CC BY
87
УДК 664.642.1
В. А. Сотников, В. В. Марченко, В. С. Г амаюрова ДЕКАЛЬЦИФИКАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД В ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ХЛЕБОПЕКАРНЫХ ДРОЖЖЕЙ
Предложен способ декалъцификации мелассных растворов с помощью хелатирующих агентов. Показано, что их использование повышает доступность и усвояемость органических и минеральных ингредиентов дрожжами Засек. cerevisiae.
Промышленное культивирование хлебопекарных дрожжей осуществляется на полу-синтетических средах на основе свекловичной мелассы, минеральных солей ( диаммоний фосфат, хлористый калий, сульфат аммония), биофакторов роста (биотин, кукурузный экстракт и т.п.) и микроэлементов (соли М§, Со, М, В и т.п.).
Отечественные виды меласс, полученные методом известковой дефекации, зачастую сильно обогащены кальцием, содержание которого в пересчете на СаО колеблется в широком диапазоне - от 0,4% до 9%. Большая часть (65-80%) этого кальция, в виде сульфатов и фосфатов кальция, находиться в нерастворенном состоянии, а остальная (в виде хлоридов, гидрокарбонатов, гидрофосфатов и солей органических кислот) - в растворенном или коллоидном состоянии [1]. Кальций, как известно, способен прочно связываться с некоторыми минеральными и органическими компонентами питательных сред, переводя их в труднорастворимое состояние, а, следовательно, в физиологически недоступную для дрожжей форму. Например, кальций, связываясь с хорошо растворимым диаммоний фосфатом, переводит его в практически нерастворимый ортофосфат кальция, который практически не усваивается дрожжами. Кроме того, его способность давать с органическими кислотами, витаминами и пептидами трудноусваиваемые дрожжами коллоидные взвеси, также способствует обеднению питательного фонда культивационных сред. Другим отрицательным свойством органо-неорганических соединений кальция является их способность адсорбироваться на поверхности клеточных стенок дрожжей, что способствует их агрегированию с последующей агглютинацией дрожжевых масс в процессе дрожжераще-ния. При этом адсорбция этих коллоидов на клеточной стенки дрожжей может препятствовать транспорту питательных веществ в клетку, что является одной из причин снижения скорости роста дрожжевой популяции.
Таким образом, кальциевые соединения является мощным агрегационным фактором, который способствует усилению микрогетерогенности питательных сред и дрожжевой популяции, а с повышением степени гетерогенности культивируемых масс, процессы массо- и газообмена в них замедляются.
Поэтому с целью нейтрализации или компенсации негативного влияния избытка кальция на процессы дрожжеращения в производстве используют целый ряд приемов. Во-первых, в тех случаях, когда культивирование дрожжей вынуждены осуществлять на высококальциевых мелассах, процессы смешивания и аэрирования дрожжевой суспензии осуществляют в более интенсивном режиме, что не всегда представляется возможным и не всегда приводит к положительному результату при существенном перерасходе электроэнергии на эксплуатацию газодувного оборудования.
Во вторых, в большинстве случаях мелассные растворы очищают серной кислотой. Подкисление питательных сред серной кислотой хотя и приводит к переводу растворенного и коллоидного кальция в нерастворенное состояние, но образующийся в этом процессе труднорастворимый сульфат кальция, осаждаясь, способен соосаждать некоторые питательные ингредиенты среды, что снижает ее питательность.
В третьих, очистку мелассы от кальциевого шлама проводят с помощью кларифика-
торов.
Применение этого приема повысило качество готовой продукции и интенсифицировало процесс дрожжеращения. Однако данный прием повлек за собой необходимость внесения в питательные среды увеличенных количеств биофакторов роста и минеральных питательных солей, которые, вероятно, попутно удаляются с кальциевой составляющей шлама.
Мы предположили, что проблему декальцификации мелассных сред с повышением ее питательности и доброкачественности можно решить используя некоторые малотоксичные кальцийхелагирующие агенты. В качестве таких агентов мы выбрали этилендиамин-тетраацетат (ЭДТА) и оксиэтилидендифосфоновую кислоту (ОЭДФК). В свете литературных данных эти малотоксичные комплексоны, имеющие большое сродство к ионам и нерастворимым соединениям кальция (CaS04, СаНРОд, Саз(Р04)г, СаНСОз и т.д.), широко используются в медицине, ветеринарии, агротехнике и пищевой промышленности [2]. Их используют при культивировании Klebsiella aerogenes [3], при производстве вин, лимонной кислоты [4]. Кроме того, в работе [1] отмечается интенсифицирующее воздействие ОЭДФК на синтез трикарбоновых кислот (цикл Кребса).
