CC BY
35
© Н. О. Волкова
УДК 611-013. 84. 018. 1. 085. 2:615. 014. 41 Н. О. Волкова
ДЕТЕКЦІЯ КРІОКОНСЕРВОВАНОЇ КУЛЬТУРИ КЛІТИН ХОРІОНА НА ОПІКОВИХ РАНАХ У ЩУРІВ
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАНУ (м. Харків)
Робота виконувалася у відповідності до наукової теми «Вивчення ефективності кріозахисту сперміїв людини, риб та собак за допомогою суміші кріопро-текторів та зґясування механізмів дії факторів кріо-консервації на спермії (при патосперміях), клітини хоріону та генетичний апарат ембріонів», державний реєстраційний номер теми 010611002171.
Вступ. Однією з актуальних задач сучасної клітинної біології є дослідження впливу стовбурових клітин на регенеративно-репаративні процеси в ушкоджених органах та тканинах. В світовій практиці багатьох опікових центрів поряд із традиційними методами лікування опікових ран застосовують сучасні біотехнологічні методи [1]. Використання аутологіч-них культивованих клітин отриманих із тканин самого пацієнта (шкіри, кісткового мозку, жиру та інших джерел) є найбільш перспективних напрямком в лікуванні опікових ран, оскільки не викликає імунних реакцій відторгнення [1, 4, 5]. Однак нарощування достатньої кількості клітин, яка забезпечить терапевтичний ефект займає деякий час (1-4 тижнів) та не завжди є можливим, тому альтернативним матеріалом для терапії можуть бути культури клітин з тканин фетоплацентарного комплексу, а саме з раннього хоріону. Культури клітин хоріону (ККХ) мають властивості мезенхімальних стромальних клітин, а саме здатність: до проліферації, спрямованого диференціювання та мають специфічний імунофено-тип. Отримання достатньої кількості клітин в будь який момент можливе за умов їх низькотемпературного зберігання. Завдяки розробленим програмам кріоконсервування ККХ вплив низьких температур не призводить до суттєвих змін функціонального стану клітин [2]. Для оцінки впливу трансплантованого клітинного матеріалу на відновлення ушкодженої тканини або органа застосовують гістологічні, біохімічні, біофізичні, імунологічні методи, але не завжди проводиться дослідження місцезнаходження введених клітин. Таким чином, цікавим напрямком є проведення порівняльної оцінки в локалізації та здатності до стимуляції регенеративних процесів нативних і кріоконсервованих ККХ, за умов їх аплікації на поверхню опіку. Ці дослідження дозволять оцінити строк збереження клітин в тканині, що відновлюється та репаративний потенціал самих клітин.
Мета роботи - дослідити вплив та визначити локалізацію нативних та кріоконсервованих культур клітин хоріону на опікових ранах у щурів.
Об’єкт і методи дослідження. Об’єктом були нативні та кріоконсервовані культури клітин хоріона.
У роботі використовували культури клітин, які отримували з тканини хоріона людини. Культивування клітин хоріона проводили за методом, що забезпечує адгезію стромальної фракції до культурального пластику з наступним видаленням фракції неадге-зивних клітин [2]. Клітини отримані при пасируванні кріоконсервували під захистом 10 % ДМСО та 20 % ембріональної сироватки великої рогатої худоби (HyClone, США) на середовищі IMDM. Швидкість охолодження складала 1°С/хв до - 80°С з наступним зануренням зразків у рідкий азот. Відігрів здійснювали на водяній лазні при 40°С до появи рідкої фази. Видалення кріопротектора проводили шляхом додаванням надлишкового об’єму розчину Хенкса (РАА, Австрія) з наступним центрифугуванням при 1500 об/хв (834 g) протягом 5 хв.
