CC BY
39
ORIGINAL ARTICLE
КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018 УДК 616.72-002.77-039-085.357-078.33
Курочкина Ю.Д., Тыринова Т.В., Тихонова М.А., Леплина О.Ю., Сизиков А.Э., Сулутьян А.Э., Чумасова О.А., Останин А.А., Черных Е.Р.
ДЕКСАМЕТАЗОН IN VITRO И ПУЛЬС-ТЕРАПИЯ ГЛЮКОКОРТИКОИДАМИ IN VIVO ИНДУЦИРУЮТ ТОЛЕРОГЕННЫЙ ФЕНОТИП ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК У БОЛЬНЫХ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии», 630099, Новосибирск, Россия
Дендритные клетки (ДК) наряду со стимулирующей активностью могут оказывать толерогенный эффект и подавлять функции аутореактивных Т-лимфоцитов. В настоящее время усиление толерогенного потенциала ДК рассматривается в качестве новой стратегии лечения ревматоидного артрита (РА). Цель работы - изучить влияние дексаметазона на стимуляторную активность интерферон-а индуцированных ДК (IFN-ДК) в аутологичной и ал-логенной смешанной культуре лимфоцитов (ауто- и алло-СКЛ) и оценить in vivo влияние пульс-терапии высокими дозами метилпреднизолона на функции IFN-ДК у больных РА. Установлено, что дексаметазон индуцирует толерогенный фенотип IFN-ДК, генерируемых из моноцитов крови больных РА, что проявляется в способности дексаметазон-модифицированных ДК подавлять пролиферацию Т-клеток и продукцию цитокинов в ауто-СКЛ. При этом значимое снижение индексов соотношения TNF-a/IL-10 и IFNy/IL-4 свидетельствует о более выраженном подавлении продукции Т-клетками Thl/провоспалительных цитокинов и смещении баланса в сторону Т1п2-ответа. Толерогенный эффект глюкокортикоидов in vivo проявляется в снижении стимуляторной способности IFN-ДК больных после пульс-терапии метилпреднизолоном. Выявленная взаимосвязь (Rs= -0,71; p=0,02) низкой стимуляторной активности IFN-ДК с повышенным содержанием среди моноцитов крови CD14+CD16++ клеток позволяет предположить, что эффект глюкокортикоидов in vivo может быть связан с изменением субпопуляционного состава циркулирующих моноцитов под действием пульс-терапии.
Ключевые слова: дендритные клетки; ауто-СКЛ; алло-СКЛ; цитокины; CD14+CD16++моноциты; ревматоидный артрит, глюкокротикоиды. Для цитирования: Курочкина Ю.Д., Тыринова Т.В., Тихонова М.А., Леплина О.Ю., Сизиков А.Э., Сулутьян А.Э., Чумасова О.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Дексаметазон in vitro, и пульс-терапия глюкокортикоидами in vivo индуцируют толерогенный фенотип дендритных клеток у больных ревматоидным артритом. Иммунология. 2018; 39(4):195-201. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-3-195-201
Kurochkina Yu.D., Tyrinova T.V, Tikhonova M.A., Leplina O.Yu., Sizikov A.E., Sulut'yan A.E., Chumasova O.A., Ostanin A.A., Chernykh E.R.
DEXAMETHASONE IN viTRo, AND PULSE-THERAPY WITH GLUCOCORTICOIDS IN vivo INDUCE TOLEROGENIC PHENOTYPE OF DENDRITIC CELLS IN PATIENTS WITH RHEUMATOID ARTHRITIS
Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology, 630099, Novosibirsk, Russian Federation
Dendritic cells (DCs) along with stimulatory activity can exert tolerogenic effect and suppress the functions of autoreactive T-lymphocytes. Therefore, the enhancement of DC tolerogenic properties is considered as a new strategy for rheumatoid arthritis (RA) treatment. The aim of the study is to examine the in vitro effect of dexamethasone on the stimulatory activity of interferon-alpha-induced dendritic cells (IFN-DCs) in auto- and allo-MLC and to evaluate the in vivo effect of high-dose methylprednisolone pulse-therapy on IFN-DCs functions in RA patients. It has been shown that dexamethasone induces the tolerogenic phenotype of patient's monocyte-derived IFN-DCs which is manifested in the ability of dexamethasone-modified DCs to suppress T-cell proliferation and cytokine production in auto-MLC. In addition to that, the significant decrease of TNF-a/IL-10 and IFN-y/IL-4 ratios indicates a more pronounced suppression of Thl/pro-inflammatory cytokines production and a shift towards Th2 response. The tolerogenic effect of glucocorticoids in vivo is manifested by marked decrease of IFN-DCs stimulatory ability after pulse-therapy with methylprednisolone. The revealed relationship (Rs= -0,71; p=0,02) between low IFN-DC stimulatory activity and enhanced level of CD14+CD16++ cells among blood monocytes suggests that the effect of glucocorticoids in vivo may be associated with the alteration of circulating monocyte's subsets following pulse-therapy.
Keywords: dendritic cells; auto-MLC; allo-MLC; cytokines; CD14+CD16++monocytes; rheumatoid arthritis; glucocorticoids
For citation: Kurochkina Yu.D., Tyrinova T.V, TikhonovaM.A., Leplina O.Yu.,SizikovA.E., Sulut'yanA.E., Chumasova O.A., Ostanin A.A., Chernykh E.R.Dexamethasone in vitro, and pulse-therapy with glucocorticoids in vivo induce tolerogenic phenotype of dendritic cells in patients with rheumatoid arthritis. Immunologiya. 2018; 39(4): 195-201. DOI: http://dx.doi. org/10.18821/0206-4952-2018-39-4-195-201
Для корреспонденции: Курочкина Юлия Дмитриевна, врач-ревматолог клиники иммунопатологии, аспирант лаборатории клеточной иммунотерапии НИИФКИ, Е-mail: juli_k@bk.ru.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
For correspondence: Kurochkina Yuliya Dmitrievna, doctor-rheumatologist, Clinic of Immunopathology, post-graduate student, Laboratory of Cellular Immunotherapy, Institute of Fundamental and Clinical Immunology, E-mail: juli_k@bk.ru
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgments. Work is performed under the grant RFBR № 18-015-00215.
