CC BY
78
УДК 615.076.9 Кубанский научный медицинский вестник № 7 (121) 2010
К. Г. ХЛЯБИЧ, М. А. БУЗОВКИНА
ДЕКСТРАН-1000 -
_ _________________________________ **
СРЕДСТВО КУПИРОВАНИЯ АНАФИЛАКТИЧЕСКИХ РЕАКЦИИ ПРИ ПРИМЕНЕНИИ ПРЕПАРАТОВ ДЕКСТРАНА
ФГУ«Государственный институт кровезаменителей и медицинских препаратов»
Россия, 109044, г. Москва, Лавров пер., 6, тел. (495) 676-43-60. E-mail: gikimp02@mail.ru
На морских свинках на модели иммунизации установлена способность декстрана-1000 купировать или ослаблять анафилактическую реакцию на введение антигенного материала. В реакции по Оухтерлони сыворотки кроликов против Leuconostoc mesenteroides, обработанные декстраном-1000, образовывали более слабые преципитаты по сравнению с контролем. Декстран-1000 нетоксичен, безвреден при многократном применении, апирогенен, не обладает анафилактогенными свойствами.
Ключевые слова: Leuconostoc mesenteroides, реактогенностъ, декстран, гаптен, безвредность, иммунизация, пироген-ность, патоморфология.
К. G. KHLJABICH, M. A. BUZOVKINA
DEXTRAN-1000 - REMEDY FOR PREVENTION ANAPHYLACTOID REACTION TO DEXTRAN DRUGS
FSI Federal institute of blood substitutes and pharmaceuticals,
Russia, 109044, Moscow, Lavrov per., 6, tel. (495) 676-43-60. E-mail: gikimp02@mail.ru
In experimental work with immunization of guinea-pigs dextran 1000 revealed the ability to prevent and reduce anaphylactoid reaction on antigen material. In Оухтерлони reaction with serum of rabbits blood against Leuconostoc mesenteroides with added dextran 1000 in them made less precipitate than the test ones. Dextran 1000 is not toxic, harmless in frequentative use, +, don't cause anaphylactoid reaction.
Key words: Leuconostoc mesenteroides, immunisation, reactogenic, pathomorphologie, dextran, hapten, harmless.
Введение
Как известно, большинство кровезаменителей при введении в организм может давать аллергические и анафилактогенные реакции. По наблюдениям М. С. Laxenaire et al. [5], за 15-месячный период среди 19 593 больных, получавших растворы на основе желатина (48,1%), оксиэтилкрахмала (26,7%), альбумина (15,7%) и декстрана (9,5%), выявлено 43 случая возникновения анафилактических реакций, т. е. их расчётная частота составила 0,273%, или 1 случай на 456 больных. Наиболее высокая частота - 0,349% -обнаружена на введение желатина, 0,273% - декстрана.
Вместе с тем установлено, что предварительные инъекции декстранового препарата с низкой молекулярной массой (ММ) купируют анафилактическую реакцию на введение декстрана с ММ 40 и 70 Дальтон.
По данным K. G. Ljungstrom [6], за период с 1983 по 1992 г. в 15 странах было использовано 5,1 млн. доз препарата «промит» (декстран-1000) для профилактики посттрансфузионных осложнений на введение декстрановых препаратов, и частота возникновения декстраниндуцированных реакций уменьшилась в 35 раз. Указанные данные свидетельствуют о том, что промит является эффективным средством снижения риска возникновения анафилактических реакций на антитела, вырабатываемые организмом человека при первичном введении декстрановых препаратов или употребляемого в пищу сахара и реагирующих при повторных трансфузиях декстрановых препаратов. Этот вывод подтверждают и материалы FDA: за период 1986-1998 гг. на 1,7 млн. случаев применения
декстрановых препаратов было выявлено 11 случаев тяжелых последствий [2-4].
В Государственном институте кровезаменителей и медицинских препаратов разработан препарат «дек-стран-1000» для купирования анафилактических реакций при введении декстрановых препаратов с высокими молекулярными массами. Целью исследования является оценка опытных образцов декстрана-1000 в сопоставлении с его аналогом - шведским препаратом «промит».
