этой работе проведено исследование действия АА на поведение червей дикой линии N2 и мутантной линии IPE1.
Материалы н методы нсследовання. Эксперименты проводились с червями трехдневного возраста дикой линии N2, доступной в Caenorhabditis Genetics Center, и линии IPE1, которая ранее была описана как линия червей с низкой теплоустойчивостью поведения [8]. Черви выращивались на стандартной среде выращивания нематод (СВН) [9] при кормлении червей E.coli OP50 при температуре 20°C. Линия IPE1 появилась в результате мутации, так как снижение теплоустойчивости червей этой линии произошло в течение одного поколения [8] и сохранилось при выращивании при 20°C с 2005 года до настоящего времени. Эксперименты, в которых исследовалось влияние АА на поведение, проводились с червями, инкубированными индивидуально в 1 мл СвН, из которой были исключены агар, пептон и холестерин, при температуре 20°C. Обратимость нарушений поведения, индуцированных ацетальдегидом, определялась перенесением червей после однократного отмывания от ацетальдегида в 1 мл свежей среды на три часа. Показателями нарушений поведения, индуцированных ацетальдегидом, являлись нарушения координации локомоторных мышц, необходимых для плавания, индуцированного механическим стимулом (встряхиванием пробирки с червем), и полная потеря способности червей к плаванию. Для выявления модификаций поведения, сохраняющихся после прекращения прямого действия ацетальдегида, червей в составе их групп (150 особей/мл) три часа инкубировали в среде, содержащей ацетальдегид (600 мкг/мл) при температуре 20°C с последующим двукратным отмыванием 10 мл среды и перенесением индивидуально в 1 мл свежей среды, в которой тестировалось поведение в отсутствие ацетальдегида или при повторном действии ацетальдегида. в каждом варианте экспериментов по определению чувствительности поведения к ацетальдегиду использовалось 30 червей. в эксперименте использовали ацетальдегид фирмы Supelco. Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента [10].
Результаты н обсуждение. Результаты наших экспериментов показали, что 30-минутная экспозиция C.elegans к ацетальдегиду оказывает повреждающее действие на организм C.elegans, проявляющееся в необратимой потере способности червей к плаванию, индуцированному механическим стимулом, только при высоких концентрациях ацетальдегида (5 мг/мл) (табл. 1), причем у червей линии N2 и IPE1 не выявляются раз-
личия чувствительности к повреждающему действию ацетальдегида (табл. 1). в то же время ацетальдегид в диапазоне концентраций 0.08-2.5 мг/мл вызывает обратимые нарушения поведения С.е^апэ, и в этих условиях выявилась повышенная, по сравнению с червями линии N2, чувствительность червей линии 1РЕ1 к ацетальдегиду (рис. 1). Обратимые нарушения поведения С.е^апэ, в зависимости от концентрации ацетальдегида, проявлялись в следующем: 1) нарушения координации локомоторных мышц, необходимых для синусоидальных движений тела червя при плавании, индуцированного механическим стимулом, сопровождающиеся скручиванием тела червей в форме кольца; 2) потеря способности червей к плаванию, при которой в ответ на стимул наблюдается движение только кончиков тела, которое приняло форму кольца; 3) полное, но обратимое отсутствие реакции на механический стимул, при котором тело обездвиженных червей скручено в кольцо (однократно, а в ряде случаев и двукратно).
Обратимые нарушения поведения С.е^апэ, индуцированные ацетальдегидом, чрезвычайно специфичны, так как в многочисленных исследованиях, проведенных последние три десятилетия, они не выявлялись при действии на поведение червей широкого круга токсикантов (нематоциды, тяжелые металлы, этанол и другие), нейрофарма-кологических воздействий (высокие концентрации серотонина, дофамина, октопамина и их антагонистов) и высокой температуры. все эти воздействия, в зависимости от их интенсивности и продолжительности, вызывают нарушения координации локомоторных мышц и обратимое обездвиживание червей, но не скручивание их тела в кольцо.