Received 15.01.18 Accepted 16.03.18
введение
Дендритные клетки (ДК) являются «профессиональными» антиген-презентирующими клетками, способными активировать наивные Т-клетки. Роль ДК в патогенезе ревматоидного артрита (РА) связывают с их способностью пре-зентировать аутоантигены, активировать Th1 и Th17 ответ, подавлять генерацию регуляторных Т-клеток, а также непосредственно продуцировать провоспалительные цитоки-ны и хемокины, поддерживающие воспалительный процесс
[1-3].
Наряду со стимулирующей активностью ДК могут оказывать толерогенный эффект посредством индукции апоптоза/ анергии Т-лимфоцитов и генерации регуляторных Т-клеток (Treg) [4, 5]. Поскольку такие ДК способны подавлять функции аутореактивных Т-лимфоцитов [6], усиление толероген-ного потенциала ДК рассматривается в качестве новой стратегии лечения РА и его осложнений, а сами ДК - в качестве новых мишеней терапевтических воздействий [2, 3].
Используемые в терапии РА препараты по данным литературы могут индуцировать толерогенный фенотип ДК. Так, глюкокортикоиды, которые часто применяются в схемах лечения больных РА с высокой активностью, ингибируют созревание ДК in vitro, подавляют продукцию провоспали-тельных цитокинов и усиливают секрецию IL-10, угнетают аллостимуляторную активность ДК и повышают способность ДК индуцировать T-reg [5, 7-9]. Важно отметить, что все эти эффекты получены в культурах ДК, генерированных из моноцитов под действием GM-CSF и IL-4 (ГЬ4-ДК). Моноциты являются существенным источником ДК, особенно при воспалении, и способны быстро дифференцироваться в ДК [10]. Поэтому генерация ДК из моноцитов крови не является исключительно витральным феноменом и отражает процессы, происходящие in vivo. Наряду с GM-CSF и IL-4 эффективными индукторами дифференцировки моноцитов в ДК являются интерфероны I типа (IFN-I) [11]. Учитывая патогенетическую значимость IFN-I и их повышенный уровень при аутоиммунной патологии [12, 13], интерферон-альфа индуцированные ДК (IFN-ДК) могут играть особую роль в поддержании и прогрессии РА и соответственно представлять интерес в плане терапевтических мишеней и потенциальных биомаркеров.
Проведённые нами ранее исследования показали, что как у доноров [14], так и больных РА [15] дексаметазон in vitro индуцирует толерогенные свойства IFN-ДК, что проявляется задержкой созревания, подавлением их способности продуцировать провоспалительные цитокины, а также стимулировать аллогенные Т-клетки к пролиферации и продукции Th1 цитокинов. Однако влияние дексаметазон-модифицированных IFN-ДК больных РА на аутологичные Т-лимфоциты, которые по данным литературы существенно отличаются от таковых у доноров, не исследовалось. Поэтому вопрос о чувствительности Т-клеток больных к эффекту толерогенных IFN-ДК остается открытым. Кроме того, показано, что глюкокортикоиды in vivo способны существенно влиять на субпопуляционный состав циркулирующих моноцитов, которые являются источником ДК. При этом не ясно, сказывается ли терапия глюкокортикоидами на свойствах, генерируемых из моноцитов IFN-ДК, и их чувствительности к действию глюкокортикоидов in vitro.
Исходя из этого, была сформулирована цель работы -
изучить in vitro влияние дексаметазона на стимуляторную активность ИФН-ДК в культурах аутологичных Т-клеток и оценить ex vivo влияние пульс-терапии высокими дозами ме-тилпреднизолона на функции генерируемых IFN-ДК у больных РА.
Материал и методы
В исследование было включены 18 пациентов с РА. Диагностику РА проводили в соответствии с критериями Американской коллегии ревматологов и Европейской антиревматической лиги (ACR/EULAR, 2010). Все пациенты, рекрутируемые в исследование, имели давность заболевания более года, характеризовались умеренной или высокой степенью активности заболевания (DAS 28 > 3,1) и получали терапию обычными синтетическими болезньмодифицирующи-ми препаратами (метотрексат, лефлуномид, сульфасалазин) в виде монотерапии или в комбинации. Десять пациентов получали пульс-терапию метилпреднизолоном (МП; 500 мг; № 3). Эти больные обследованы до проведения пульс-терапии и на 2—7-е сутки после последнего введения МП. Забор крови и все иммунологические исследования выполняли после получения письменного информированного согласия.
В крови больных РА до и после пульс-терапии МП методом проточной цитофлуориметрии (FACSCalibur, Becton Dickinson, США) оценивали относительное содержание классических (CD14++CD16-), промежуточных (CD14++CD16+) и альтернативных (CD14+CD16++) моноцитов с использованием FITS- и PE-меченных моноклональных анти-CDM и анти-CD16 антител, соответственно (BD PharMingen, США).
Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из венозной гепаринизированной крови стандартным методом центрифугирования на фиколле-верографине. МНК двукратно отмывали и инкубировали в 6-луночных планшетах (Nunclon, Дания) в течение 60 мин в среде RPMI-1640 (Sigma-Aldrich), дополненной 0,3 мг/мл L-глютамина, 5мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 2,5 % сыворотки плодов коровы (FCS, БиолоТ, Санкт-Петербург). Неприлипшие к пластику клетки удаляли, а фракцию адгезивных клеток (~ 93—95 % CD14+-моноциты) продолжали культивировать в течение 4 сут при 37 0С в СО-инкубаторе в полной культуральной среде в присутствии GM-CSF (40 нг/мл, Sigma-Aldrich) и IFN-a (1000 Ед/мл, Роферон-А, Roche, Швейцария). Для индукции созревания ДК на 4-е сутки вносили липополисахарид (ЛПС, 10 мкг/мл, LPS Е. colli 0114: B4, Sigma-Aldrich) и продолжали культивировать в течение 24 ч. Генерацию IFN-ДК проводили в отсутствие (контрольные культуры) и присутствии дексаметазона (10-6 M), который добавляли на 3-и сутки.
Стимуляторную активность IFN-ДК оценивали в алло-генных и аутологичных смешанных культурах лимфоцитов (алло- и ауто-СКЛ), используя в качестве отвечающих клеток, соответственно, МНК доноров или аутологичные МНК больных РА (0,1 х 106/лунку), которые культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах в среде RPMI-1640 в присутствии 10 % инактивированной сыворотки крови АВ(ГУ) группы при 37 0С в СО2-инкубаторе. Стимуляторами служили IFN-ДК в соотношении МНК : ДК =10 : 1. Про-лиферативный ответ оценивали на 5-е сутки радиометрически по включению 3Н-тимидина (1 мкКю/лунку), вносимого за 18 ч до окончания культивирования. Индекс влияния ДК (ИВ) в СКЛ рассчитывали как отношение пролиферативного
ORIGINAL ARTICLE
Рис. 1. Влияние дексаметазона на стимуляторную активность ШМ-ДК больных РА (п = 10) в алло- и ауто-СКЛ.
Данные представлены в виде медианных значений и интерквартильного диапазона (Ме; IQR). По левой оси ординат пролиферативный ответ Т-клеток (имп/мин), по правой оси ординат - индексы влияния (расч. ед.) №М-ДК в алло- и ауто-СКЛ. Р - парный критерий Вилкоксона.
ответа МНК в присутствии ДК к уровню спонтанной пролиферации МНК.
Способность IFN-ДК активировать аутологичные Т-клетки к продукции цитокинов оценивали в ауто-СКЛ (как описано выше). Культуральные супернатанты собирали на 5-е сутки и измеряли концентрацию 16 цитокинов (TNF-a, IL-1ß, IL-10, IL-2, IFN-y, IL-12, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, IL-17, G-CSF, IL-7, IL-8, MCP-1, MIP-1ß) методом проточной флюориметрии на 2-лучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, США) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ Statistica 6.0. Данные представлены в виде медианных значений (Ме) и интерквартильного диапазона (IQR, 25-75% квартили). Для выявления значимых различий сравниваемых показателей использовали непараметрические критерии: W критерий Вилкоксона (для связанных, парных выборок) и U-критерий Манна-Уитни (для несвязанных выборок). Корреляционный анализ проводили с помощью ранговой корреляции Спирмена (Rs). Различия считали достоверными при уровне значимостиp < 0,05.
Результаты
Ранее нами было показано, что дексаметазон подавляет способность IFN-ДК здоровых доноров и больных РА стимулировать пролиферацию Т-лимфоцитов в алло-СКЛ [14, 15]. Чтобы оценить, обладают ли дексаметазон-модифицированные IFN-ДК больных РА схожим эффектом в отношении аутологичных Т-клеток, было проведено сравнительное исследование интактных (ДКдекс-) и дексаметазон-обработанных ДК (ДКдекс+) в алло- и ауто-СКЛ (рис. 1). В данной серии экспериментов IFN-ДК генерировали от 10 пациентов с высокой активностью РА до начала проведения пульс-терапии МП. Как видно, генерация ДК в присутствии дексаметазона сопровождалась значимым снижением их способности стимулировать пролиферацию не только аллоген-ных Т-клеток доноров, но и аутологичных Т-лимфоцитов. Это проявлялось достоверным снижением пролиферативно-го ответа (имп/мин) Т-клеток и индексов влияния (расч.ед.) ДКдекс+ по сравнению с эффектами интактных ДКдекс-.
Следует отметить, что ответ в алло-СКЛ в присутствии ДКдекс+ ингибировался на 48% (IQR 31-55 %), а в ауто-СКЛ - на 67 % (IQR 49-75%; ри = -0,04). Таким образом, ингиби-рующий эффект дексаметазон-модифицированных ДК больных РА на пролиферацию аутологичных Т-клеток был более выраженным.
Чтобы оценить, меняется ли цитокин-секреторная активность Т-клеток больных РА при взаимодействии с ДКдекс+, был проведен сравнительный анализ продукции 16 цитоки-нов в ауто-СКЛ в присутствии интактных и дексаметазон-модифицированных IFN-ДК. Спектр исследуемых факторов включал про- и противо-воспалительные цитокины (TNF-a, IL-ip, IL-10), иммунорегуляторные цитокины (IL-2, IFN-y, IL-12, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, IL-17), ростовые факторы (G-CSF, IL-7) и хемокины (IL-8, MCP-1, MIP-ip). Из данных таблицы видно, что уровень продукции большинства цитокинов, за исключением IL-10, G-CSF, IL-7, IL-8 и MCP-1, был значимо ниже в ауто-СКЛ в присутствии ДКдекс+ по сравнению с культурами, содержащими интактные IFN-ДКдекс-. Наиболее выраженный ингибирующий эффект ДКдекс+ на цитокин-секреторную активность аутологичных Т-клеток выявлялся в отношении провоспалительных и Th1/Th17 цитокинов. Так, на уровне медианных значений продукция TNF-a снижалась на 81 % (IQR 65-87 %), IL-ф - на 69 % (IQR 59-76 %), IFN-y - на 88 % (IQR 29-96 %), IL-17 - на 60 % (IQR 46-68 %). В то же время супрессорный эффект ДКдекс+ в отношении Th2 (IL-4) и противовоспалительных цитокинов (IL-10, IL-13) было менее выраженным. Продукция IL-4 снижалась в среднем лишь на 14 % (IQR 10-39 %), IL-10 - на 41 % (IQR 15-55 %), IL-13 - на 43 % (IQR 26-68 %). Соответственно в присутствии ДКдекс+ индекс соотношения TNFa/IL-10 снижался более чем в 4 раза (в среднем с 1,7 до 0,4 расч. ед.; р№ = 0,013), а индекс соотношения IFNy/ IL-4 почти двукратно (в среднем с 30 до 17,8 расч. ед.; р№ = 0,024), свидетельствуя об ослаблении провоспалительной и Th1/Th17 активности и смещении баланса в сторону усиления противовоспалительногоЛЪ2 ответа.