Моделювання та терапію опіків III ступеня [6] проводили на білих безпорідних щурах-самках вагою 180 ±20 г Площа опіку складала 5см2. Всі тварини з опіком були розділені на 3 експериментальні групи (по 5 тварин в кожній): контрольна група -процес ранозагоєння протікав природним шляхом; дослідна група № 1 - аплікація на поверхню опіку нативної ККХ; дослідна група № 2 - аплікація на поверхню опіку кріоконсервованої ККХ. Терапію проводили на наступну добу після нанесення опіків. Кількість клітин застосованих для терапії складала 5х104 життєздатних клітин на 1см2 площі опіку. Застосовані в експерименті ККХ були мічені РКН-26 (Sigma) згідно інструкції фірми виробника. За всіма тваринами проводили клінічні спостереження: досліджували динаміку площі опіків та оцінювали вміст лейкоцитів у периферичній крові на 5, 10 та 21 добу [3]. Після проведення клітинної терапії тварин всіх дослідних груп виводили з експерименту на 21 добу. Для детекції мічених РКН-26 клітин проводили забір ділянок шкіри всієї площини опікової поверхні. Люмінесцентну мікроскопію препаратів зразків шкіри (товщина 7 мкм) проводили за допомогою флуоресцентного мікроскопа (МИКМЕД-2). За наявності аутолюмінесценції проводили гасіння 0,3 М розчином гліцину (РАА, Австрія) на протязі 20 хвилин з наступним повторним мікроскопіювання препаратів [7]. Результати фіксували фотографуванням. Усі маніпуляції з тваринами здійснювали відповідно до вимог біоетики та принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей, а також «Загальними принципами експериментів на тваринах», схваленими II Національним конгресом
по біоетиці (20. 09. 2004 р., Київ, Україна). При статистичній обробці результатів використовували од-нофакторний дисперсійний аналіз і 1-критерій Стью-дента з використанням програми ЕхсеІ.
Результати досліджень та їх обговорення. Першим етапом роботи було проведення порівняльного аналізу морфофункціональних характеристик нативних і кріоконсервованих ККХ. Життєздатність кріоконсервованих ККХ (КрККХ) складала 82,5±4,7 %, у нативних ККХ (НККХ) - 97,4±5,8 %. Після кріоконсервування ККХ зберігали здатність до адгезій і наступної проліферації. Швидкість утворення моношару КрККХ була повільною порівняно з відповідними нативними культурами, а саме спостерігалося запізнення на 3±1 добу.
Нанесення нативних та кріоконсервованих ККХ попередньо мічених РКН-26 на опікову поверхню здійснювали на наступну добу з моменту моделювання опіку. За всіма групами тварин проводили візуальні спостереження за перебігом ранозагоєння на протязі 21 доби. Слід зазначити, що у тварин з терапією ККХ була відзначена позитивна динаміка протікання процесу ранозагоєння. Опікові рани у тварин з лікуванням були чисті без ознак запалення на відміну від контрольної групи, у яких опікові рани зменшувалися за рахунок поверхневого натяжіння та при розтині у більшості випадків спостерігалося наявність гною і сукровиці.
Результати планіметричного контролю опіків у експериментальних тварин представлені в таблиці 1.
Таблиця 1
Динаміка площі поверхні опікової рани у щурів при застосуванні нативних та кріоконсервованих ККХ, см2 (М±п)
Дослідні групи 5 доба 10 доба 21 доба
Контроль 4,94±0,53 3,46±0,27 1,67±0,16
Аплікація НККХ 2,81±0,24* 1,21±0,02* 0,12±0,05*
Аплікація КрККХ 3,16±0,54* 1,34±0,15* 0,19±0,07*
Примітка: *- відмінності вірогідні стосовно значень в групі контролю, р<0,05.
У тварин контрольної групи зменшення площі опіку було повільним у порівнянні з дослідними групами та повного ранозагоєння на 21 добу не спостерігалося. Отримані дані свідчили, що на протязі всього строку експерименту у всіх дослідних груп тварин з терапією ККХ, у порівнянні з групою контролю, спостерігалася активізація регенерації опіків, однак, вираженість цих процесів відрізнялась. Слід зазначити, що у тварин з терапією КрККХ ранозагоєння відбувалося більш повільно, порівняно з нативними культурами. На при кінці експерименту у тварин з терапією як НККХ так і КрККХ рани практично не було, на місці опіку була молода шкіра з майже повною епітелізацією.
