CC BY
38
УДК 612.017:611.018.83:577.27
https://doi.org: 10.20538/1682-0363-2019-1-266-276
Фенотип и функции дендритных клеток человека, генерированных из субпопуляций моноцитов CD14+, оппозитных по экспрессии CD16
Черных Е.Р., Тыринова Т.В., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Курочкина Ю.Д., Олейник Е.А., Сахно Л.В., Останин А.А.
Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии (НИИФКИ) Россия, 630099, Новосибирск, ул. Ядрищевская, 14
РЕЗЮМЕ
Цель исследования. Анализ взаимосвязи между субпопуляционной принадлежностью моноцитов и фенотипом и (или) функциями генерируемых дендритных клеток (dendrite cells, DC), а также их чувствительностью к толерогенному действию дексаметазона.
Материалы и методы. В исследование включены 15 здоровых доноров. DC генерировали с интерфероном альфа (IFNa) и колониестимулирующим фактором гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF) из обогащенной популяции CD14+ моноцитов периферической крови с деплецией (CD16-Мо-DC) и без деплеции (CD16+Мо-DC) CD16+ клеток. Субпопуляции моноцитов получали методом магнитной сепарации.
Результаты. CD16+Мо-DC характеризовались большим содержанием зрелых DC (CD83+CD14) и меньшим количеством клеток промежуточной степени зрелости (CD14+CD83+), но были сопоставимы с CD16-Мо-DC по экспрессии HLA-DR и CD86, участвующих в презентации антигенов и активации наивных Т-клеток, а также ингибиторных (толерогенных) молекул B7-H1 и TLR-2. При этом CD16+-Мо-DC проявляли более высокую аллостимуляторную активность, которая прямо коррелировала с экспрессией CD86 (rs = 0,69) и обратно - с экспрессией TLR-2 (rs = -0,72). Аллостимуляторная активность CD16-Мо-DC находилась в прямой взаимосвязи с количеством зрелых CD14-CD83+DC и CD14+CD83+DC промежуточной степени зрелости. Добавление дексаметазона (10-6 M) в культуры CD16-Мо-DC и CD16+Мо-DC сопровождалось задержкой созревания DC, снижением экспрессии CD86 и повышением TLR-2, а также увеличением количества клеток с ингибиторным фенотипом CD86-B7-H1+, что, в свою очередь, ассоциировалось со снижением аллостимуляторной активности DC. Снижение индекса соотношения CD86+/TLR-2+ клеток в популяции CD16+Мо-DC в большей степени обусловлено уменьшением количества CD86+DC, а в популяции CD16-Мо-DC - возрастанием числа клеток TLR-2+. При этом ингибирующий эффект дексаметазона на созревание DC был более выраженным в популяции CD16+Мо-DC.
Заключение. CD14+ моноциты, как содержащие, так и истощенные по CD16+клеткам, дифференцируются в присутствии IFNa в DC, однако наличие в общем пуле моноцитарных предшественников CD16+ клеток ассоциируется с генерацией DC с более зрелым фенотипом и высокой аллостимуля-торной активностью. DC, генерированные из субпопуляций моноцитов, оппозитных по экспрессии CD16, характеризуются чувствительностью к супрессорному эффекту дексаметазона. При этом то-лерогенная активность дексаметазона в субпопуляциях CD16-Мо-DC и CD16+Мо-DC опосредуется с вовлечением различных механизмов.
Ключевые слова: дендритные клетки, интерферон альфа, аллостимуляторная активность, дексаме-тазон.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Н Черных Елена Рэмовна, e-mail: ct_lab@mail.ru.
Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 18-015-00215-А.
Соответствие принципам этики. Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом Научно-исследовательского института фундаментальной и клинической иммунологии (протокол № 104 от 12.01.2018).
Для цитирования: Черных Е.Р., Тыринова Т.В., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Курочкина Ю.Д., Олейник Е.А., Сахно Л.В., Останин А.А. Фенотип и функции дендритных клеток человека, генерированных из субпопуляций моноцитов CD14+, оппозитных по экспрессии CD16. Бюллетень сибирской медицины. 2019; 18 (1): 266-276. https://doi.org: 10.20538/1682-0363-2019-1-266-276.
УДК 612.017:611.018.83:577.27
https://doi.org: 10.20538/1682-0363-2019-1-266-276
Phenotype and functions of human dendritic cells derived from CD14+ monocyte subsets opposed to CD16 expression
Chernykh E.R., Tyrinova T.V., Leplina O.Yu., Tikhonova M.A., Kurochkina Yu. D., Oleynik E.A., Sakhno L.V., Ostanin A.A.
Federal State Budgetary Scientific Institution Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology (RIFCI) 14, Yadrintsevskaya Str., Novosibirsk, 630099, Russian Federation
ABSTRACT
The aim of the study was to analyze the relationship between monocyte subpopulations and phenotype/ functions of monocyte-derived dendritic cells (DCs), as well as DC sensitivity to the tolerogenic effect of dexamethasone.
Materials and methods. The study included 15 healthy donors. DCs were generated by cultivating enriched fractions of CD14+ monocytes with or without CD16+cell depletion (CD16-Mo-DCs or CD16+Mo-DCs, respectively) in the presence of interferon alpha (IFNa) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). Monocyte subpopulations were obtained by immunomagnetic negative selection.
Results. CD16+Mo-DCs were characterized by higher percentage of mature (CD83+CD14-) and lower number of semi-mature (CD14+CD83+) cells, but were similar to CD16-Mo-DCs by HLA-DR and CD86 expression, involved in the presentation of antigens and activation of naive T-cells. and also to co-inhibitory/ tolerogenic molecules B7-H1 and TLR-2. CD16+Mo-DCs displayed higher allostimulatory activity, which was positively correlated with CD86 expression (r = 0.69; p = 0.027) and negatively - with TLR-2 expression (rs = -0.72; p = 0.1). Allostimulatory activity of CD16-Mo-DCs was positively correlated with the number of mature CD14-CD83+DCs and semi-mature CD14+CD83+DCs. Addition of dexamethasone (10-6 M) into CD16-Mo-DCs and CD16+Mo-DCs cultures led to the delay of DC maturation, the decrease of CD86 and the increase of TLR-2 expression, as well as the increase of cells with co-inhibitory CD86-B7-H1+ phenotype that was positively correlated with the reduction of DC allostimulatory activity. The decrease of CD86+/TLR-2+ index in CD16+Mo-DC population was due to the reduction of CD86+DCs and in CD16-Mo-DC population - to the increase of TLR-2+cells. Dexamethasone possessed higher inhibitory effect on DC maturation in the CD16+Mo-DC cultures.