Чтобы оценить проявляется ли толерогенный эффект глю-кокортикоидов на ДК in vivo, на следующем этапе исследовали влияние пульс-терапии МП на свойства генерируемых IFN-ДК
Иммунология. 2018; 39(4)
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-4-195-201 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Рис. 2. Влияние пульс-терапии МП на стимуляторную активность IFN-ДК больных РА (n = 10) в алло-СКЛ и их чувствительность к действию дексаметазона in vitro.
Данные представлены в виде медианных значений и интерквартильного диапазона (Me; IQR). По левой оси ординат пролиферативный ответ Т-клеток (имп/мин), по правой оси ординат - индексы влияния (расч. ед.) IFN-ДК в алло-СКЛ до и после пульс-терапии метилпреднизолоном (до и после п/т). Здесь и на рис. 3: достоверность различий между МНК+ДКдекс- и МНК+ДК декс+ по критерию Вилкоксона, достоверность различий в культурах клеток до и после пульс-терапии по критерию Манна-Уитни.
и их чувствительность к действию дексаметазона in vitro. Поскольку пролиферативный ответ в СКЛ определяется не только свойствами ДК, но и функциональным статусом отвечающих Т-лимфоцитов, для исключения возможного прямого супрессивного действия глюкокортикоидов на Т-клетки, стимуляторную активность IFN-ДК в первую очередь исследовали в алло-СКЛ, где в качестве отвечающих клеток использовали МНК здоровых доноров, не подверженных действию глюкокортико-идов. Чтобы исключить вклад различий по аллоантигенам, ДК каждого пациента, генерированные до и после пульс-терапии, тестировали против МНК одного и того же донора. Как видно на рис. 2, интактные IFN-ДК (ДКдекс-), генерированные после пульс-терапии МП, отличались сниженной аллостиму-ляторной активностью. Так, медианные значения пролифера-тивного ответа (имп/мин) Т-клеток и индексов влияния (расч. ед.) ДК, полученных после проведения пульс-терапии, были в 2 раза ниже, чем аналогичные показатели до терапии глюко-кортикоидами (ри = 0,04 и 0,0006, соответственно). Угнетение аллостимуляторной активности ДК отмечалось у большинства (8/10) пациентов. При этом IFN-ДК, генерируемые после пульс-терапии, сохраняли чувствительность к ингибирующе-му действию дексаметазона in vitro. Более того, супрессорный эффект дексаметазона на аллостимуляторную активность ДК, генерируемых после пульс-терапии, был выше, чем до терапии глюкокортикоидами (Ме 69 %; IQR 54-78 % против Ме 48 %; IQR 31-55%; ри = 0,026).
Схожие результаты были получены также при оценке сти-муляторной активности ДК больных РА в ауто-СКЛ (рис. 3, а). Интактные IFN-ДК (ДКдекс-), генерированные после пульс-терапии МП, характеризовались более низкой стимуляторной активностью в отношении аутологичных Т-клеток, чем до терапии (ри = 0,09), сохраняя при этом чувствительность к инги-бирующему действию дексаметазона in vitro на исходном (до терапии) уровне (pW = 0,005). Супрессорный эффект дексаме-тазона на ДК, генерированные до и после терапии, составлял в среднем 67 % (IQR 49-79 %) и 55 % (IQR 51-60 %), соответственно, и значимо не различался (pW = 0,79).
Следует отметить, что в отличие от результатов в алло-СКЛ, демонстрирующих достоверное снижение стимуляторной активности IFN-ДК, генерированных после пульс-
терапии (ри = 0,04), толерогенный эффект курса терапии МП на ДК в ауто-СКЛ проявлялся в виде тренда (ри = 0,09). При этом отмечалась гетерогенность больных РА по уровню ответа в ауто-СКЛ (рис. 3, б). Так, в подгруппе пациентов с исходно высоким ответом (группа 1; ИВДК > 4,5 расч.ед.; n = 6) пульс-терапия приводила к снижению стимуляторной активности ДК у всех пациентов (ри = 0,006). В то же время в подгруппе с исходно низким ответом (группа 2; ИВДК < 4,5; расч.ед.; n = 4) стимуляторная активность ДК после терапии значимо не менялась (ри = 0,14). Тем не менее, в обеих подгруппах IFN-ДК, генерированные после пульс-терапии МП, сохраняли чувствительность к ингибирующему действию дексаметазона in vitro.