Протягом спостереження у всіх експериментальних тварин брали зразки крові для виміру рівня лейкоцитів з метою визначення стану перебігу запального процесу. Отримані дані наведені в таблиці 2.
Таблиця 2
Динаміка вмісту лейкоцитів в крові щурів з опіками та за умов терапії нативними та кріоконсервованими ККХ, х109 клітин/л
(М±п)
Дослідні групи 5 доба 10 доба 21 доба
Норма 16,5±0,45 16,5±0,45 16,5±0,45
Контроль 27,64±0,23* 21,73±0,35* 19,35±0,26*
Аплікація НККХ 18,52±0,21** 16,93±0,23** 14,73±0,12**
Аплікація КрККХ 19,41±0,14 ** 17,18±0,25** 15,23±0,38**
Примітка: *- відмінності вірогідні стосовно норми, р < 0,05;
** - відмінності вірогідні стосовно значень в групі контролю, р < 0,05
У тварин контрольної групи вміст лейкоцитів вірогідно був вище за норму на всіх досліджених строках. Починаючи з 5 доби у тварин з терапією досліджений показник мав тенденцію до зменшення. На 21 добу спостереження у груп тварин з аплікацією НККХ та КрККХ, вміст лейкоцитів був у межах норми, що ймовірно свідчить про завершення раневого запального процесу, який був викликаний при моделюванні опіку.
Детекція трансплантованих клітин в організмі реципієнта проводиться завдяки залученню таких методів як: гістохімічний, радіоімунологічний та люмінесцентна мікроскопія. Для досягнення цієї мети в клітини перед застосуванням вводять наночастки, люмінесцентні барвники, генетично вбудовані люмінесцентні зонди та інші агенти які сприяють встановленню місця знаходження введених клітин. При застосуванні будь яких люмінесцентних міток завжди стоїть питання щодо наявності фонової аутолюмі-несценції дослідженої тканини, яка заважає чітко встановити локалізацію світіння введених мічених клітин. При дослідженні регенеративних процесів опіків шкіри, феномен аутолюмінесценції повґязан із складом шкіри, а саме наявністю колагену I типу, який характеризується емісією з інтенсивним піком між 410 и 450 нм та плечем до 510 нм [8]. Застосування концентраційного гасіння, нагрівання, дії інфрачервоного світла, електромагнітного поля та інше дозволяє позбавитися фонового світіння в дослідних зразках. В представленій роботі гасіння аутолюмінесценції проводилося завдяки розчину гліцину [7].
Люмінесцентна мікроскопія кріостатних зрізів зразків опікової поверхні шкіри тварин з аплікацією НККХ на 21 добу свідчила про наявність світіння в червоному діапазоні спектра (рис. 1). Люмінесцентне світіння було яскравим, чітким і локалізувалося по центру та краях досліджуваних препаратів. Мічені клітини розташовувалися щільними конгломератами між колагеновими волокнами шкіри.
При мікроскопічному дослідженні кріостатних зрізів опікових ран шкіри тварин з нанесенням мічених КрККХ на 21 добу спостерігалася наявність люмінесцентного світіння в червоній області (рис. 2). Світіння мало вигляд не великих за розміром конгломератів, які розташовувалися по краях досліджених препаратів.
Рис. 1. Локалізація мічених НККХ на опіковій рані, 21 доба. Світлова (а) та люмінесцентна (б) мікроскопія, х 50.
Стрілками зазначені об’єкти світіння.
Слід зазначити, що кількість об’єктів, які мали люмінесценцію була нижче у випадку застосування КрККХ ніж при НККХ.
Згідно інформації розробника РКН-26 - ліпо-фильний барвиник є не радіоактивною речовиною, яка зв’язується з мембраною клітин та не проявляє токсичної дії. Флюоресценція цього барвника не переходить від клітини до клітини але має здатність до переходу у дочірні клітини при мітозі. Таким чином, клітини, які люмінесціювали в зоні опіку можуть бути як безпосередньо аплікованими так і їх дочірніми клітинами.