Conclusion. CD14+ monocytes, both contained and depleted by CD16+ cells, can differentiate into DCs when cultured with IFNa. The presence of CD16+ cells in whole blood monocyte pool is associated with generation of DCs showed a more mature phenotype and higher allostimulatory activity. Both CD16- and CD16+ monocyte-derived DCs are sensitive to suppressive effect of dexamethasone. However, dexamethasone tolerogenic effect involves different mechanisms in CD16-Mo-DCs and CD16+Mo-DCs.
Key words: dendritic cells, interferon-a, allostimulatory activity, dexamethasone.
Conflict of interest. The authors declare the absence of obvious and potential conflicts of interest related to the publication of this article.
Source of financing. The study was supported by the Russian Foundation for Basic Research as part of the research project No. 18-015-00215-A.
Conformity with the principles of ethics. The study approved by the local ethics committee under Federal State Budgetary Scientific Institution Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology (Protocol No. 104 of 12.01.2018).
For citation: Chernykh E.R., Tyrinova T.V., Leplina O.Yu., Tikhonova M.A., Kurochkina Yu. D., Oley-nik E.A., Sakhno L.V., Ostanin A.A. Phenotype and functions of human dendritic cells derived from CD14+ monocyte subsets opposed to CD16 expression. Bulletin of Siberian Medicine. 2019; 18 (1): 266-276. https://doi.org: 10.20538/1682-0363-2019-1-266-276.
ВВЕДЕНИЕ
Циркулирующие моноциты человека представлены гетерогенной популяцией, которая включает классические (CD14+CD16-), промежуточные (CD14++CD16+) и неклассические (CD14+CD16++) моноциты, различающиеся не только фенотипи-чески, но и функционально [1]. Классические моноциты являются доминирующей субпопуляцией, тогда как количество ОБ^-позитивных клеток не превышает 10-20% [1-4]. Однако при различных патологических состояниях это соотношение может существенно меняться. Поскольку моноциты являются предшественниками дендритных клеток (dendritic cell, DC), нельзя исключить, что изменения в структуре пула циркулирующих моноцитов могут сказываться на процессах дифференциров-ки, созревания и функциях генерируемых DC.
Дендритные клетки, являясь специализированными антигенпрезентирующими клетками, способны как стимулировать иммунный ответ, так и индуцировать толерантность [5]. Роль различных субпопуляций моноцитов в детерминировании функциональной активности генерируемых из них DC в последние годы активно обсуждается. Тем не менее имеющиеся данные противоречивы [6, 7] и не позволяют однозначно ответить на вопрос, в какой степени функции DC связаны с фенотипом моноцитов-предшественников. Следует также отметить, что исследования такого рода проводятся с использованием DC, генерированных из моноцитов в присутствии интерлейкина (IL) 4 (IL-4-DC) [8]. Между тем альтернативным индуктором дифференцировки моноцитов в DC является интерферон альфа (IFNa) [9]. Замена IL-4 на IFNa позволяет получить IFN-DC с промежуточным типом зрелости, которые отличаются большей стабильностью, более выраженной миграционной, Th1- или провоспалительной и противоопухолевой цитотоксической активно-
стью [10, 11]. Участие клеток отдельных субпопуляций моноцитов в генерации IFN-DC совсем не исследовано. Неясным также остается вопрос, могут ли различные субпопуляции моноцитов детерминировать чувствительность генерируемых DC к толерогенным сигналам.
Одним из ключевых эндогенных медиаторов толерогенной активности DC являются глюко-кортикоиды, уровень которых возрастает при любых стресс-реакциях, сопровождающих воспалительный процесс. Проведенные нами ранее исследования показали, что дексаметазон in vitro подавляет созревание IFN-DC, усиливает экспрессию толерогенных молекул (TLR-2), снижает цитокин-секреторную и аллостимулятор-ную активность DC [12]. При этом выраженность толерогенного фенотипа дексаметазон-модифи-цированных IFN-DC прямо коррелировала с содержанием неклассических клеток CD14+CD16++ среди моноцитов-предшественников (данные не опубликованы).
Целью настоящей работы явилось изучение взаимосвязи между субпопуляционной принадлежностью моноцитов и фенотипом и (или) функциями генерируемых IFN-DC, а также их чувствительностью к толерогенному действию дексаметазона.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследование были включены 15 здоровых доноров обоего пола в возрасте 20-54 лет. Забор крови и все исследования проводили после получения письменного информированного согласия. Мононуклеарные клетки (MNC) выделяли центрифугированием гепаринизированной венозной крови в градиенте плотности фиколла-верогра-фина. Для выделения моноцитов из полученной взвеси MNC использовали наборы магнитных бус (Easy Sep™, STEMCELL Technologies Inc., Кана-
да), позволяющие получить популяции моноцитов СШ4+ с деплецией (СБ14+СБ16-) и без де-плеции клеток СБ16+ (СШ4+СШ6+). Магнитную сепарацию осуществляли согласно инструкциям производителя. Контроль чистоты выделенных субпопуляций моноцитов проводили методом проточной цитофлуориметрии с использованием
ИТС-конъюгированных анти-СШ4- и Ре-конъю-гированных анти-СБ16-антител (ББ РЬагМт§еп, США). Содержание моноцитов СБ14+ и СБ16+ во фракции СБ14+ с деплецией СБ16+ составляло (80,6 ± 4,5) и (3,4 ± 0,5)%, а во фракции моноцитов СБ14+ без деплеции СБ16+ - (64,8 ± 3,5) и (27,2 ± 3,4)% соответственно (рис. 1).