Известно, что глюкокортикоиды оказывают выраженный эффект на субпопуляционный состав и функции моноцитов, что может сказываться на свойствах генерируемых ДК [16]. Сравнительная оценка относительного содержания классических (CD14++CD16-), промежуточных (CD14++CD16+) и альтернативных (CD14+CD16++) моноцитов у здоровых доноров (n = 18) и больных РА (n = 15), находящихся на терапии болезнь-модифицирующими препаратами, показала (рис. 4, а) снижение у пациентов CD14++CD16-клеток (Ме 78 против 91 %; ри = 0,022) и возрастание CD14++CD16+ (Ме 4,0 против 2,0%; ри = 0,034) и CD14+CD16++ моноцитов (Ме 5,0 против 1,5 %; ри = 0,02). Изменение субпопуляционного состава циркулирующих моноцитов было наиболее выраженным у больных с исходно низкой стимуляторной активностью IFN-ДК в ауто-СКЛ (рис. 4, б, группа 2). В этой группе содержание альтернативных CD14+CD16++ клеток достигало 7 % (5,5-14,5 %), достоверно превышая донорские значения (pU = 0,002) и на уровне тренда - у больных с исходно высокой стимуляторной активностью IFN-ДК в ауто-СКЛ (группа 1, Ме 2,5%; pU = 0,08). Через 2-3 дня после окончания пульс-терапии количество CD14+CD16++ моноцитов в первой подгруппе возрастало практически в 2 раза - с 2,5 до 4,8 % (n = 6; pU > 0,05), тогда как во второй подгруппе снижалось с 7 до 1 % (n = 4; pU = 0,028). Таким образом, исходно низкий ответ в ауто-СКЛ ассоциировался с повышенным содержанием альтернативных моноцитов. Кроме того, нарастание доли CD14+CD16++ клеток после пульс-терапии сопровожда-
ORIGINAL ARTICLE
а
Рис.3. Влияние пульс-терапии ПМ на стимуляторную активность IFN-ДК больных РА в ауто-СКЛ и их чувствительность к действию дексаметазона in vitro.
а - данные (Me; IQR) по пролиферации Т-клеток (имп/мин) в ауто-СКЛ в общей группе больных РА (n = 10) до и после пульс-терапии метилпредни-золоном (До и После п/т); б - значения пролиферации Т-клеток в подгруппах больных с исходно высоким (группа 1; n = 6) и исходно низким (группа 2; n = 4) ответом в ауто-СКЛ.
лось снижением исходно высокой стимуляторнои активности генерируемых ДК у 100 % больных группы 1 (см. рис. 3, б; рц = 0,006). В то же время уменьшение CD14+CD16++ клеток у больных группы 2 значимо не усиливало исходно низкую стимуляторную активность ДК (см. рис. 3, б; рц = 0,14).
Нарушение субпопуляционного состава моноцитов у больных РА в сторону увеличения CD14+CD16++ клеток позволяет предположить, что 1) альтернативные моноциты, как предшественники генерирумых ДК детерминируют низкую стимуляторную активность IFN-ДК в ауто-СКЛ; 2) эффект глюкокортикоидов in vivo может быть связан с изменением субпопуляционного состава циркулирующих моноцитов. Чтобы подтвердить эти предположения, была проанализирована корреляционная взаимосвязь между количеством CD14+CD16++ моноцитов и стимуляторной активностью интактных (ДКдекс-) и дексаметазон-обработанных ДК (ДКдекс+) больных РА в ауто-СКЛ. Для исключения эффекта глюкокортикоидов на отвечающие Т-клетки, анализ базировался на данных, полученных до проведения пульс-терапии МП. Оказалось, что относительное содержание альтернативных моноцитов у больных РА обратно коррелирует со способностью IFN-ДК стимулировать пролиферацию аутологичных Т-лимфоцитов. Эта взаимосвязь проявлялась в виде тренда в отношении интактных ДК (Rs = -0,46; p = 0,18) и становилась более выраженной и значимой в отношении ДКдекс+ (Rs = -0,71; p = 0,02).
Обсуждение
Нами показано, что дексаметазон in vitro индуцирует то-лерогенный фенотип IFN-ДК у больных РА, что проявляется значимым снижением их способности стимулировать пролиферацию как аллогенных Т-клеток доноров, так и ауто-логичных Т-лимфоцитов. При этом ингибиторный эффект дексаметазон-модифицированных ДК на пролиферацию аутологичных Т-клеток является более выраженным. Толе-рогенный фенотип ДКдекс+ проявляется также супрессией цитокин-секреторной функции Т-лимфоцитов. При этом значимое снижение индекса соотношения TNFa/IL-10 и IFNy/ IL-4 свидетельствует о более выраженном подавлении продукции Т-клетками ТЫ/провоспалительных цитокинов и
смещении баланса в сторону усиления противовоспалитель-ногоЛЪ2 ответа.
Способность ДК индуцировать пролиферативный ответ Т-лимфоцитов в СКЛ является интегральным показателем их функциональной активности. Поэтому снижение ответа в СКЛ рассматривается в качестве характерного витрального признака толерогенных 1Ь4-ДК [17]. Проведенные нами ранее исследования показали, что угнетение аллостимуляторной активности под действием дексаметазона характерно также и для IFN-ДК [14]. Более того, снижение аллостимуляторной активности IFN-ДК у больных РА сопряжено с другими проявлениями толерогенного фенотипа ДК, в частности прямо коррелирует с экспрессией TLR2, который считается маркером толергенных ГЬ4-ДКдекс+ [18], а также ассоциируется со снижением ТЫ - и возрастанием №2-стимулирующей активности ДК в алло-СКЛ [14, 15]. Полученные в настоящем исследовании данные о способности ГР№ДКдек+ ингибировать пролиферацию и продукцию цитокинов Т-клетками в ауто-СКЛ и смещать баланс в сторону усиления противовоспалительного/ Th2 ответа свидетельствует о чувствительности Т-лимфоцитов больных РА к толерогенным сигналам ШЧ-ДКдек+.