Отримані результати свідчать, що динаміка ра-нозагоєння опікових ран у тварин з застосуванням нативних і кріоконсервированих ККХ відрізнялася за всіма дослідженими параметрами на початкових строках спостереження та вірогідно не мала відмінностей на 21 добу. Спостерігалося більш повільне зменшення опікової рани та нормалізації вмісту лейкоцитів в крові при застосуванні КрККХ у порівнянні з НККХ. Порівняльна оцінка в локалізації мічених ККХ показала, що за умов введення нативних культур спостерігається більша кількість клітин в зоні опіку
ніж при КрККХ. Цікавим фактом було виявлення різниці між НККХ і КрККХ за характером їх світіння. При використанні НККХ на 21 добу спостереження визначалося інтенсивна люмінесценція аплікованих клітин, які утворювали щільні конгломерати, що розташовувалися безпосередньо в оточенні колагенових волокон шкіри. Використання КрККХ на тому ж строку спостереження характеризувалося дифузним розподілом мічених клітин в зоні опіку. Одним із пояснень цього феномену може бути різні початкові ростові характеристики застосованих клітин, а саме, більш високий проліферативний потенціал НККХ у порівнянні з КрККХ.
Таким чином, наведені дані щодо місцезнаходження аплікованих клітин корелюють із результатами по зміні площі опіку та вмісту лейкоцитів в крові експериментальних тварин. Отримані результати позитивного впливу нативних і кріоконсервированих ККХ на перебіг процесу ранозагоєння опіків дозволяє зробити висновок про можливість застосування в терапії опіків досліджених культур клітин. Базуючись на представлених результатах проведених експериментів можна припустити можливість
Рис. 2. Локалізація мічених КрККХ на опіковій рані, 21 доба. Світлова (А) та люмінесцентна (Б) мікроскопія, х 50. Стрілками зазначені об’єкти світіння.
застосування KKX у якості pепаpативного матеpiалy Перспективи подальших досліджень. Г^о-в області клітинної теpапiї. гнозами щодо pозвиткy об’єкта дослідження може
Bиснoвки. Oдеpжанi в pоботi pезyльтати за допо- бути пpоведення малих клінічних досліджень, що є
могою планiметpичного аналізу, пiдpаxyнкy кількості пеpшим етапом можливого застосування фіокон-
лейкоцитів в фові, а також методу люмінесцентної cеpвованиx пpепаpатiв кyльтyp клітин xоpiонy для
мiкpоcкопiЇ свідчать, що нанесені на повеpxню опіку лікування опіків. Проведені дослідження можуть
нативні та кpiоконcеpвованi кyльтypи клітин xоpiонy бути основою для pекомендацiЇ cтвоpення банку фі-
вбудовуються в cтpyктypy шкipи, cпpияють знижен- оконcеpвованиx кyльтyp клітин xоpiонy та їх наступ-
ню інтенсивності запального пpоцеcy в оpганiзмi та ного застосування в біотехнологічних та медичних
пpиcкоpюють pегенеpацiю ушкодженої тканини. областях.
Література
1. Волков A. В. клеточные пpепаpаты для восстановления кожных пофовов / A. В. Волков // клеточная тpанcплантоло-гия и тканевая инженеpия. - 2006. - № 4. - C. 62-65
2. Гончаpyк О. I. Вплив кpiоконcеpвyвання на пpолiфеpативнi xаpактеpиcтики і потенціал дифеpенцiювання культивованих клітин xоpiонy / О. I. Гончаpyк, H. О. Волкова, В. I. Тищенко // Пpоблемы фиобиологии. - 2010. - № 3. - C. 309-317.
3. Лабоpатоpные методы исследования в клинике: Cпpав. / Под pед. В. В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - 368 с.
4. Пат. 74976 Уфаїна, МП^ A61K 35/50, A61P 17/02. Пpепаpат для лікування опіків на основі клітин xоpiонy, спосіб його пpиготyвання і спосіб лікування / Гончаpyк О. I., Петpенко Т. П., Павленко О. В. та ін.; заявл. 19.08.04.; опубл. 15.02.06, -Бюл. № 2.