Контроль Control
MNCs
CD14+
CD14+ CD16+
CD14
id' п 1 i 1 i id i i id id id id id id id 14
CD16
«I 1 i
ewe Pe
1С 16 1 d id
CDISPe
Рис. 1. Экспрессия антигенов CD14 и CD16 до и после магнитной сепарации: репрезентативные гистограммы флуоресценции антигенов CD14 и CD16, экспрессируемых мононуклеарными клетками (MNCs) до магнитной сепарации, а также выделенные субпопуляциями CD14+ моноцитов с деплецией (моноциты CD14+CD16-) и без
деплеции клеток CD16+ (моноциты CD14+CD16+) Fig. 1. CD14 and CD16 molecule expression before and after immunomagnetic selecetion:b the flow cytometric histograms represent CD14 and CD16 antigens expressed by the start MNCs and final enriched fractions of CD14+ monocytes with CD16+cell depletion (CD14+CD16- monocytes) and without CD16+cell depletion (CD14+CD16+ monocytes) using
immunomagnetic negative selection
Дендритные клетки генерировали путем культивирования выделенных моноцитов CD14+CD16-и CD14+CD16+ в 6-луночных планшетах (Nunclon, Дания) в течение 3-4 сут в среде RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, США), дополненной 0,3 мг/мл L-глютамина, 5 мМ HEPES-буфера, 100 мкг/ мл гентамицина и 2,5% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS, БиолоТ, г. Санкт-Петербург), в присутствии гранулоцитарно-макрофагально-го колониестимулирующего фактора (GM-CSF) (40 нг/мл, Sigma-Aldrich) и IFNa (1000 Ед/мл, Роферон-А, Roche, Швейцария). Для индукции созревания DC на 4-е сут вносили липополисаха-рид (ЛПС, 10 мкг/мл, LPS Е. coli 0114:B4, Sigma-Aldrich) и продолжали культивировать в течение 24 ч. В отдельной серии экспериментов на этапе дифференцировки за 1 сут до внесения ЛПС в культуры DC добавляли дексаметазон (10-6 M).
Оценку фенотипа IFN-DC проводили методом проточной цитофлуориметрии (FACS Calibur, Becton Dickinson, США) с использованием FITC-
или Ре-меченных моноклональных анти-СБ14, -СБ83, -НЬЛ-БИ, -СБ123, -СБ86, -ТЬИ-2 и Б7-Н1/ СБ274 антител (ББ РЬагМт§еп, США). В качестве негативного контроля использовали изотипиче-ские антитела, конъюгированные с аналогичными флуорохромами (ББ РЬагМт§еп, США).
Стимуляторную активность оценива-
ли в аллогенной смешанной культуре лимфоцитов (алло-СКЛ), используя в качестве отвечающих клеток аллогенные ММС доноров (0,1* 106/ лунку), которые культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах в среде ИРМ1-1640 в присутствии 10% инактивированной сыворотки крови АВ (IV) группы при 37 °С в СО2-инкубато-ре. Стимуляторами служили в соотноше-
нии ММС : БС = 10 : 1. Пролиферативный ответ оценивали на 5-е сут радиометрически по включению 3Н-тимидина (1 мкКю на лунку), вносимого за 18 ч до окончания культивирования.
Статистическую обработку данных проводили при помощи пакета прикладных программ
6.0. Для выявления значимых различий сравниваемых показателей использовали непараметрический '-критерий Вилкоксона (для связанных, парных выборок). Для анализа взаимосвязей между исследуемыми параметрами использовали коэффициент корреляции Спирмена (г) Результаты представлены в виде М ± ££, где М - среднее значение, ££ - ошибка среднего. Различия считали достоверными при уровне значимости р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Учитывая малочисленность в общем пуле моноцитов крови клеток СО16+, получение достаточного количества промежуточных и неклассических моноцитов для дальнейшего исследования и генерации из них ОС представлялось технически сложным. Поэтому был использован метод магнитной сепарации для выделения из М№С обогащенной популяции моноцитов СО14+ с деплеци-ей и без деплеции клеток СО16+ (СО14+СО16- и СО14+СО16+ субпопуляции соответственно). Такой подход позволял выяснить, каким образом присутствие или отсутствие промежуточных и неклассических моноцитов СО16+ влияет на фе-
нотип и функции ¡Б^ОС. Моноциты СО14+СО16-и СО14+СО16+ получали от одних и тех же доноров, что давало возможность сравнить два типа генерируемых ОС (СО16-Мо-ОС и СО16+Мо-ОС), полученных от одного индивида.
Фенотипический анализ ОС, генерированных из моноцитов СО14+СО16- и СО14+СО16+, показал, что присутствие клеток СО16+ в общей популяции моноцитов ассоциировалось с почти двукратным уменьшением количества ОС промежуточной степени зрелости (СО14+СО83+) по сравнению с культурами СО16-Мо-ОС (рис. 2, а). При этом содержание зрелых СО14-СО83+ОС и клеток с незрелым фенотипом (СО14+СО83-) среди СО16-Мо-ОС и СО16+Мо-ОС значимо не различалось. Тем не менее среди ОС, экспрессирую-щих СО83, относительное содержание (%) зрелых клеток СО83+СО14- в популяции СО16+Мо-ОС было в среднем в 1,7 раза выше (р = 0,076), чем в популяции СО16-Мо-ОС (рис. 2, Ь). Таким образом, отсутствие клеток СО16+ в общей популяции моноцитарных предшественников ведет к их дифференцировке в ]Р№-ОС с менее зрелым фенотипом и преобладанием ОС промежуточной степени зрелости.
%
т.