Материалы и методы
1. Физико-химическая характеристика декстрана-1000
Декстран-1000 представляет собой 15%-ный водный раствор полимера глюкозы - декстрана с добавлением 0,6%-ного натрия хлорида, назначается для предотвращения анафилактических реакций при применении противошоковых кровезаменителей декстранового ряда. Декстран-1000 обладает свойством моновалентного гап-тена. При внутривенном введении, реагируя с декстра-новыми антителами, он не образует крупных иммунных комплексов, и его введение перед трансфузией декстра-новых кровезаменителей исключает возможность возникновения анафилактических реакций.
Декстран-1000 - бесцветная прозрачная жидкость без запаха. Средняя молекулярная масса 1000±200 Д.
Молекулярно-массовое распределение в препарате определяют методом гельпроникающей хроматографии на стандартизованной колонке, заполненной нейтральным носителем сефадексом-в-15. В качестве стандарта используют аналог препарата «декстран-1000» промит («Фармация», Швеция). Содержание
декстрана-1000 в препарате составляет 13-16 г/100 мл (для промита - 13,5-16,5 г/100 мл).
Содержание натрия хлорида в декстране-1000 составляет 0,6-0,9 г/100 мл (для промита -
0,54-0,66 г/100 мл), азота - не более 19 мкг/мл (для промита - 100 мкг/мл), тяжелых металлов - не более 2 мкг/мл (для промита 5 мкг/мл). Относительная вязкость препарата при 25±0,1° С должна быть не более 3,0 (для промита не приводится), рН препарата составляет 4,0-6,0 (для промита - 3,0-6,0).
2. Изучение специфической активности декстра-на-1000
А. Препарат «декстран-1000» оценивали на модели пассивной анафилаксии на морских свинках на предмет его способности предупреждать развитие анафилактических реакций у животных. Двум группам морских свинок-альбиносов массой 150-250 г, самцам, по 5 животных в опытной и контрольной группах, вводили внутривенно по 0,5 мл специфической сыворотки к антигенному комплексу І_еисопов):ос тевепІегоіСев (сыворотка № 3). Эта сыворотка показала наибольшую специфическую активность по отношению к препарату «декстран-1000» в реакции преципитации в геле по Оухтерлони. Через 20 часов всем животным в качестве разрешающей дозы внутривенно в количестве 0,5 мг на животное вводили антигенный комплекс в виде высушенных и разрушенных клеток І_. тевепІегоіСев, разведенных в 1 мл физиологического раствора. Животным опытной группы дополнительно за 3 минуты до инфузии растворенного антигенного комплекса вводили декстран-1000 из расчета 0,3 мл/кг массы тела.
Б. Оценка свойств декстрана-1000 в реакции преципитации в геле по Оухтерлони. Изучена специфичность взаимодействия декстрана-1000 и препарата-аналога «промит» с кроличьими иммуноспецифическими антисыворотками к антигенам І_. тевепІегоіСев. Сыворотки были получены путем иммунизации кроликов (самок массой 2-2,5 кг) внутривенно лиофильно высушенной биомассой (клетки + питательная среда) или влажными размороженными клетками лейконостка. Культуру 1_. тевепІегоіСев выращивали в ферментере в полусинте-тической питательной среде. Для получения биомассы было осуществлено несколько пассажей. Полученная таким способом культура была разделена на 2 части, одну часть лиофильно высушивали, вторую часть центрифугировали, собранные клетки ресуспендировали в физиологическом растворе и замораживали. Образцы этих препаратов были использованы для иммунизации кроликов. Для изучения действия декстрана-1000 или промита на полученные сыворотки против І_. тевеПегоіСев был использован тест двойной диффузии в геле по Оухтерлони. Для этого применили 1%-ный раствор агарозы, содержащий 1% полиэтиленгликоля на 0,1 М фосфатном буфере рН-8,0. Горячую смесь наливали на стекло. После застывания геля вырезали штапиком (шестиугольник с центром внутри лунки). В центральные лунки раскапывали сыворотки, не обработанные или обработанные растворами декстрана-1000 или промита (1:1). Экспозиция составила 1 час. По периферии в лунки раскапывали антиген - лиофильно высушенные клетки, ресуспенди-рованные в физиологическом растворе до концентрации 10 мл/мг по сухому весу.