При инъекциях АА в организмы грызунов нарушения функций нервной системы проявляются в обратимых нарушениях поведения дозами ацетальдегида, подпороговыми для нарушения функций мышц и внутренних органов [5-6]. Результаты наших экспериментов свидетельствуют о высокой чувствительности к действию ацетальдегида и простой нервной системы С.е^апэ:
1. Концентрации ацетальдегида, вызывающие обратимые нарушения поведения С.е^апэ (80 мкг/мл) (рис. 1) и грызунов (100 мг/кг) [6] находятся на одном уровне при том, что инъекции вводят ацетальдегид во внутреннюю среду организмов грызунов, а в экспериментах с С.е^апэ ацетальдегид вводится в окружающую среду, и хорошо известно, что из-за низкой проницаемости кутикулы червя для многих органических веществ их концентрация во внутренней среде организма на порядки ниже, чем в среде инкубации [11-12];
2. В связи с отсутствием у С.е^апэ органа внешнего дыхания и циркуляторной системы мишенями действия ацетальдегида на поведение червя могут быть только нейроны или мышцы. В то же время нарушения координации локомоторных мышц, необходимой для синусоидальных движений тела при плавании червя, индуцированные низкими концентрациями ацетальдегида, могут быть следствием действия ацетальдегида на систему нейронов, осуществляющую моторную программу плавания, но не на локомоторные мышцы.
3. Специфические для ацетальдегида нарушения поведения С.е^апэ (скручивание в кольцо) выявляются при мутациях двух генов (ипс-1 и ипс-8), экспрессия которых происходит в нейронах [13-14].
4. В связи с тем, что концентрации ацетальдегида, вызывающие необратимые из- _
45
ИЮЛЬ - АВГУСТ 2012
Выводы: 1. Показано, что не только нервные системы человека и грызунов, но и простая нервная система С.е^апэ является самой чувствительной мишенью действия АА на организм, проявляющегося в обратимых нарушениях поведения.
2. Продолжительная (три часа) экспозиция С.е^апэ к ацетальдегиду вызывает модификации поведения, сохраняющиеся десятки минут в отсутствии ацетальдегида в среде.
3. Показано, что у червей линии 1РЕ1 повышена, по сравнению с червями дикой линии N2, чувствительность поведения к ацетальдегиду и качественно изменены модификации поведения, сохраняющиеся после прекращения прямого действия ацетальдегида.
4. Простая нервная система С.е^апэ может быть использована как удобная модель для изучения механизмов токсического действия ацетальдегида и, возможно, других альдегидов, являющихся загрязнителями воздушной среды, на нервные системы грызунов и человека.
Рис. 1. Влияние ацетальдегида на поведение С.е^апз линий N2 1РЕ1.
По оси абсцисс - концентрация ацетальдегида. По оси ординат -доля червей с нарушенным поведением (в %) после 30-минутной инкубации индивидуально в 1 мл среды.
В среде без ацетальдегида в обеих линиях черви с нарушенным поведением не выявлялись. В каждом варианте использовано 30 червей. На рисунке приведена достоверность различий между линиями: *** - р < 0.001.
менения в организме С.е^апэ на два порядка выше концентраций ацетальдегида, нарушающих поведение (рис. 1), очевидно, что обратимые нарушения поведения в среде с ацетальдегидом обусловлены не повреждением нейронов, а обратимыми нарушениями функций нейронов или синаптических связей между нейронами.
Ранее было показано, что поведение червей линии 1РЕ1 сенситизировано к нарушениям, индуцированным тепловым стрессом [8]. Однонаправленность различий между червями линий N2 и 1РЕ1 по устойчивости поведения к тепловому стрессу [8] и действию ацетальегида (рис. 1) позволяют предположить наличие общих механизмов, определяющих устойчивость нервной системы С.е^апэ к этим двум воздействиям.