п CD16-Mo-DC н CD16+Mo-DC
¿Û
CD14+ CD8r CD14+ CD83+ CD14- CD83+
100 30 ЕО 40 20 О
CD14" CD14-
C014* CD14f
CD16-Mo-DC
CD16+Mo-DC
%
80 00 40 20
0
о CD16-Mo-DC ■ CD16+Mo-DC
rté
Й
HLA-DR CD86
TLR-2 B7-H1
; 4000 2000 о
d
MNC+ MNC+
CD16-Mo-DC CD16+Mo-DC
Рис. 2. Фенотип и аллостимуляторная активность IFN-DC, генерированных из CD16 и CD16+ моноцитов: a - DC, экспрессирующие CD14 и CD83, n = 7, %; b - CD14- и CD14+ среди CD83+DC (n = 7), %; с - HLA-DR+ (n = 8), CD86+ (n = 7), B7-H1+ (n = 7) и TLR-2+ (n = 6) в популяциях СТ^Мо^ и Ш16+Мо^С %; d - пролифера-тивный ответ MNC в алло-СКЛ в отсутствии IFN-DC (MNC) и присутствии указанных типов IFN-DC, имп/мин,
M ± SE. Здесь и на рис. 3, 4: * р < 0,05 (непараметрический W-критерий Вилкоксона) Fig. 2. Phenotype and allostimulatory activity of CD16- and CD16+ monocyte-derived IFN-DCs: a - the relative number of DCs expressing CD14 and CD83, n = 7; b - the proportion of CD14- and CD14+ cells among CD83+DCs, n = 7; с -the relative number of HLA-DR+ (n = 8), CD86+ (n = 7), B7-H1+ (n = 7) and TLR-2+ (n = 6) cells in СТ^Мо-DC and ОТ^+Мо-DC cultures; d - and proliferive response of MNCs in allo-MLC test (cpm) in the absence of IFN-DCs (MNCs), as well as in presence of signed subtypes of IFN-DCs in allo-MLC test, M ± SE. * Here and at Fig. 3, 4 : р <
0.05 (nonparametric Wilcoxon Test)
b
a
MNC
с
Популяции СБ16-Мо-БС и СБ16+Мо-БС были сопоставимы по относительному содержанию клеток, экспрессирующих НЬЛ-БИ и СБ86, участвующих в презентации антигенов и активации наивных Т-клеток. При этом оба типа БС не различались по количеству клеток, экспрессирую-щих ингибиторные (толерогенные) молекулы Б7-Н1 и ТЬИ-2 (см. рис. 2, с).
Оценка стимуляторной активности ]РМ-БС в алло-СКЛ показала (рис. 2, с1), что способность СБ16+Мо-БС индуцировать пролиферативный ответ Т-клеток на аллоантигены была в среднем на 63% ДОИ 18-76%) выше, чем у СБ16-Мо-БС (р = 0,028). При этом аллостимуляторная активность СБ16+Мо-БС находилась в прямой корреляционной связи с долей СБ86+ БС (г5 = 0,69; р = 0,027) и отрицательно коррелировала с количеством ТЬИ-2+ БС (г5 = -0,72; р = 0,1). В свою очередь, аллостимуляторная активность СБ16-Мо-БС прямо коррелировала с содержанием СБ14+СБ83+БС и СБ14-СБ83+БС (го = 0,84; р = 0,038). Таким образом, более низкая аллостимуляторная активность СБ16-Мо-БС, по-видимому, обусловлена меньшей степенью зрелости этой популяции ]РМ-БС, тогда как для СБ16+Мо-БС эта функция детерминируется балансом костимуляторных (СБ86) и ингиби-торных (ТРИ2) молекул.
Поскольку одним из ключевых медиаторов толерогенной активности БС являются глюко-кортикоиды, на следующем этапе было изучено влияние деплеции моноцитов СБ16+ на чувствительность генерируемых ]Р№-БС к дексаметазо-ну. Добавление дексаметазона на этапах генерации СБ16-Мо-БС и СБ16+Мо-БС сопровождалось практически двукратным возрастанием количества незрелых СБ14+СБ83- и снижением доли зрелых СБ14-СБ83+БС (рис. 3). Эти изменения были более выражены и статистически значимы в популяции СБ16+Мо-БС (рис. 3, а), тогда как в культурах СБ16-Мо-БС проявлялись в виде отчетливого тренда (р = 0,07-0,11). Таким образом, СБ16+Мо-БС более чувствительны к действию дексаметазона, что подтверждалось при анализе изменений под действием дексаметазона соотношения клеток СБ14- и СБ14+ среди БС, экспрессирующих СБ83 (рис. 3, Ь). Обработка дек-саметазоном СБ16+Мо-БС приводила к более выраженному сдвигу баланса в сторону клеток промежуточной степени зрелости, коэкспресси-рующих СБ14 и СБ83 (р = 0,028). В то же время в культурах СБ16-Мо-БС изменение соотношения менее зрелых СБ14+СБ83+ и зрелых СБ14-СБ83+БС не было статистически достоверным (р > 0,05).
50 40 30 £0 10 0
□ CD14+ CD83-" CD14+ CD83+ I- CD14- CD83+
1
а
CD16-Mo-DC CD16-Mo-DC CD16+Mo-DC CD16+Mo-DC
(+Dex)
(+Dex)
20 0
CD14-
CD16-Mo-DC CD16-Mo-DC CD16+Mo-DC CD16+Mo-DC
(+Dex)
(+Dex)
b
a
CD16-Mo-DC
100 80 60 40
z 0
□ +Dex
CD16-Mo-DC
T
100 30 60 40
0
□ +Dex
+
I
:
i
HLA-DR
d
HLA-DR
Рис. 3. Влияние дексаметазона на фенотип IFN-DC, генерированных из моноцитов CD16 и CD16+: a - DC, экс-прессирующие CD14 и CD83 (n = 6); b - CD14- и CD14+ среди CD83+DC (n = 6); с, d - HLA-DR+ (n = 6), CD86+ (n = 6), B7-H1+ (n = 6) и TLR-2+ (n = 4) в популяциях CD16-Мо-DC и CD16+Мо-DC, генерированных в стандартных условиях и в присутствии дексаметазона (+Dex), %, М ± SE Fig. 3. The effect of dexamethasone on the phenotype of CD16- and CD16+ monocyte-derived IFN-DCs: a - DC expressing CD14 and CD83 (n = 6); b - the proportion of CD14- and CD14+ cells among CD83+DCs (n = 6); с, d -the relative number of HLA-DR+ (n = 6), CD86+ (n = 6), B7-H1+ (n = 6) and TLR-2+ (n = 4) cells in CD16-Мо-DCs and CD16+Мо-DCs generated under standard conditions and in the presence of dexamethasone (+Dex), %, M ± SE
CD86
CD86
с
Добавление дексаметазона на этапе диффе-ренцировки моноцитов СШ4+СШ6" и СШ4+СШ6+ в ЭС по-разному влияло на экспрессию костиму-ляторных и толерогенных молекул (СЭ86 и ТЬИ-2 соответственно). Из данных рисунка следует (рис. 3, с и с1), что под действием дексаметазона отмечалось снижение относительного содержания клеток СЭ86+: статистически значимое в популяции СШ6+Мо-0С (р = 0,04), а в культурах СШ6-Мо-ОС в виде отчетливой тенденции (р = 0,12). При этом дексаметазон индуцировал достоверное возрастание клеток ТЬИ-2+ среди СШ6-Мо-ОС и в культурах СШ6+Мо-ОС - в виде тренда. Как следствие, в популяциях СЭ16-Мо-ЭС и СШ6+Мо-ОС после контакта с дексамета-зоном наблюдалась инверсия индекса соотношения клеток СЭ86+/ТЬК-2+ и его снижение в среднем с (2,3 ± 0,9) до (0,75 ± 0,05) расч. ед. (р = 0,06), что свидетельствовало о сдвиге балан-
са от стимуляторных С086+0С в сторону толерогенных клеток ТЬИ-2+.