В последнее время появились сообщения об использовании ОЭДФК для стимуляции роста бактерий Bacillus subtilis и дрожжей Saccharomyces cerevisiae [5,6], где авторы работсвязывают стимулирующее воздействие комплексонов с их способностью увеличивать проницаемость клеточных структур клеток и усиливать транспорт питательных веществ внутрь клетки. Безусловно, что с этим утверждением нельзя не согласиться. Однако, авторами, к сожалению, не учитывается декальцифицирующие функции этих агентов и, связанное с этим свойством, положительное воздействие на доброкачественность используемых питательных сред. Косвенным подтверждением главенствующей декальцифицирующей функции ОЭДФК служат высокие абсолютные значения стимулирующего эффекта (29% относительно контроля) в случае культивирования Вас. subtilis на высококальциевых природного состава средах (картофельно-сусловая) и низкие - 8%- в случае культивирования Sacch. cerevisiae на низкокальциевых полусинтетических средах (глюкозоаммонийная или среда Чапека).
С целью интенсификации процесса выращивания хлебопекарных дрожжей и с целью выяснения влияния кальция на доброкачественность питательных сред в задачу наших исследований входило изучение влияния ЭДТА и ОЭДФК на рост дрожжей Sacch. cerevisiae штамм ЛК-14, выращиваемых на полусинтетических мелассных и на синтетических без мелассных средах с различным уровнем кальция.
На первом этапе наших исследований производился поиск оптимальных доз вышеуказанных комплексонов на полусинтетических мелассных средах, приготовленных из разных партий мелассы с различным, но естественным содержанием кальция. Первая партия мелассы характеризовалась сравнительно низким содержанием сахаров- 46% РВ и высоким содержанием кальция- 4%. Во второй партии мелассы содержание РВ было повышено (53%), при сравнительно низком содержании кальция - 0,9%.
Результаты эксперимента представлены на рис 1.
1 2,0 4
10 10 1П'8 10-6 10'4 10‘2 Г ком ..г/л
Рис. 1 - Зависимость съема дрожжей от концентрации ОЭДФК (?) и ЭДТА (2) на мелассных средах с содержанием кальция 0,9 % (а) и 4 % (б)
Наибольший дополнительный выход дрожжей (рис. 1) на питательной среде на основе мелассы с содержанием кальция 0,9% (на 13,6% относительно контроля - без использования комплексона) наблюдался в случае использования ОЭДФК. При использовании ЭДТА на этой же питательной среде концентрация биомассы возросла лишь на 9%. Несмотря на то, что сродство ОЭДФК к ионам кальция выше, чем у ЭДТА максимально стимулирующий эффект для ЭДТА наблюдался в концентрации 510-4 г/л, что на два порядка меньше, чем в случае использования ОЭДФК. Вероятно, это можно объяснить способностью ОЭДФК к комплексообразованию с другими веществами питательной среды, например, веществами органического происхождения (белками, полисахаридами, витаминами и т.д.). на что указывают некоторые авторы [7].
При переходе на полусинтетические питательные среды с большим содержанием кальция (4% СаО), общие закономерности от использования ЭДТА и ОЭДФК сохраняются: величины стимулирующих эффектов остаются на том же уровне, но оптимальная доза этих комплексонов возрастает приблизительно на 1 порядок, что хорошо коррелирует с адекватным возрастанием содержания кальция в среде.
С целью выяснения главенствующего фактора активизации роста дрожжей ком-плексонами ОЭДФК и ЭДТА, нами изучались сравнительные феноменологические характеристики дрожжевой популяции, выращенной на однотипной питательной мелассной среде, но с различным исходным количеством инокулята, а также на синтетических средах с различным уровнем ионов кальция. Предполагалось, что если комплексоны в большей степени оказывают активизирующее воздействие на механизмы транспорта веществ в клетку, то оптимально стимулирующая концентрация должна возрастать с увеличением
исходного уровня инокулята. В противном случае, основным ростстимулирующим фактором комплексонов, является их способность повышения доброкачественности и микроге-терогенных питательности сред, посредством их декальцификации и, следовательно, гомогенизации.
С этой целью в мелассные среды вводили различное количество инокулята в виде сухой биомассы (влажность -10%) в количестве 2 и 20 г абсолютно сухих дрожжей на 1 л среды, что исключало разбавление засевной среды жидким инокулятом.
Результаты эксперимента представлены на рисунке 2.
26 X, гАСБ/л
109 1(Г8 10'7 10‘6 10'5 10-4 10‘3 10'2 10'1 с, ком, г/л
Рис. 2 - Влияние количества инокулята на оптимальную концентрацию ОЭДФК.