Важно отметить, что ингибирующий/толерогенный эффект глюкокортикоидов в отношении IFN-ДК у больных РА проявляется также in vivo, что подтверждается снижением аллостимуляторной способности ДК больных после пульс-терапии МП. Характерно, что генерируемые после пульс-терапии IFN-ДК обладают еще большей чувствительностью к действию дексаметазона in vitro и, соответственно, могут рассматриваться в качестве потенциальных кандидатов для получения толерогенных ДК-вакцин. Способность IFN-ДК больных РА стимулировать пролиферацию аутологичных Т-клеток после пульс-терапии также снижалась, хотя данный эффект выявлялся только у 60% пациентов, ДК которых исходно обладали высокой стимуляторной активностью.
Выявленное ингибирующее действие дексаметазона на способность ДК больных стимулировать пролиферацию Т-клеток и продукцию ТЫ/провоспалительных цитокинов в ауто-СКЛ позволяет предполагать, что хорошо известный, противовоспалительный эффект пульс-терапии МП in vivo
б
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
б
Рис. 4. Субпопуляционный состав циркулирующих моноцитов у больных РА.
а — относительное содержание (Me; IQR) субпопуляций моноцитов в крови здоровых доноров (n = 18) и пациентов РА (n = 15); б - содержание альтернативных (CD14+CD16++) моноцитов до и после пульс-терапии МП (До и После п/т) в подгруппах больных с исходно высоким (группа 1; n = 6) и исходно низким (группа 2; n = 4) ответом в ауто-СКЛ. p - достоверность различий по критерию Манна-Уитни.
а
Продукция цитокинов в ауто-сКЛ в присутствии интактных и дексаметазон-модифицированных IFN-ДК больных рА (n=9)
Цитокины (пг/мл) ДК Декс- ДК Декс+ P
TNF-a 270 (130 - 450) 40 (32 - 57) 0,013
IL-1ß 50 (42 - 74) 25 (12 - 35) 0,013
IL-10 130(80 - 230) 90 (45 - 260) 0,08
IL-2 95 (75 - 100) 55 (50 - 90) 0,013
ifn-y 1120 (830 - 8620) 660 (330 - 900) 0,017
IL-12(p70) 37 (30 - 45) 30 (17 - 40) 0,024
IL-4 50 (40 - 55) 37 (23 - 45) 0,013
IL-5 13 (9 - 34) 5 (1,7 - 5,9) 0,04
IL-6 7320 (6200 - 7920) 2340(1730 - 4470) 0,007
IL-13 80(60 - 200) 52 (44 - 60) 0,011
IL-17 460(355 - 610) 150 (140 - 260) 0,027
G-CSF 1440(1020 - 2030) 1670(1110 - 3060) 0,72
IL-7 4,5 (4,4 - 12,4) 4,4 (4,4 - 17) 0,24
IL-8 37710 (32790 - 44590) 37040 (29570 - 47740) 0,45
MCP-1 28020 (11770 - 42530) 18240 (15730 - 30390) 0,26
MIP-1ß 39890(16400 - 81930) 9270 (7120 - 24150) 0,013
TNFa/IL-10 расч.ед. 1,7 (1,1 - 3,6) 0,4 (0,2 - 0,9) 0,013
IFNy/ IL-4 расч.ед. 30 (15,3 - 89,6) 17,8 (1,5 - 26,6) 0,024
Примечание. Данные представлены в виде медианных значений и интерк-вартильного диапазона (в скобках); Р - W критерий Вилкоксона для связанных выборок.
может быть связан с прямым толерогенным действием глю-кокортикоидов на дифференцировку ДК из моноцитов. С другой стороны, поскольку ДК генерировали из моноцитов, снижение аллостимуляторной активности ДК после пульс-терапии не исключает участие самих моноцитов как клеток-предшественников в реализации толерогенного эффекта глюкокортикоидов на ДК.
Моноциты представляют гетерогенную популяцию, которая включает классические (CD14++CD16-), промежуточные (CD14++CD16+) и альтернативные (CD14+CD16++) субтипы [19]. Оценка указанных субпопуляций у больных РА выявила снижение относительного содержания CD14++CD16- и увеличение доли CD14++CD16+ и CD14+CD16++-клеток, что согласуется с данными других исследователей о повышенном содержании CD16+-моноцитов при РА [20-22].
Изменение субпопуляционного состава циркулирующих моноцитов за счет увеличения количества CD14+CDl6++-клеток было наиболее выраженным у больных РА с исходно
низкой стимуляторной активностью IFN-ДК в ауто-СКЛ (2-я группа). Проведение пульс-терапии МП у пациентов этой подгруппы приводило к уменьшению количества альтернативных моноцитов, но при этом усиливало исходно низкую стимуляторную активность генерируемых ДК. В тоже время, в оппозитной группе после пульс-терапии отмечался двукратный прирост CD14+CD16++-клеток, что сопровождалось значимым (ри = 0,006) снижением исходно высокой стимуляторной активности генерируемых ДК в 100 % случаев.
Кроме того, у обследованных больных РА исходно (до пульс-терапии) была выявлена обратная корреляционная взаимосвязь между относительным содержанием альтернативных моноцитов и способностью генерируемых IFN-ДК стимулировать пролиферацию аутологич-ных Т-лимфоцитов. Эта взаимосвязь проявлялась в виде тренда в отношении интактных ДК (Rs = -0,46; p = 0,18) и была статистически значимой (Rs = -0,71; p = 0,02) при анализе ДК, модифицированных дексамета-зоном. Можно предположить, что низкая стимулятор-ная активность ДК в ауто-СКЛ связана с повышенным содержанием CD14+CD16++ моноцитов в общем пуле моноцитов, являющихся клетками-предшественниками ДК, и что ДК, генерируемые из альтернативных моноцитов, являются мишенями ингибирующего/толероген-ного действия глюкокортикоидов in vitro.