Обработка дексаметазоном не оказывала влияния на экспрессию НЬЛ-ОИ антигенов и инги-биторной молекулы В7-Н1. Тем не менее анализ коэкспрессии СЭ86 и В7-Н1 показал (рис. 4), что дексаметазон более чем в два раза увеличивал относительное содержание клеток СЭ86-В7-Н1+ как в популяции СШ6-Мо-ОС, так и среди СШ6+-Мо-ЭС (р = 0,04). Количество клеток, коэкспрессиру-ющих СЭ86 и В7-Н1, при этом снижалось, достигая статистически значимого уровня в культурах СЭ16+ Мо-ЭС (р = 0,04).
Сравнительный анализ аллостимуляторной активности ]Г^ОС показал (рис. 5), что дексаметазон подавлял способность как СБ16-Мо-ОС, так и СБ16+Мо-ОС индуцировать пролиферативный ответ MNC на аллоантигены (р = 0,008 и р = 0,005 соответственно).
CD16-Mo-DC
80
ео
40
20
м.
по
1+Dex
I ■
SO
Е0
40
20
CD16+Mo-DC *
ll
о
□ +Dex
k.
L
CDB6+ B7-H1- CD3S+ B7-H1+ CD86- B7-H1 +
CD86+ B7-H1- CD86+ B7-H1 + CD86-B7-H1 +
CD16-Mo-DC
Ф CO
a
о
13,75% . Щ 73,214 ifllt
is". 11,311
CD16-Mo-DC
+Dex
CD16+Mo-DC
15,92% 51,80%
* ■ к(Л
. 25,21е/
3 ^
8,46% Л. - 82,81^
V- 1,53%
CD16+Mo-DC
+Dex
е,ез% 51,46"X
■ '.№ 28,64}
b
a
B7+H1
с
Рис. 4. Влияние дексаметазона на экспрессию CD86 и B7-H1 на IFN-DC, генерированных из CD16- и CD16+ моноцитов: DC, экспрессирующие CD86 и B7-H1, в популяциях CD16-Mo-DC (a) и CD16+Mo-DC (b), генерированных в стандартных условиях и с дексаметазоном (+Dex), %, М ± SE. Представлены индивидуальные DotPlot гистограммы распределения CD16-Мо-DC и CD16+Мо-DC, генерированных стандартно и в присутствии дексаметазона по флуоресценции FITC-меченных анти-В7-Н1- и РЕ-меченных анти-CD86-антител (с). Левый верхний квадрант - CD86+B7-H1- клетки, правый верхний квадрант - CD86+B7-H1+ клетки, правый нижний квадрант -
CD86-B7-H1+клетки
Fig. 4. The effect of dexamethasone on CD86 and B7-H1 expression on CD16- and CD16+ monocyte-derived IFN-DC The data are presented in the form of М ± SE of the relative number of DC expressing CD86 and B7-H1 in CD16-Мо-DC (a) and CD16+Мо-DC cultures (b) generated under standard conditions and in the presence of dexamethasone (+Dex). Representative flow cytometric dot plots of co-staining of FITC-conjugated anti-B7-H1 and PE-conjugated anti-CD86 monoclonal antibodies on CD16-Мо-DC and CD16+Мо-DC generated under standard conditions and in the presence of dexamethasone (+Dex) are illustrated at (c). Upper left quadrant - CD86+B7-H1-cells, upper right quadrant
- CD86+B7-H1+ cells, lower right quadrant - CD86-B7-H1+ cells
8000
6000
**
4000
2000
r*-i_U_U_U___
0 MNC MNC+ MNC+ MNC+ MNC+
CD16-Mo-DC CD16-Mo-DC CD16+Mo-DC CD16+Mo-DC (+Dex) (+Dex)
Рис. 5. Влияние дексаметазона на аллостимуляторную активность IFN-DC, генерированных из CD16- и CD16+ моноцитов: пролиферативный ответ MNC в алло-СКЛ в отсутствии IFN-DC (MNC) и присутствии CD16-Мо-DC и CD16+Мо-DC, генерированных в стандартных условиях и с дексаметазоном (+Dex), имп/мин, M ± SE.
** р < 0,01 (непараметрический W-критерий Вилкоксона). Fig. 5. The effect of dexamethasone on allostimulatory activity of CD16- and CD16+ monocyte-derived IFN-DC: proliferative response of MNC in allo-MLC test in the absence of IFN-DC (MNC), as well as in presence of CD16-Мо-DC and CD16+Мо-DC cultures generated under standard conditions and in the presence of dexamethasone (+Dex), cpm,
M ± SE. ** р < 0.01 (nonparametric Wilcoxon test)
Одной из причин снижения функциональной активности БС после обработки дексаметазоном является гормон-индуцированное повышение количества БС, экспрессирующих ко-ингибиторные (толерогенные) молекулы (В7-Н1, ТЬИ-2). Действительно, проведенный корреляционный анализ показал, что аллостимуляторная активность обеих исследуемых популяций, обработанных дек-саметазоном, находится в обратной взаимосвязи с содержанием среди них клеток СБ86-В7-Н1+ (г5 = -0,72; р < 0,05).