3. Изучение безвредности препарата «декстран-1000»
А. Острая токсичность. В опытах на 76 белых мы-шах-самцах массой тела 18-24 г исследовали острую
токсичность декстрана-1000 при его внутривенном введении. Приготовленные растворы на основе субстанции декстрана-1000 вводили в хвостовую вену в дозах 0,5-1,5 г/кг в одинаковом объеме, равном 0,2 мл/10 г массы тела. За подопытными животными наблюдали на протяжении 72 часов.
Б. Хроническая токсичность. В эксперименте было использовано 27 кроликов породы шиншилла, самцов, со средней исходной массой тела 2,5 кг. Животные были распределены на 7 групп. Первым трем группам кроликов вводили в ушную вену декстран-1000 в дозах 1,43; 2,86;
4.29 мл/кг. Препарат вводили 7 раз через 48 часов на протяжении 15 дней. Четвертая, пятая и шестая группы кроликов получали препарат сравнения по той же схеме. Седьмая группа - контрольная: кролики получали инъекцию физиологического раствора в дозе 4,29 мл/кг.
У всех подопытных животных на 5-й и 7-й дни исследовали общий клинический анализ крови, который включал определение количества гемоглобина, числа эритроцитов и лейкоцитов, подсчет лейкоцитарной формулы. Концентрацию гемоглобина определяли по Сали, подсчет эритроцитов и лейкоцитов осуществляли в камере Гаряева, СОЭ измеряли в аппарате Пан-ченкова. Влияние многократного введения декстрана-1000 на сердечно-сосудистую систему оценивали с помощью аппаратуры на полиграфе.
4. Патоморфологические исследования
Для патоморфологических исследований кроликов забивали через 24 часа и через 30 дней после последнего введения препаратов. У животных брали печень, почки, сердце, селезенку, надпочечники, поджелудочную железу, легкие. Для того чтобы избежать артефактов, органы замораживали жидким азотом (-196 °С) и нарезали образцы на криостате для исследования под микроскопом. Параллельно исследовали органы крыс, получавших внутривенно декстран-1000. 10 животных были разделены на 4 группы: 1-я группа (3 крысы) получала декстран-1000 в дозе 4,29 мл/кг; 2-я группа (3 крысы) - декстран-1000 в дозе 2,86 мл/кг; 3-я группа (2 крысы) - декстран-1000 в дозе 1,43 мл/кг; 4-я группа (2 крысы) - 0,9%-ный раствор натрия хлорида в дозе
4.29 мл/кг. Препарат вводили 7 раз через 48 часов, а на 15-е сутки после первого введения животных забивали. Проводили гистологическое исследование тех органов, что и у кроликов.
5. Изучение аллергизирующего действия декстра-на-1000
Для оценки аллергизирующего действия декстрана-1000 использована модель анафилаксии, вызываемой активной сенсибилизацией [1] . Опыты проведены на 12 морских свинках-самках (по 4 в каждой из 3 групп) массой тела 270-300 г. Исследовали декстран-1000, промит (первые две группы), третью группу составили животные, которые сенсибилизировались нативной лошадиной сывороткой (НЛС). Испытуемые препараты, предварительно адсорбированные гелем гидроокиси алюминия, вводили 2 дня подряд подкожно по 0,2 мл. Разрешающую дозу препарата (1 мл) вводили на 14-й день внутривенно. Контрольным животным вводили НЛС. Наблюдение за животными осуществляли в течение 24 часов после разрешающих инъекций.
6. Исследование пирогенности декстрана-1000
Определение пирогенности декстрана-1000 проводили на кроликах согласно ГФ XI. Тест-дозу препарата 1,43 мл/кг массы тела вводили внутривенно 3 кроликам. Еще 3 кроликам в той же дозе внутривенно (в ушную
Кубанский научный медицинский вестник № 7 (121) 2010
Кубанский научный медицинский вестник № 7 (121) 2010
вену) вводили промит - препарат сравнения. Температуру тела измеряли ректально до введения препаратов и затем через 1, 2 и 3 часа после их введения.
Результаты исследования
При оценке специфической активности декстрана-1000 все морские свинки опытной группы достаточно хорошо перенесли введение антигенного материала, полученного из клеток І_. тевепІегоіСев (табл. 1).
Только у 2 из 5 животных отмечены проявления легкой степени анафилактической реакции в виде почесывания мордочки и редкого покашливания, которые исчезли в последующие 32-50 минут. В контрольной группе аналогичные проявления наблюдались уже у 3 из 5 животных, в одном случае имелись проявления анафилаксии средней степени тяжести (затрудненное дыхание, подрагивание). И, наконец, одна морская свинка погибла через 24 минуты после введения разрешающей дозы при симптомах тяжелой степени анафилаксии: названные выше симптомы в сочетании с судорогами.