Согласно данным литературы, изменение структуры пула циркулирующих моноцитов может влиять на свойства дифференцирующихся из них ДК. Предполагается, что, классические CD14++CD16--моноциты дифференцируются в ДК, индуцирующие сильный иммунный ответ, тогда как альтернативные CD14+CD16++ -моноциты дают начало толерогенным ДК [23, 24]. Так, Sánchez-Torres С. С соавт. показали, что ДК, генерируемые из CD16+-моноцитов, характеризуются меньшей экспрессией IL-12p40 мРНК, низким уровнем продукции IL-12, более высокой экспрессией TGF-pi мРНК и усиливают секрецию Т-клетками IL-4 по сравнению с ДК, генерируемыми из CD16-негативных моноцитов [25]. Моноциты с повышенной экспрессией CD16 у больных сепсисом дифференцируются в ДК, индуцирующие анергию Т-лимфоцитов и генерацию T-reg [26], а у больных туберкулезом легких - в ДК, которые характеризуются низкой антигенпрезентирую-щей способностью [27]. Полученные нами данные впервые продемонстрировали сопряженность альтернативных моноцитов, как источника генерируемых IFN-ДК, со снижением их стимуляторной активности в отношении аутологичных Т-лимфоцитов у больных РА.
Относительно влияния глюкокортикоидов на субпопуля-ционный состав моноцитов Dayyani F. с соавт. на здоровых донорах показали, что высокие дозы глюкокортикоидов способны вызывать апоптоз и селективную деплецию CD16+-моноцитов в силу более высокой экспрессии на них глюко-кортикоидных рецепторов [28]. Fingerle-Rowson G. с соавт. [16] также продемонстрировали кратковременную (в течение недели) деплецию CD16+-моноцитов у больных рассеянным склерозом после пульс-терапии глюкокортикоидами. В то же время Liu В. с соавт. наблюдали увеличение доли CD16+-клеток с фенотипом промежуточных моноцитов у больных с аутоиммунным увеитом на фоне приема таблетированных форм глюкокортикоидов [29]. Результаты настоящего исследования показывают, что эффект пульс-терапии глюкокортикои-дами на популяцию альтернативных CD14+16++-моноцитов у больных РА зависит от их исходного уровня - у пациентов с повышенным содержанием этих клеток их количество после пульс-терапии значимо снижается (рц = 0,028), а у пациентов с относительно низким содержанием - возрастает практически в 2 раза (p > 0,05). Однако вопрос, насколько этот прирост связан со снижением стимуляторной активности генерируемых ДК, остаётся открытым и требует дальнейших исследований. Это обусловлено тем, что при исследовании связи между суб-популяционным составом моноцитов и стимуляторной активностью генерируемых ДК учитывались данные, полученные в ауто-СКЛ, а в этом случае функциональная активность ДК после пульс-терапии могла детерминироваться не только свойствами самих ДК, но и чувствительностью Т-лимфоцитов к действию глюкокортикоидов [30].
Финансирование. Исследование поддержано грантом РФФИ № 18-015-00215 «Гетерогенность циркулирующих моноцитов как фактор, детерминирующий свойства дендритных клеток моноцитарного происхождения».
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
литература
14. Курочкина Ю.Д., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Тыринова Т.В., Баторов Е.В., Сизиков А.Э., Останин А.А., Черных Е.Р. Влияние дексаметазона на интерферон-а-индуцированную дифференциров-ку моноцитов в дендритные клетки. Мед. иммунология. 2016; 18 (4): 347-56.
15. Черных Е.Р., Курочкина Ю.Д., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Тыринова Т.В., Сизиков А.Э., Чумасова О.А., Останин А.А. Интерферон-альфа-индуцированные дендритные клетки у больных ревматоидным артритом и их чувствительность к дексаметазону. Мед. иммунология. 2017; 19 (3): 255-66.
references
1. Tsark E.C., Wang W., Teng Y.C., Arkfeld D., Dodge G.R., Kovats S. Differential MHC class II-mediated presentation of rheumatoid arthritis autoantigens by human dendritic cells and macrophages. J. Immunol. 2002; 169(11): 6625-33.
2. Khan S., Greenberg J.D., Bhardwaj N. Dendritic cells as targets for therapy in rheumatoid arthritis. Nat. Rev. Rheumatol. 2009; 5(10): 566-71.
3. Wenink M.H., Han W., Toes R.E.M., Radstake T.R.D.J. Dendritic cells and their potential implication in pathology and treatment of rheumatoid arthritis. Handb. Exp. Pharmacol. 2009; 188: 81-98.
4. Liu J., Cao X. Regulatory dendritic cells in autoimmunity: a comprehensive review. J. Autoimmun. 2015; 63: 1-12.
5. Hilkens C.M.U., Isaacs J.D. Tolerogenic dendritic cells in clinical practice. Open Arthritis Journal. 2010; 3: 8-12.
6. Torres-Aguilar H., Aguilar-Ruiz S.R., Gonzalez-Perez G., Munguia R., Bajaсa S., Meraz-Rios M.A., Sanchez-Torres C. Tolerogenic dendritic cells generated with different immunosuppressive cytokines induce antigen-specific anergy and regulatory properties in memory CD4+ T cells. J. Immunol. 2010; 184(4): 1765-75.
7. Piemonti L., Monti P., Allavena P., Sironi M., Soldini L., Leone B.E. et al. Glucocorticoids affect human dendritic cell differentiation and maturation.
ORIGINAL ARTICLE
J. Immunol. 1999; 162(11): 6473-81.
8. Xia C.Q., Peng R., Beato F., Clare-Salzler M.J. Dexamethasone induces IL-10-producing monocyte-derived dendritic cells with durable immaturity. Scand. J. Immunol. 2005; 62(1): 45-54.