ОБСУЖДЕНИЕ
В работе показано, что популяции моноцитов СБ14+, содержащие и истощенные по клеткам СБ16+, дифференцируются в БС, различающиеся по фенотипу и функциям. Промежуточные и неклассические моноциты СБ16+ дифференцируются в ]Т№-БС с большей степенью зрелости по сравнению с БС, полученными из популяции классических клеток СБ14+СБ16-. Так, в отличие от СБ16-Мо-БС для СБ16+Мо-БС характерно меньшее количество клеток СБ14+СБ83+ промежуточной степени зрелости, преобладание СБ14-негативных клеток в структуре СБ83+БС, а также более выраженная способность индуцировать пролиферативный ответ в алло-СКЛ. Несмотря на отсутствие различий в экспрессии стимуляторных (НЬЛ-БИ, СБ86) и ингибитор-ных молекул (В7-Н1, ТЬИ-2) на СБ16+Мо-БС и СБ16-Мо-БС, более низкая аллостимуляторная активность БС, генерированных из классических
моноцитов CD14+CD16-, по-видимому, обусловлена меньшей степенью зрелости этой популяции IFN-DC, тогда как для CDW+Мо^С эта функция детерминируется балансом костимуляторных (CD86) и ингибиторных (TLR-2) молекул.
Полученные данные согласуются с результатами других авторов. Показано, например, что повышение количества клеток CD16+ среди общего пула циркулирующих моноцитов ассоциируется с более зрелым статусом генерированных DC in vitro [13]. Очевидно, неклассические клетки CD14+CD16++ являются более зрелой формой моноцитов. Об этом свидетельствует более выраженная (по сравнению с классическими и промежуточными моноцитами) экспрессия про-апоптотических и антипролиферативных генов, ассоциированных с высоко дифференцированным статусом клеток; более высокая экспрессия антигенов MHC II класса и костимуляторных молекул; низкая фагоцитарная и повышенная ал-лостимуляторная активность, а также меньшая длина теломер [6, 14, 15]. Кроме того, именно в неклассических моноцитах экспрессируется определенный набор генов (SIGLEC10, CD43, RARA, IRF8), имеющих критическое значение для генерации DC [6, 16]. Соответственно, можно предположить, что моноциты CD14+CD16++ в наибольшей степени детерминированы к диф-ференцировке в DC с иммунностимуляторными свойствами. Однако этим данным противоречит работа L.B. Boyette с соавт., которые показали, что только популяция классических моноцитов
СБ14+СБ16- может быть предшественниками БС [7]. По-видимому, в данном случае важную роль играют способы выделения моноцитов, а также условия культивирования моноцитов, в частности применение ОМ-СББ и ]Ь-4 для индукции диф-ференцировки БС. Нами впервые показано, что деплеция СБ16+ из общего пула моноцитов не влияет на их способность дифференцироваться в БС при использовании вместо ]Ь-4. При
этом присутствие моноцитов СБ16+, как клеток-прекурсоров с большей степенью зрелости, позволяет получить ШБ-БС с фенотипом и ал-лостимуляторной активностью, характерной для более зрелых БС.
Известно, что при различных стресс-реакциях, сопряженных с повышением уровня катехола-минов и глюкокортикоидов в крови, происходят активация моноцитов и изменение их субпопуля-ционного состава [4], что, в свою очередь, может отражаться на процессах дифференцировки и созревания БС. В настоящем исследовании впервые охарактеризовано влияние дексаметазона на созревание и функции ]Б№-БС, генерированных из субпопуляций моноцитов СБ14+, оппозитных по экспрессии СБ16. Показано, что как СБ16+Мо-БС, так и СБ16-Мо-БС подвержены супрессорно-му эффекту дексаметазона, который проявляется задержкой созревания БС, сдвигом баланса соотношения СБ86+/ТЬК-2+ в сторону толерогенных клеток ТЬИ-2+, а также ингибицией стимулятор-ной активности ]Б№-БС в алло-СКЛ.
Интересно отметить, что доля клеток ТЬИ-2+, ассоциированных с толерогенным фенотипом БС, в ответ на добавление дексаметазона значимо возрастала только в популяции СБ16-Мо-БС, тогда как для СБ16+Мо-БС эти изменения проявлялись в виде тенденции. Характерно, что классические моноциты СБ14+СБ16- отличаются от моноцитов, экспрессирующих СБ16+, более выраженной экспрессией ТЬИ-2 в ответ на бактериальные антигены (ЛПС, пептидогликаны, эне-ротоксин В 51. аитвш) [17]. По-видимому, присутствие дексаметазона в культурах ]Б№-БС на этапе конечного созревания усиливает эффект ЛПС на экспрессию ТЬИ-2 на СБ16-Мо-БС, поскольку интактные ЛПС-стимулированные СБ16-Мо-БС и СБ16+Мо-БС не различались по этому показателю.
В отличие от ТЬИ-2 уровень экспрессии ко-ингибиторной молекулы В7-Н1 при добавлении дексаметазона значимо не менялся в популяциях СБ16-Мо-БС и СБ16+Мо-БС. Следует отметить, что роль В7-Н1 в биологии БС до конца не ясна. Показано, в частности, что молекула В7-
Н1, экспрессируемая на DC, участвует не только в индукции апоптоза и анергии Т-клеток [18], но обладает также протективной функцией, обеспечивая устойчивость DC к лизису со стороны цитотоксических Т-клеток [19]. В настоящем исследовании подавляющая часть интактных CD16-Мо-DC и CD16+Мо-DC коэкспрессировали В7-Н1 и CD86 (см. рис. 4), обладая при этом выраженной аллостимуляторной активностью. Добавление дексаметазона приводило к двукратному увеличению количества CD86-B7-H1+DC, одновременно снижая число клеток CD86+B7-H1+. Схожие результаты были получены J.-H. Le с соавт., которые в экспериментальных моделях показали, что различные толерогенные стимулы, в том числе и дексаметазон, приводят к увеличению количества CD86-B7-H1+ среди DC, индуцированных IL-4 [20].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В целом полученные данные свидетельствуют о том, что IFNa-индуцированные DC эффективно генерируются из циркулирующих моноцитов CD14+, как обогащенных, так и истощенных по клеткам CD16+. Тем не менее наличие в общем пуле моноцитарных предшественников CD16+ ассоциируется с дифференцировкой IFN-DC с более зрелым фенотипом и высокой аллостиму-ляторной активностью. DC, генерированные из субпопуляций моноцитов, оппозитных по экспрессии CD16, характеризуются чувствительностью к супрессорному эффекту дексаметазона. При этом толерогенное действие дексаметазона в субпопуляциях CD^M^-DC и CD16+M^-DC может реализовываться с вовлечением различных механизмов.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Ziegler-Heitbrock L., Ancuta P., Crowe S., Dalod M., Grau V., Hart D.N., Leenen P.J.M., Liu Y.-J., MacPher-son G., Randolph G.J., Scherberich J., Schmitz J., Short-man K., Sozzani S., Strobl H., Zembala M., Austyn J.M., Lutz M.B. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood.. 2010; 116: e74-80. DOI: 10.1182/ blood-2010-02-258558.