5. Pаcyлов М. Ф. клеточная тpанcплантация ослабляет воспалительную pеакцию и cтимyлиpyет pепаpативные пpоцеc-сы в ожоговой pане / М. Ф. Pаcyлов, В. Т. Васильченко, В. A. Зайденов [и дp.] // клеточные технологии в биологии и медицине. - 2006. - № 3. - C. 126 - 131.
6. Xакимов З. З. Фаpмакодинамика лекаpcтвенныx веществ, метаболизиpyющиxcя в печени, пpи ожоговой тpав-ме у фыс / З. З. Xакимов, K. Н. Наджимутдинов, И. P Мавлянов // Фаpмакология и токсикология. - 1985. - № 2. -C. 103-106.
7. Baschong W. Control of autofluorescence of archival formaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue in confocal laser scanning microscopy (CLSM) / W. Baschong, R. Suetterlin, R. H Laeng // J. Histochem. Cytochem. - 2001. -V. 49, № 12. -P 1565-1572.
8. Montes G. S. Structural biology of the fibres of the collagenous and elastic systems / G. S. Montes // Cell Biol. Int. - 1996. -V. 20, № 1. - P. 15-27.
УДК 611-013. 84. 018. 1. 085. 2:615. 014. 41
ДЕТЕКЦІЯ KPIOKOHCEPBOBАHOЇ КУЛЬТУРИ КЛІТИН ХОРІОНА НА OПIKOBИХ РАНАХ У ЩУРШ
Boлкoва Н. О.
Резюме. В pоботi пpоведена детекція мічених PKH-26 нативних і кpiоконcеpвованиx куль^ клітин xоpi-она, які наносили на опікові pани щypам. За допомогою планiметpичного аналізу, п^ахуи^ кількості лейкоцитів в фові, а також методу люмінесцентной міфоскопії було показано, що апліковані клітини вбудовуються в CTpynrypy ш^и, cпpияють зниженню інтенсивності запального пpоцеcy в оpганiзмi та пpиcкоpюють pегенеpацiю ушкодженої тканини.
Ключові слова: кpiоконcеpвyвання, кyльтypа клітин xоpiона, люмінесценція, опіки шкipи.
УДК 611-013. 84. 018. 1. 085. 2:615. 014. 41
ДЕТЕКЦИЯ KPИOKOHCEPBИPOBАHHOЙ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ХОРИОНА НА OЖOГOBЫХ РАНАХ У КРЫС
Н. А. Boлкoва
Резюме. В pаботе пpоведена детекция меченных PKH-26 нативных и кpиоконcеpвиpованныx кyльтyp клеток xоpиона, нанесенных на ожоговые pаны кpыcам. Пpи помощи планометpичеcкого анализа, подсчета количества лейкоцитов в фови, а так же метода люминесцентной мифоскопии было показано, что нанесенные клетки вcтpаиваютcя в cтpyктypы кожи, способствуют снижению интенсивности воспалительного пpоцеccа в оpганизме и ycкоpяют pегениpацию повpежденной ткани.
Ключевые слова: кpиоконcеpвиpование, культа клеток xоpиона, люминесценция, ожоговая повеpxноcть.
UDC 611-013. 84. 018. 1. 085. 2:615. 014. 41
The Detection of Cryopreserved Chorion Cells Culture on Burn Field of Rats
Volkova N. O.
Summary. In present work was detection of PKH-26 labeled native and cryopreserved chorion cell cultures applications on burn would of rats. The application cells built in skin structure, reduce the intensity of the inflammatory process in the organism and contributed increase regeneration damage tissue was shown by using planimetric analysis, counting the number of leukocytes in the blood, as well as the method of fluorescent microscopy.
Key word: cryopreservation, chorion cells culture, luminescence, burn field.
Стаття надійшла 4. 02. 2013 р.
Рецензент - проф. Шепітько В. I.