9. Unger W.W., Laban S., Kleijwegt F.S., van der Slik A.R., Roep B.O. Induction of Treg by monocyte-derived DC modulated by vitamin D3 or dexamethasone: differential role for PD-L1. Eur J Immunol. 2009; 39(11): 3147-59.
10. León B., Ardavín C. Monocyte-derived dendritic cells in innate and adaptive immunity. Immunol. Cell. Biol. 2008; 86(4): 320-4.
11. Gessani S., Conti L., Del Corno M., Belardelli F. Type I interferons as regulators of human antigen presenting cell functions. Toxins (Basel). 2014; 6(6): 1696-723.
12. Runnblom L., Eloranta M.L. The interferon signature in autoimmune diseases. Curr. Opin. Rheumatol. 2013; 25(2): 248-53.
13. Rodriguez-Carrio J., de Paz B., Lуpez P., Prado C., Alperi-Lуpez M., Ballim-Garcm F.J., Suarez A. IFN-a serum levels are associated with endothelial progenitor cells imbalance and disease features in rheumatoid arthritis patients. PLoS One. 2014; 9(1): e86069.
14. Kurochkina Yu.D., Leplina O.Yu., Tikhonova M.A., Tyrinova T.V., Batorov E.V., Sizikov A.E. et al. Effect of dexamethasone on interferon-a-induced differentiation of monocytes to dendritic cells. Meditsinskaya immunologiya. 2016; 18(4): 347-56. (in Russian)
15. Chernykh E.R., Kurochkina Yu.D., Leplina O.Yu., Tikhonova M.A., Tyrinova T.V., Sizikov A.E. et al.IFNa-induced dendritic cells in patients with rheumatoid arthritis and their sensitivity to dexamethasone. Meditsinskaya immunologiya. 2017; 19(3): 255-66. (in Russian)
16. Fingerle-Rowson G., Angstwurm М., Andreesen R., Ziegler-Heitbrock H.W.L. Selective depletion of CD14+CD16+ monocytes by glucocorticoid therapy. Clin. Exp. Immunol. 1998; 112(3): 501-6.
17. Naranjo-Gómez M., Raich-Regué D., Oñate C., Grau-López L., Ramo-Tello C., Pujol-Borrell R. et al. Comparative study of clinical grade human tolerogenic dendritic cells. J. Transl. Med. 2011; 9: 89.
18. Harry R.A., Anderson A.E., Isaacs J.D., Hilkens C.M. Generation and characterization of therapeutic tolerogenic dendritic cells for rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis. 2010; 69(11): 2042-50.
19. Ziegler-Heitbrock L., Ancuta P., Crowe S., Dalod M., Grau V., Hart D.N. et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 2010; 116: e74-e80.
20. Kawanaka N., Yamamura M., Aita T., Morita Y., Okamoto A., Kawashima M. CD14+CD16+ blood monocytes and joint inflammation in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2002; 46: 2578-86.
21. Radwan W.M., Khalifa K.A., Esaily H.A., Lashin N.A. СD14++CD16+ monocyte subset expansion in rheumatoid arthritis patients: relation to disease activity and interleukin-17. Egypt. Rheumatolt. 2016; 38(3), 161-9.
22. Rossol M., Kraus S., Pierer M., Baerwald C., Wagner U. The CD14(bright) CD16+ monocyte subset is expanded in rheumatoid arthritis and promotes expansion of the Th17 cell population. Arth. Rheumat. 2012; 64(3): 671-7.
23. Sprangers S., de Vries T.J., Everts V. Monocyte heterogeneity: consequences for monocyte-derived immune cells. J. Immunol. Res. 2016; Article ID 1475435.
24. Peng Y., Latchman Y., Elkon K.B. Ly6Clow monocytes differentiate into dendritic cells and cross-tolerize T cells through PDL-1. J. Immunol. 2009; 182(5): 2777-85,
25. Sánchez-Torres C., García-Romo G.S., Cornejo-Cortés M.A, Rivas-Car-valho A., Sánchez-Schmitz G. CD16+ and CD16- human blood monocyte subsets differentiate in vitro to dendritic cells with different abilities to stimulate CD4+ T cells. Int. Immunol. 2001; 13(12): 1571-81.
26. Faivre V., Lukaszewicz A.C., Alves A., Charron D., Payen D., Haziot A. Human monocytes differentiate into dendritic cells subsets that induce an-ergic and regulatory T cells in sepsis. PLoS ONE. 2012; 7(10): e47209.
27. Balboa L., Romero M.M., Laborde E., Sabio Y., García C.A., Basile J.I. et al. Impaired dendritic cell differentiation of CD16-positive monocytes in tuberculosis: role of p38 MAPK. Eur. J. Immunol. 2013; 43(2): 335-47.
28. Dayyani F., Belge K.U., Frankenberger M., Mack M., Berki T., Ziegler-Heitbrock L. Mechanism of glucocorticoid-induced depletion of human CD14+CD16+ monocytes. J. Leukoc. Biol. 2003; 74(1): 33-9.
29. Liu B., Dhanda A., Hirani S., Williams E.L., Sen H.N., Martinez Estrada F. et al. CD14++CD16+ monocytes are enriched by glucocorticoid treatment and are functionally attenuated in driving effector T cell responses. J. Immunol. 2015; 194(11): 5150-60.
30. Hearing S., Norman M., Probert C., Haslam N., Dayan C. Predicting therapeutic outcome in severe ulcerative colitis by measuring in vitro steroid sensitivity of proliferating peripheral blood lymphocytes. Gut. 1999; 45(3): 382-8.
Поступила 15.01.18 Принята в печать 16.03.18