Доза инокулята, гАСБ/л: 1 - 20; 2 - 2,0
Как видно из данных рисунка изменение дозы инокулята не влечет за собой изменение оптимальной стимулирующей концентрации ОЭДФК. Следовательно, можно предположить, что комплексоны «работают» не на уровне клетки, а на уровне питательной среды и их стимулирующее действие на рост дрожжей носит опосредованный характер.
Для подтверждения этой гипотезы и с целью выявления количественной взаимосвязи между уровнем кальцификации сред и их доброкачественностью, в дальнейшем все эксперименты с комплексонами проводились на модельных глюкозо-минеральных средах в присутствии хлористого кальция в различных дозировках. В состав исходной синтетической среды входила глюкоза, диаммоний фосфат, сульфат аммония, хлористый калий, сульфат магния и биотин. Дополнительно в среды вводили хлористый кальций в диапазоне концентраций от 0 до 2 г/л. Раствор глюкозы и минеральных солей стерилизовали отдельно и после охлаждения смешивали, биотин вводили в охлажденные стерильные среды (микрогетерогенная среда А). Для постановки экспериментов на гомогенных синтетических средах, предварительно прокипяченную водную суспензию минеральный солей с хлористым кальцием отфильтровывали от нерастворимых фосфатов и сульфатов кальция и
магния, а затем фильтрат стерилизовали и далее смешивали его со стерильным раствором глюкозы и с раствором биотина (микрогомогенная среда Б). В качестве инокулята использовали дрожжи, выращенные на полноценной сусловой среде, которые отмывались в 0,07% физиологическом растворе ОЭДФК.
В ходе экспериментов было обнаружено, что при приготовлении синтетических сред, а именно в процессе их кипячения (20 мин.) или стерилизации (0,5 ати, 20 мин.), происходят изменения в их минеральном составе, что сопровождалось образованием труднорастворимых солей. Даже в отсутствии хлористого кальция в стерилизованных средах А и Б обнаруживались осадки ортофосфата магния. При введении в эта среды хлористого кальция процесс осадкообразования усиливался за счет образования нерастворимого сульфата и фосфата кальция. Следовательно, кальциевые среды, по сравнению с безкальциевыми, еще более обедняются по минеральному составу (по источникам фосфора и магния).
Мы предположили, что введение в питательные среды на стадии их приготовления ОЭДФК будет предотвращать процесс образования труднорастворимых солей фосфорной кислоты, а образующиеся при этом соответствующие комплексонаты будут физиологически доступны для питания дрожжей, что должно препятствовать снижению доброкачественности кальциевых синтетических сред.
Как и ожидалось внесение в среды ОЭДФК в больших концентрациях (от 10'2 до 1,0 г/л) либо полностью предотвращало образование нерастворимых солей, либо в низких концентрациях (от 10'6 до 10'3 г/л), образующиеся осадки имели рыхлую и аморфную структуру, а надосадочная жидкость опалесцировала. О степени дисперсности получаемых осадков судили по динамике их осаждения, регистрируя изменение величины мутности во времени (рисунок 3).
О 1 5 30 45 60 75 90 1 05 1 20 1 35
Рис. 3 - Динамика седиментации осадка синтетической питательной среды в присутствии ОЭДФК. Доза ОЭДФК: 1-0; 2- 10 8; 3 - 10 7; 4 - 10 6; 5 - 10 5; 6 - 10^; 7- 1 О*3; 8 - 10'2; 9 - 10 1
По мере увеличения концентрации ОЭДФК (рис. 3), количество образующегося осадка уменьшается, а их дисперсность увеличивается. Так, если в отсутствии комплексо-на начальная величина экстинкции составляла 20 ед.10'1, то в присутствии максимальной его концентрации (10й г/л) эта величина составила 14,4 ед.10‘1. При этом интегральная скорость осаждения (за 135 секундный период осаждения ) в контрольном варианте составила 6,8-10-4 ед. ОП/с, а в опытном - 5,7-10-4 ед.ОП/с.
Возникает закономерный вопрос о том обладает ли ОЭДФК и ЭДТА физиологически активными свойствами по отношению к дрожжевой популяции ЭэссЬ. сегеу|Б1ае если она выращивается на полностью гомогенной среде (среда Б) и в отсутствии ионов кальция.
Как показали эксперименты ОЭДФК в концентрации 10'5 г/л оказывает сравнительно незначительное ростстимулирующее воздействие на дрожжевую популяцию (количество дрожжевых клеток увеличилось всего лишь на 5,2% относительно контроля), а, начиная с концентрации 10'3 г/л уже наблюдался стойкий эффект ингибирования.
