Детекция мутаций при муковисци-дозе в гене CFTR у новорождённых детей в Ханты-Мансийском автономном округе-Югре Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

ИННОВАЦИОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ПЕДИАТРИИ И ДЕТСКОЙ ХИРУРГИИ

БИОИНФОРМАТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КРУПНЫХ ГЕНОМНЫХ АНОМАЛИЙ У ДЕТЕЙ

Васин К.С.12, Ворсанова С.Г.1-2-3, Юров Ю.Б.123, Смирнова О.А.2, Демидова И.А.1,2, Зяблова Н.В.2, Юров И.Ю.12

'Научно-исследовательский клинический институт педиатрии им. академика Ю.Е. Вельтищева ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, г. Москва

2ФГБНУ «Научный центр психического здоровья», г. Москва

3ГБОУ ВПО «Московский городской психолого-педагогический университет», г. Москва.

В лабораторной диагностике при исследовании пациентов с идиопатической умственной отсталостью, пороками и микроаномалиями развития всё чаще используются полногеномные молекулярно-цитогенетические методы исследования для выявления генетических нарушений, не выявляемых классическими (стандартными) методами цитогенетики. По данным исследований таких когорт детей от 25% и более выявляются хромосомные и геномные аномалии, затрагивающие участки ДНК от 0,5 млн пн и более. Аномалии такого размера содержат от нескольких десятков до нескольких сотен генов и могут значительно влиять на фенотип. Однако использование высокоразрешающих методов анализа генома даёт большой объём информации о хромосомных и геномных вариациях, интерпретация которых нередко затруднительна. Для обработки данных и их интерпретации необходимы различные биоинфор-матические инструменты. С использованием био-информатического анализа in silico проводится анализ крупных геномных аномалий, в ходе которого определяются гены, предположительно имеющие отношения к развитию фенотипа. В ходе работы по приоритизации генов, ассоциированных с фено-типическими проявлениями, особое внимание уделяется уровню и тканеспецифичности экспрессии генов. Как правило, исследуют процессы, в которых задействованы гены и их межбелковые взаимодействия. Использование данного алгоритма при анализе крупных геномных аномалий даёт возможность выявить гены, процессы-кандидаты, а также геномные сети, в которые вовлечена та и или иная геномная аномалия. Примеры использования данного алгоритма при анализе крупных геномных аномалий: случай 1. Пробанд с умственной отсталостью и ми-роаномалиями развития, при молекулярно-цитоге-нетическом исследовании которого была выявлена дупликация в участке 15q12q15.3 размером 17 млн пн. Данная аномалия затрагивает свыше 82 генов, индексированных в OMIM. В ходе биоинформатического анализа in silico было выделено 8 генов-кандидатов с повышенным уровнем экспрессии в клетках головного мозга (APBA2, LPCAT4, PAK6, ITPKA, TYRO3,

CAPN3, TTBK2, MAP1A). Кумулятивный эффект нарушения этих генов и может быть причиной формирования различных, в том числе и психических отклонений у ребёнка. Случай 2: Пробанд с умственной отсталостью, эпилепсией и микроаномалиями развития, при молекулярно-цитогенетическом исследовании которого была обнаруженная делеция в участке 6q22.1-q23.2 размером 13,7 млн пн. Данная аномалия затрагивает 30 генов, индексированных в базе данных OMIM. В ходе анализа были определены специфичные для головного мозга гены: GJA1, AKAP7, EPB41L2, FABP7, FAM184A, HDDC2, NKAIN2, PTPRK, SERINC1 и TPD52L1. При анализе межбелковых взаимодействий было установлено, что гены EPB41L2, TPD52L1 с повышенным уровнем экспрессии в клетках головного мозга и ген KIAA0408 взаимодействуют с 5 белками, относящимися к одному классу регуляторных белков 14-3-3. Нарушение в белках класса 14-3-3 и генах, кодирующих его, по данным литературы ассоциированы с психическими заболеваниями, в том числе и с умственной отсталостью. Используемый алгоритм может быть с успехом применён в прикладных и фундаментальных молекуляр-но-цитогенетических исследованиях. Работа поддержана грантами РФФИ (проекты № 16-54-76016 ЭРА_а и № 17-04-01366 А).