2. Feng A.-L., Zhu J.-K., Sun J.-T., Yang M.-X., Necke-nig M.R., Wang X.-W., Shao Q.-Q., Song B.-F., Yang Q.-F., Kong B.-H., Qu X. CD16+ monocytes in breast cancer patients: expanded by monocyte chemoattractant pro-tein-1 and may be useful for early diagnosis. Clin. Exp. Immunol. 2011; 164 (1): 57-65. DOI: 10.1111/j. 1365-2249.2011.04321.x.
3. Chara L., S6nchez-Atrio A., Pйrez A., Cuende E., Albarr6n F., Turriуn A., Chevarria J., del Barco A.A., S6nchez M.A.,
Monserrat J., Prieto A., de la Hera A., Sanz I., Diaz D., Alvarez-Mon M. The number of circulating monocytes as biomarkers of the clinical response to methotrexate in untreated patients with rheumatoid arthritis. J. Transl. Med. 2015; 13: 2. DOI: 10.1186/s12967-014-0375.y.
4. Wong K.L., Yeap W.H., Tai J.J.Y., Ong S.M., Dang T.M., Wong S.C. The three human monocyte subsets: implications for health and disease. Immunol. Res. 2012; 53 (1-3): 41-57. DOI: 10.1007/s12026-012-8297-3.
5. Bakdash G., Sittig S.P., Dijk T. van, Figdor C.G., Vries I.J.M. de. The nature of activatory and tolerogenic dendritic cell-derived signal II. Front. Immunol. 2013; 4: 53 DOI: 10.3389/FIMMU.2013.00053.
6. Ancuta P., Liu K.-Y., Misra V., Wacleche V., Gosselin A., Zhou X., Gabuzda D. Transcriptional profiling reveals developmental relationship and distinct biological functions of CD16+ and CD16- monocyte subsets. BMC Genomics. 2009; 10: 403. DOI: 10.1186/1471-2164-10-403.
7. Boyette L.B., Macedo C., Hadi K., Elinoff B.D., Walters J.T., Ramaswami B., Chalasani G., Taboas J.M., Lakkis F.G., Metes D.M. Phenotype, function, and differentiation potential of human monocyte subsets. PLoS One. 2017; 12 (4): e0176460. DOI: 10.1371/journal.pone.0176460.
8. Thurner B., Rцder C., Dieckmann D., Heuer M., Kruse M., Glaser A., Keikavoussi P., K^mpgen E., Bender A., Schuler G. Generation of large numbers of fully mature and stable dendritic cells from leukapheresis products for clinical application. J. Immunol. Methods. 1999; 223: 1-15. DOI: 10.1016/S0022-1759(98)00208-7.
9. Papewalis C., Jacobs B., Wuttke M., Ullrich E., Baehring T., Fenk R., Willenberg H.S., Schinner S., Cohnen M., Seissler J., Zacharowski K., Scherbaum W.A., Schott M. IFN- skews monocytes into CD56+-expressing dendritic cells with potent functional activities in vitro and in vivo. J. Immunol. 2008; 180 (3): 1462-1470. DOI: 10.4049/jim-munol.180.3.1462.
10. Тыринова Т.В., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Ми-шинов С.В., Ступак В.В., Останин А.А., Черных Е.Р. CCL19/CCL21 -зависимым хеммотаксис дендритных клеток в норме и при злокачественных опухолях головного мозга. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2014; 158 (12): 752-756. [Tyrinova T.V., Leplina O.Y., Tikhonova M. A., Mishinov S.V., Stupak V. V., Ostanin A.A., Chernykh E.R. CCL19/CCL21-dependent chemotaxis of dendritic cells in healthy individuals and patients with brain tumors. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2014; 158 (12): 752-756 (in Russ.)]. DOI: 10.1007/s10517-015-2862-4.
11. Leplina O. Yu., Tyrinova T.V., Tikhonova M.A., Ostanin A.A., Chernykh E.R. Interferon alpha induces generation of semi-mature dendritic cells with high pro-inflammatory and cytotoxic potential. Cytokine. 2015; 71: 1-7. DOI: 10.1016/j.cyto.2014.07.258.
12. Курочкина Ю.Д., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Тыринова Т.В., Баторов Е.В., Сизиков А.Э., Останин А.А., Черных Е.Р. Влияние дексаметазона на интерферон-а- индуцированную дифференцировку моноцитов в дендритные клетки. Медицинская иммунология. 2016; 18 (4): 347-356. [Kurochkina Y.D., Leplina O.Y., Tikhonova M.A., Tyrinova T.V., Batorov E.V., Sizikov A.E., Ostanin A.A., Chernykh E.R. Effect of dexamethasone on interferon-a-induced differentiation of monocytes to dendritic cells. Med. Immunol. 2016; 18 (4): 347-356. (in Russ.)]. DOI: 10.15789/1563-0625-20164-347-356.
13. Dopheide J.F., Zeller G.C., Kuhlmann M., Girndt M., Sester M., Sester U. Differentiation of monocyte derived dendritic cells in end stage renal disease is skewed towards accelerated maturation. Adv. Clin. Exp. Med. 2015; 24 (2): 257-266. DOI: 10.17219/acem/40463.
14. Wong K.L., Tai J.J.-Y., Wong W.-C., Han H., Sem X., Yeap W.-H., Kourilsky P., Wong S.-C. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 2011; 118 (5): e1631. DOI: 10.1182/ blood-2010-12-326355.
15. Merino A., Buendia P., Martin-Malo A., Aljama P., Ramirez R., Carracedo J. Senescent CD14+CD16+ Mono-cytes exhibit proinflammatory and proatherosclerotic activity. J. Immunol. 2011; 186 (3): 1809-1815. DOI: 10.4049/jimmunol.1001866.
16. Gren S.T., Rasmussen T.B., Janciauskiene S., ^kansson K., Gerwien J.G., Grip O. A single-cell gene-expression profile reveals inter-cellular heterogeneity within human monocyte subsets. PLoS One. 2015; 10 (12): e0144351. DOI: 10.1371/journal.pone.0144351.