Специфичность взаимодействия декстрана-1000 и промита с кроличьими иммунными антисыворотками к антигенам І_. тевепІегоіСев подтверждена данными о том, что сыворотки без обработки растворами декстра-на-1000 или промита в реакции преципитации в геле по Оухтерлони образовывали мощные преципитаты с антигенами І_. тевепІегоіСев , а те же сыворотки, но обработанные декстраном-1000 или промитом, образовывали слабые преципитаты.
По итогам исследования острой токсичности де-кстрана-1000 гибели мышей при внутривенном введении препарата в дозах 0,5-1,5 г/кг не наблюдалось. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии токсичности декстрана-1000.
При оценке на кроликах хронической токсичности длительное введение декстрана-1000 или промита в дозах, которые в 5-15 раз превышали терапевтические, не оказывало неблагоприятного влияния на общее состояние, поведение животных, а также на их пищевую возбудимость и двигательную активность. Масса
тела животных в процессе эксперимента постепенно возрастала, прирост ее к 15-м суткам составил до 8% в группах декстрана-1000 или промита, в контрольной группе - до 8,5%. Индексы масс органов опытных животных после введения декстрана-1000 не увеличивались по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы кроликов.
Исследованные показатели крови не выходили за пределы физиологической нормы. Содержание общего белка, альбумино/глобулиновый коэффициент, уровень мочевины, креатинина, общий билирубин, содержание глюкозы, уровень активности трансаминаз в опытных группах не отличались от контрольных. Многократное введение кроликам декстрана-1000 не вызывало изменений частоты сердечных сокращений (ЧСС) и частоты дыхания (ЧД). ЧСС исходно составила 310 ударов в минуту. На фоне введения препарата ЧСС находилась на уровне 282-310 ударов в минуту. ЧД соответственно 145 и 151-160 дых/мин.
При вскрытии забитых животных, которым вводили декстран-1000, органы макроскопически по цвету, размеру и рисунку не отличались от органов контрольных животных (промит и физиологический раствор). Микроскопическое изучение гистологических препаратов всех групп показало сохранность гистологического строения внутренних органов. Аналогичные патоморфологиче-ские показатели безвредности декстрана-1000 были зарегистрированы и в органах крыс.
Таким образом, введение декстрана-1000 в 5-, 10-, 15-кратных дозах, превышающих терапевтическую, не выявляет нарушения гистологического строения внутренних органов и развития воспалительных процессов. При патоморфологическом исследовании органов кроликов через 30 дней после последнего введения также не обнаружено развития каких бы то ни было воспалительных или дистрофических процессов.
При оценке возможных аллергизирующих свойств у декстрана-1000 установлено, что препарат не обладает анафилактогенным действием (табл. 2). У морских
Таблица 1
Эффективность препарата «Декстран-1000» в опыте с пассивной анафилаксией на морских свинках
Группы животных Количество животных Признаки анафилактической реакции
Отсутств. Покашливание, почесывание Затруднённое дыхание Анафилактич. шок, гибель
Опытная 5 3 2 - -
Контроль 5 - 3 1 1
Таблица 2
Исследование анафилактогенности декстрана-1000 на морских свинках
Препарат Количество животных Сенсибилизирующая доза, мл Разрешающая доза, мл Реакция
Декстран-1000 4 0,2 1,0 Отсутствует
Промит 4 0,2 1,0 Отсутствует
НЛС 4 0,2 1,0 Все животные погибли
Таблица З
Оценка пирогенности декстрана-1000
Препарат Номер кролика Исходная температура Данные термометрии, часы Суммарное повышение температуры Заключение
1 2 3
Декстран-1000 1 38,7 38,6 38,7 38,8 0,8 Непирогенен
2 39,2 39,5 39,4 39,2
3 39,0 39,0 39,4 39,2
Промит 4 38,5 38,5 38,8 38,9 0,8 Непирогенен
5 38,7 38,7 38,7 38,8
6 39,0 39,6 39,7 39,6
свинок сенсибилизирующая реакция отсутствует, тогда как в контроле все животные погибли.