ДЕТЕКЦИЯ МУТАЦИЙ ПРИ МУКОВИСЦИ-ДОЗЕ В ГЕНЕ CFTR У НОВОРОЖДЁННЫХ ДЕТЕЙ В ХАНТЫ-МАНСИЙСКОМ АВТОНОМНОМ ОКРУГЕ-ЮГРЕ

Донников М.Ю.1,2, Мещеряков В.В.2, Колбасин Л.Н.1 'БУ ХМАО-Югры "Окружной кардиологический диспансер "Центр диагностики и сердечнососудистой хирургии", г. Сургут 2БУ ВО "Сургутский государственный университет", г. Сургут

Цель: ранняя молекулярно-генетическая диагностика мутаций в гене CFTR у новорождённых детей с повышенным уровнем иммунореактивного трип-синогена по результатам неонатального скрининга на муковисцидоз.

Задачи: разработка и тестирование комбинации молекулярно-генетических методов выделения ДНК из сухих пятен крови, ПЦР-амплификации 27 экзо-нов и экзон-интронных границ гена CFTR, проведение анализа кривых плавления высокого разрешения, селективное секвенирование экзонов с отличными от референсного паттернами плавления, детекция гомозиготных мутаций.

Материалы и методы: ДНК из сухих пятен крови выделяли набором "QIAamp DNA Micro kit" (Qiagen); анализ кривых плавления проводили с использованием ПО "Precision Melt Software" на приборе CFX96 (BioRad), секвенирование проводилось на генетическом анализаторе "GenomeLab GeXP" (Beckman-Coulter).

РОССИЙСКИЙ ВЕСТНИК ПЕРИНАТОЛОГИИ И ПЕДИАТРИИ, 2017; 62:(4) ROSSIYSKIY VESTNIKPERINATOLOGY IPEDIATRII, 2017; 62:(4)

Раздел 6. Наследственные заболевания и врожденные пороки развития

Результаты: проведен ретроспективный анализ 40 образцов ДНК у детей с подтвержденным диагнозом муковисцидоз и установленными мутациями в гене CFTR. В работе использовали ДНК, выделенную из сухих пятен крови, полученных при проведении неонатального скрининга в ХМАО в период 2009—2016 гг. Спектр выявленных мутаций по частоте аллелей (п=80) распределялся следующим образом: 1) delF508 — 52,5%; 2) Е92К — 10,0%; 3) dele2,3 - 3,75%; 4) 1677delTA, L138ins, S466X — по 2,5%; 3) 21 редкая мутация ^31С, 175delC, L218X, L233R, W277R, R347H, G509N, G542X, L568F, Е527^ R668C, Y849X, R1066C, R1070W, W1282X, Ш303К, W1310X, 394delTT, 621+1G>T, G1222VfsX44, 1342-^/Т) -по 1,25%. Проблема детекции гомозиготных мутаций (в частности, для самой частой мутации delF508) была решена путем гетерозиготной конверсии (смешивания ДНК исследуемого образца с ДНК дикого типа). Таким образом, чувствительность и специфичность комбинации используемых методов составила 100%; эффективность методики — 98% (не выявляются протяженные делеции/дупликации гена).

Заключение: разработанная методика потенциально позволяет в течение 2—3 рабочих дней на уровне региональной медико-генетической консультации, оснащенной оборудованием для проведения ПЦР и секвенирования, выявлять до 98% мутаций в гене CFTR без дополнительного вызова пациента для забора венозной крови, используя в качестве материала только пятна сухой крови из пятки новорождённого, полученные при заборе биологического материала для неонатального скрининга.