17. Skinner N.A., MacIsaac C.M., Hamilton J.A., Visvana-than K. Regulation of Toll-like receptor (TLR)2 and TLR4 on CD14dimCD16+ monocytes in response to sepsis-related antigens. Clin. Exp. Immunol. 2005; 141 (2): 270-278. DOI: 10.1111/j.1365-2249.2005.02839.x.
18. Sakhno L.V., Tikhonova M.A., Tyrinova T.V., Leplina O.Y., Shevela E.Y., Nikonov S.D., Zhdanov O.A., Ost-anin A.A., Chernykh E.R. Cytotoxic activity of dendritic cells as a possible mechanism of negative regulation of T lymphocytes in pulmonary tuberculosis. Clin. Dev. Immunol. 2012; 2012: 1-9. DOI: 10.1155/2012/628635.
19. Chen L., Azuma T., Yu W., Zheng X., Luo L., Chen L. B7-H1 maintains the polyclonal T cell response by protecting dendritic cells from cytotoxic T lymphocyte destruction. Proc. Natl. Acad. Sci. 2018; 115 (12): 31263131. DOI: 10.1073/pnas.1722043115.
20. Lee J.-H., Park C.-S., Jang S., Kim J.-W., Kim S.-H., Song S., Kim K., Lee C.-K. Tolerogenic dendritic cells are efficiently generated using minocycline and dexametha-sone. Scientific Reports. 2017; 7: 15087. DOI: 10.1038/ s41598-017-15569-1.
Вклад авторов
Черных Е.Р., Останин А.А. - разработка концепции и дизайна. Тыринова Т.В., Курочкина Ю.Д, Олейник Е.А., Сахно Л.В. - культуральные работы. Тихонова М.А. -пробоподготовка для цитометрического анализа, цитоме-трический анализ проб. Курочкина Ю.Д., Тыринова Т.В., Леплина О.Ю., Черных Е.Р. - анализ и интерпретация данных. Тыринова Т.В., Черных Е.Р., Останин А.А. - подготовка текста статьи. Останин А.А., Черных Е.Р. - окончательное утверждение для публикации рукописи.
Authors contribution
Chernykh E.R., Ostanin A. A. - conception and design; Tyrinova T. V., Kurochkina Yu. D., Oleynik E. A., Sakhno L. V. -works with cultures. Tikhonova M.A. - preparation of samples for cytometry, cytometry of the samples. Kurochkina Yu. D., Tyrinova T.V., Leplina O.Yu., Chernykh E.R., - analysis and interpretation of data. Tyrinova T.V., Chernykh E.R., Ostanin A.A. - drafting of the manuscript. Ostanin A.A., Chernykh E.R. - final approval of the manuscript for publication.
Сведения об авторах
Черных Елена Рэмовна, д-р мед. наук, профессор, член-корр. РАН, зав. лабораторией клеточной иммунотерапии, НИИФКИ, г. Новосибирск. ORCID iD 0000-00032346-6279.
Тыринова Тамара Викторовна, канд. биол. наук, науч. сотрудник, лаборатория клеточной иммунотерапии, НИИФКИ, г. Новосибирск.
Леплина Ольга Юрьевна, д-р мед. наук, вед. науч. сотрудник, лаборатория клеточной иммунотерапии, НИИФКИ, г. Новосибирск. ORCID iD 0000-0003-31698643.
Тихонова Марина Александровна, канд. биол. наук, ст. науч. сотрудник, лаборатория клеточной иммунотерапии, НИИФКИ, г. Новосибирск. ORCID iD 0000-00022366-1667.
Курочкина Юлия Дмитриевна, аспирант, лаборатория клеточной иммунотерапии НИИФКИ, г. Новосибирск. ORCID iD 0000-0002-7080-777X.
Олейник Екатерина Александровна, аспирант, лаборатория клеточной иммунотерапии НИИФКИ, г. Новосибирск. ORCID iD 0000-0002-1044-3564.
Сахно Людмила Васильевна, канд. биол. наук, ст. науч. сотрудник, лаборатория клеточной иммунотерапии, НИИФКИ, г. Новосибирск. ORCID iD 0000-0003-32907910.
Останин Александр Анатольевич, д-р мед. наук, профессор, гл. науч. сотрудник, лаборатория клеточной иммунотерапии, НИИФКИ, г. Новосибирск. ORCID iD 0000-0001-6895-938X.
(*) Черных Елена Рэмовна, e-mail: ct_lab@mail.ru.
Поступила в редакцию 03.09.2018 Подписана в печать 17.12.2018
Authors information
Chernykh Elena R., DM, Professor, Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences, Head of the Laboratory of Cellular Immunotherapy, RIFCI, Novosibirsk, Russian Federation. ORCID iD 0000-0003-2346-6279.
Tyrinova Tamara V., PhD, Researcher, Laboratory of Cellular Immunotherapy, RIFCI, Novosibirsk, Russian Federation.
Leplina Olga Yu., DM, Leading Researcher, Laboratory of Cellular Immunotherapy, RIFCI, Novosibirsk, Russian Federation. ORCID iD 0000-0003-3169-8643.
Tikhonova Marina A., PhD, Superior Researcher, Laboratory of Cellular Immunotherapy, RIFCI, Novosibirsk, Russian Federation. ORCID iD 0000-0002-2366-1667.
Kurochkina Yuliya D., Postgraduate Student, Laboratory of Cellular Immunotherapy, RIFCI, Novosibirsk, Russian Federation. ORCID iD 0000-0002-7080-777X.
Oleynik Ekaterina A., Postgraduate Student, Laboratory of Cellular Immunotherapy, RIFCI,, Novosibirsk, Russian Federation. ORCID iD 0000-0002-1044-3564.
Sakhno Ludmila V., PhD, Senior Researcher, Laboratory of Cellular Immunotherapy, RIFCI, Novosibirsk, Russian Federation
Ostanin Alexander A., DM, Professor, Main Researcher, Laboratory of Cellular Immunotherapy, RIFCI, Russian Federation. ORCID iD 0000-0001-6895-938X.
(*) Chernykh Elena R., e-mail: ct_lab@mail.ru.
Received 03.09.2018 Accepted 17.12.2018