Как декстран-1000, так и промит не проявляют пиро-генного эффекта (табл. 3).
Суммарное повышение температуры кроликов находилось в пределах нормы.
Обсуждение
Результаты исследования оценки взаимодействия декстрана-1000 и промита с кроличьими имму-носпецифическими антисыворотками к антигенам 1_. тевег1егс1с1ев свидетельствуют об одинаковой способности препаратов оказывать специфический эффект по инактивации антител, имеющих тропность к антигенам бактерий 1_. тевег1егс1с1ев - продуцента декстрановых препаратов, и предупреждать развитие анафилактических реакций. Они согласуются с зарубежными фактами [6].
Проведенные исследования подтверждают также, что декстран-1000 по своим антиреактогенным свойствам к декстрановым препаратам, переносимости, антиа-нафилактогенным свойствам соответствует импортному аналогу «промит». Тест-дозу для оценки пирогенности препарата «декстран-1000» следует использовать в количестве 1,5 мл на 1 кг массы тела кролика.
По результатам экспериментального исследования специфических и биологических свойств декстрана-1000 получено разрешение Фармакологического комитета на его клинические испытания.
ЛИТЕРАТУРА
1. Адо А. Д. Патофизиология бронхиальной астмы // Клин. мед. - 1978. - Т. 62. № 6. - С. 5-9.
2. Донецкий И. А., Персанова Л. В., Байдингер В. Г., Хлябич К. Г. Декстран-1000 - новый препарат декстранового ряда // Материалы III Нац. конгресса «Человек и лекарство». - М., 1996. -С. 642-643.
3. Суханов Ю. С., Баснакьян И. А., Алексахина Н. Н. Разработка способов обнаружения недекстрановых примесей в декстрановых препаратах // Вестник службы крови России. - 2000. - № 1. - С. 21-26.
4. Суханов Ю. С., Баснакьян И. А, Алексахина Н. Н. и соавт. Сохранить коллоидные растворы на основе декстрана - государственная задача // Там же. - 2006. - № 1. - С. 35-38.
5. Суханов Ю. С., Персанова Л. В., Хлябич К. Г. и соавт. Пути профилактики анафилактических реакций на декстрановые препараты // Там же. - 2006. - № 2. - С. 24-25.
6. Шевченко Ю. Л., Жибурт Е. Б. Плазмозаменители на основе гидроксиэтилированного крахмала в клинической практике // Безопасное переливание крови: Руководство для врачей. - Изд-во «Питер», 2000.
7. Laxenaire М. С., GharpentierС., FeldmanL. Anaphylactoid reaction to colloid plasma substitutes: incidence, risk factors, mechanisms // Ann. fr. anesth. reanim. - 1995. - V. 14. № 1. - P. 142-143.
8. Ljungstrom K. G. Safety of dextran in relation to other colloids-ten years experience with hapten inhibition // Infusionsther transfusionsmed. - 1993. - V. 20. № 5. - P. 206-210.
9. WHO. Серия технических докладов. - Женева, 1992.
Поступила 22.06.2010
3. Ю. ХУРУМ, В. М. ПОКРОВСКИЙ, Л. И. ЖУКОВА
РЕГУЛЯТОРНО-АДАПТИВНЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ БОЛЬНЫХ С ХРОНИЧЕСКИМ ВИРУСНЫМ ГЕПАТИТОМ С В ЗАВИСИМОСТИ ОТ АКТИВНОСТИ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА
ГОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет» Росздрава,
Россия, 350000, г. Краснодар, ул. Седина, 4. E-mail: zarema_hur@mail.ru
У 125 больных хроническим вирусным гепатитом С проведено исследование параметров сердечно-дыхательного синхронизма. Выявлено соотношение между снижением регуляторно-адаптивных возможностей организма и активностью патологического процесса, определяемого по уровню гепатоцеллюлярных ферментов, выраженности сцинтиграфических нарушений, частоте клинических симптомов интоксикации и поражения печени. Параметры сердечно-дыхательного синхронизма могут быть использованы в качестве дополнительных неинвазивных критериев оценки активности хронического вирусного гепатита С.
Ключевые слова: хронический вирусный гепатит С, регуляторно-адаптивные возможности, активность процесса.
Кубанский научный медицинский вестник № 7 (121) 2010 УДК 616.36-002:(612.172.2+612.216)