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ И ГЕНОТИП-ФЕ-НОТИПИЧЕСКИЕ КОРРЕЛЯЦИИ ПРИ РЕДКИХ ФОРМАХ ЭПИЛЕПТИЧЕСКОЙ ЭНЦЕФАЛОПАТИИ УДЕТЕЙ

Жилина С.С.1,2, Кожанова Т.В.1,2, Мещерякова Т.И.1, Ананьева Т.В.1, Лукьянова Е.Г.1, Прокопьева Н.П.1, Осипова К.В.1, Айвазян С.О.1, Канивец И.В.3, Коновалов Ф.А.3, Толмачева Е.Р.3, Притыко А.Г1,2

ТБУЗ «НПЦ спец.мед.помощи детям ДЗМ», г. Москва

2ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова МЗ РФ, г. Москва

3ООО "Геномед", г. Москва

Введение: Эпилептические энцефалопатии (ЭЭ) генетически гетерогенная группа тяжелых расстройств, которые характеризуются наличием судорожного синдрома и сопровождаются выраженными когнитивными и поведенческими нарушениями. К настоящему времени описана 51 форма ранних ЭЭ у детей.

Цель: выявить генетические причины ранних ЭЭ у детей и описать генотип-фенотипическую корреляцию.

Методы исследования: Обследованы 12 пациентов с ранней ЭЭ, задержкой психомоторного и речевого развития, наблюдающихся в психоневрологическом отделении ГБУЗ «НПЦ спец.мед.помощи детям ДЗМ. Проведен фенотипический анализ приступов, когнитивных и поведенческих нарушений, видео-ЭЭГ и МРТ головного мозга. У всех 12 пациентов получено информированное согласие на проведения таргетного экзомного секвенирования панели генов, ассоциированных с наследственными формами эпилепсии.

Результаты исследования: Длительное медицинское сопровождение и анализ фенотипа пациентов с резистентной к антиэпилептическим препаратам эпилептической энцефалопатии не позволило диагностировать часто встречающиеся моногенные формы. Исходя из этого, возникли показания к проведению таргетного экзомного секвенирования панели генов. Выявлены патогенные варианты — PCDH19 (п=1), ALDH7A1 (П=1), SCN2A (П=2), GRIN2B (П=2), DOCK7 (п=2), Шт (П=1), CNTNAP2 (П=2), DLGAP2 (п=1). У пациентов с функционально разными мутациями в гене DOCK7 были зафиксированы фено-типические варианты — эпилепсия идиопатическая генерализованая с миоклонически-астатическими приступами (мутация сайта сплайсинга), фокальная симптоматическая эпилепсия на фоне порока развития левой лобно-теменной области головного мозга (миссенс-мутация). В случае обнаружение мутации в гене ^N1 клинические проявления включали генерализованные судорожные приступы и тяжелую задержку речевого и психомоторного развития; PCDH19-генерализованные судороги, ALDH7A1-суперрефрактерный эпилептический статус, SCN2A-генерализованную эпилепсию с фебрильными судорогами, GRIN2B-миоклонические приступы, CNTNAP2-фокальную эпилепсию и DLGAP2-генерализованные судороги.

Заключение: Выраженная генетическая гетерогенность ранних ЭЭ обуславливает целесообразность и эффективность проведения таргетного экзомно-го секвенирования для диагностики генетических вариантов с использованием панелей генов, ответственных за возникновение заболеваний, сопровождающихся судорожным синдромом. Описание фе-нотипических проявлений при выявляемых мутаций позволит клиницистам на ранних стадиях заболевания диагностировать редкие формы ЭЭ и, возможно, провести коррекцию терапевтических мероприятий.

ИНТЕРАКТОМНЫЙ АНАЛИЗ ВАРИАЦИЙ ЧИСЛА КОПИЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК У ДЕТЕЙ С РАССТРОЙСТВАМИ АУТИСТИЧЕСКОГО СПЕКТРА

Зеленова М.А.1,2, Ворсанова С.Г.1,2,3, Васин К.С.1,2, Юров Ю.Б.12 3, Ратников А.М.2, Юров И.Ю.12 4 'Научно-исследовательский клинический институт педиатрии им. академика Ю.Е. Вельтищева ГБОУ

РОССИЙСКИЙ ВЕСТНИК ПЕРИНАТОЛОГИИ И ПЕДИАТРИИ, 2017; 62:(4) ROSSIYSKIY VESTNIK PERINATOLOGIII PEDIATRII, 2017; 62:(4)