Известно, что после инъекции ацетальдегида в головной мозг грызуна и быстрой (минуты) его утилизации альдегиддегидрогеназой изменения функционального состояния ЦНС, индуцированные ацетальдегидом, проявляющиеся в модификации поведенческих реакций, сохраняются длительное время [5]. В наших экспериментах с С.е^ата также выявлялись изменения поведения, сохраняющиеся после прекращения прямого действия ацетальдегида на организм червя. Эти изменения проявлялись в следующем:
1. После трехчасовой экспозиции червей к ацетальдегиду (600 мкг/мл) с последующим двукратным отмыванием от него в течение 20 минут у части червей, перенесенных в свежую среду, выявлялись нарушения координации локомоторных мышц, необходимой для синусоидальных движений тела при плавании (рис. 2А). У червей линии 1РЕ1 эти нарушения поведения полностью сохранялись при инкубации в среде без ацетальдегида в течение 90 минут, в то время как у большинства червей линии N2 с нарушенным поведением поведение нормализовалось через 90 минут инкубации (рис. 2А).
2. Предварительная трехчасовая экспозиция к ацетальдегиду изменяет поведенческие реакции на введение в среду низких концентраций ацетальдегида (рис. 2Б). В экспериментах с червями линии N2 концентрации ацетальдегида, нарушающие поведение контрольных червей (рис. 1), восстанавливают поведение червей, нарушенное предварительной экспозицией к высокой концентрации ацетальдегида (рис. 2Б). Этот "терапевтический" эффект ацетальдегида не выявляется в экспериментах с червями линии 1РЕ1, но у червей этой линии предварительная экспозиция к ацетальдегиду снижает чувствительность поведения к действию низких концентраций ацетальдегида, нарушающих поведение контрольных червей (рис. 1).
Результаты этих экспериментов свидетельствуют о том, что трехчасовая экспозиция червей к ацетальдегиду вызывает модификации их поведения, сохраняющиеся десятки минут в среде без ацетальдегида. Нарушения поведения червей, сохраняющиеся в среде без ацетальдегида (рис. 2А) могут быть следствием изменений концентрации нейромедиаторов, так как у грызунов изменения концентрации моноаминов в головном мозге сохраняются не менее 120 минут после прекращения действия однократно введенного ацетальдегида [6]. Причиной протекторного эффекта ацетальдегида, выявляющегося после предварительной экспозиции к нему червей линии N2, может быть множественность рецепторов ацетальдегида в нервной системе червя, стимуляция которых оказывает как негативное влияние на червей с нормальным поведением, так и восстановление нормального поведения после его предварительного нарушения. Известно, что при появлении зависимости от алкоголя и никотина проявляется «терапевтическое» действие этих психостимуляторов в условиях нарушения функций нервной системы резким прекращением их приема.
46
Токсикологический вестник №4 (115)
Рис. 2. Влияние предварительной трехчасовой экспозиции к ацетальдегиду на поведение червей линий N2 и IPE1 и его чувствительность к ацетальдегиду. По оси ординат - доля червей с нарушенным поведением (в %).
По оси абсцисс: А - время инкубации червей индивидуально в 1 мл среды без ацетальдегида после их предварительной трехчасовой экспозиции к ацетальдегиду (600 мкг/мл); Б - концентрация ацетальдегида (черви после трехчасовой экспозиции к ацетальдегиду 30 минут инкубировались индивидуально в 1 мл среды). В каждом варианте использовано 30 червей.
На рисунке приведена достоверность различий между линиями: *** - p < 0.001.
47
ИЮЛЬ - АВГУСТ 2012
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Eriksson C.J. The role of acetaldehyde in the actions of alcohol (update 2000) // Alcohol Clin. Exp. Res. - 2001. - V 25 (suppl. 5). - P. 15S-32S.
2. O'Brien P.J., Siraki A.G., Shangari N. Aldehyde sources, metabolism, molecular toxicity mechanisms and possible effects on human health // Crit. Rev. Toxicol. - 2005. - V 35. - P. 609-662. 2А. IPCS (The International Programme on Chemical Safety). Environmental health Criteria / World Health Organization, Geneva. - 1995. - N 167 Acetaldehyde. - P. 1-129.
3. Belluzzi J.D., Wang R., Leslie F.M. Acetaldehyde enhances acquisition of nicotine self-administration in adolescent rats // Neuropsychopharmacol. - 2005. - V. 30. - P. 705-712.
4. Amit Z., Smith B.R. A multi-dimensional examination of the positive reinforcing properties of acetaldehyde // Alcohol. - 1985. - V. 2. - P. 367-370.
5. Ward R.J., Colantuoni C., Dahchour A., Quertemont E., De Writte P. Acetaldehyde-induced changes in monoamine and amino acid extracellular microdialysate content of the nucleus accumbens // Neuropharmacol. - 1997. - V 36. - P. 225-232.
6. Leung M.C.K., Williams P.L., Benedetto A., Au C., Helmcke K.J., Aschner M., Meyer J.N. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology // Toxicol. Sci. - 2008. - V. 106. - P. 5-28.
7. Гайнутдинов М.Х., Тимошенко А.Х., Гайнутдинов ТМ., Калинникова ТБ. Характеристика новых линий Caenorhabditis elegans с высокой и низкой термотолерантностью // Генетика. 2007. - Т 43, № 9. - С. 1218-1225.
8. Brenner S. The genetics of Caenorhabditis elegans // Genetics. - 1974. - V 77. - P. 71-94.
9. Плохинский Н.А. Алгоритмы биометрии. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1980. - 150 с.
10. Davies A.G., Pierce-Shimomura J.T., Kim H. et al. A central role of the BK potassium channel in behavioral responses to ethanol in C.elegans // Cell. - 2003. - V 115. - P. 656-666.
11. Barsyte D., Lovejoy D.A., Lithgow G.J. Longevity and heavy metal resistance in daf-2 and age-1 long-lived mutants of Caenorhabditis elegans // The FASEB Joutnal. - 2001. - V 15. - P. 627-634.
12. Rajaram Sh., Spangler T.L., Sedensky M.M., Morgan P.G. A stomatin and a degenerin interact to control anesthetic sensitivity in Caenorhabditis elegans // Genetics. - 1999. - V. 153. - P. 1673-1682.
13. Sedensky M.M., Siefker J.M., Koh J.Y. et al. A stomatin and degenerin interact in lipid rafts of the nervous system of C.elegans // Am.J.Physiol.Cell Physiol. - 2004. - V 287. - P. C468-C474
Kalinnikova T.B.1, Timoshenko A.Kh.1, Kolsanova R.R.1, Zakharov S.V.2, Gainutdinov M.Kh.1, Shaguidullin R.R.1
Acetaldehyde action on the organism of free living soil nematodes Caenorhabditis elegans N2- and IPEl-lines
Institute of Ecology Problems and Subsoil Use, Tatarstan Academy of Sciences, Kazan "New Scientific Technologies Ltd", Moscow
It is shown that 30 min exposure of nematode C.elegans to acetaldehyde (0.08-1.2 mg/ml) causes reversible behavior disturbances and affects the worm organism (5 mg/ml and higher). IPE1 strain worms are more sensitive than those of N2 strain to low but not high acetaldehyde concentrations. Acetaldehyde induces a specific behavior disturbance (worms' coiling). A 3 h exposure of C.elegans to acetaldehyde (600 |ig/ml) causes behavior disturbances which persist after the acetaldehyde action on the organism stops and appear both as behavioral changes in some worms and qualitative changes in behavior responses to a repeated acetaldehyde action.
Материал поступил в редакцию 28.10.2010 года.
48