Следует дополнительно указать на наши исследования по определению способности дрожжей к утилизации ОЭДФК в качестве единственного источника углерода и фосфора. Было показано, что рост дрожжей Басс!"!. сегеу1з1ае на питательной среде состоящей из натриевой соли ОЭДФК, диаммоний фосфата, сульфата магния и биотина, отсутствовал.
Те же самые закономерности были выявлены и для другого комплексона - ЭДТА. Таким образом, эти исследования еще раз подтверждают гипотезу опосредованного положительного воздействия комплексонов на популяцию дрожжей, а именно прирост биомассы обусловлен способностью ОЭДФК или ЭДТА повышать доброкачественность кальцифицированных сред. Наблюдаемое нами незначительное стимулирующее воздействие этих комплексонов, вероятно, можно объяснить способностью хелатирующих агентов увеличивать проницаемость клеточных структур дрожжей, интенсифицируя тем самым транспорт питательных веществ в клетку, либо способностью этих агентов дезагрегировать дрожжевые ассоциаты клеточной популяции, что также должно увеличивать обеспеченность клетки питательными веществами снижать. Последнее предположение наиболее вероятно, так как ОЭДФК снижала агрегативноегь дрожжевых клеток и популяция была представлена преимущественно единичными клетками (в отсутствии комплексонов дрожжевые клетки были собраны в агломераты, состоящие из 5-10 и более клеток). Полученные нами данные хорошо согласуются с результатами, представленными в работе [5,6].
Оказывает ли ингибирующее воздействие кальций (в виде СаС1г НгО ) на рост БассЬ. сеге7|Б1ае можно судить из данных представленных на рисунке 4. В этих экспериментах исследовались два концентрационных уровня хлористого кальция - 0,5 г/л (сте-хиометрически адекватная концентрация СаС1г для полного связывания (МНд)2НР04 и (NN4)2^04 в питательной среде) и 2,0 г/л (избыточная концентрация СаС1г для создания в питательной среде свободных ионов Са).
Как следует из данных рисунка, хлорид кальция в концентрации 0,5 г/л и в отсутствии ОЭДФК закономерно снижал съем дрожжей. Однако при создании избыточного содержания кальция в среде, дальнейшего снижения съема дрожжей мы не наблюдали, что указывает на индиффирентность БассИ. сегеу|51ае к ионам Са, а снижение съема дрожжей можно объяснить только сниженной питательностью или доброкачественностью сред, в которые вводился хлорид кальция. Восстановление этого питательного фонда до уровня безкальциевой питательной среды, как и ожидалось, происходит в присутствии ОЭДФК. При этом оптимальный расход ОЭДФК (при максимальном стимулирующем эффекте) увеличивается по мере увеличения кальциевой нагрузки. Однако, дальнейшее увеличение
нагрузки (до 2,0 r/л) не повлекло за собой пропорционального увеличения оптимальной стимулирующей концентрации ОЭДФК.
Эти данные еще раз убедительно доказывают, что ОЭДФК (вероятно, и ЭДТА) являются действенными декальцифицирующими агентами и могут использоваться с целью повышения питательности и доброкачественности при приготовлении органоминеральных (мелассных) питательных сред в технологии производства хлебопекарных дрожжей. Исходя из выявленного механизма действия, исследованные комплексоны могут быть отнесены к классу стимуляторов роста дрожжей опосредованного характера, т.е. к стимуляторам, активизирующие действие которых на рост популяции обусловлено их способностью повышать доступность и усвояемость органических и минеральных ингредиентов питательных сред.
Литература
1.СемихатоваН.М. Хлебопекарные дрожжи. М.: Пищевая пр-ть, 1980. 199 с.
2.Дятлова Н.М., Темкииа В.Я., Попов Н.И. Комплексоны и комплексонаты металлов. М.: Химия, 1988.491 с.
3.НасоноваВ.А., СигидинЯ.А. Патогенная устойчивость микроорганизмов. М.: Медицина, 1985. 270 с.
4.МехузлаН.А.. Панасюк А.Л. Плодовоягодные вина. М.: Легкая и пищевая пр-ть. 1984. 236 с.
5.Астраханцева М.Н., Крыницкая А.Ю., Гамаюрова B.C. // Тез. Докл. XVII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии, 21-26.09. 2003. С. 198.
6.Глазырина Ю.В., Елизарова Е.В., Крыницкая А.Ю., Гамаюрова В С. Пути повышения активности биологического препарата для защиты растений. // Тез. Докл. XVII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии, 21-26.09. 2003.С.221;
7.Семенов Д.И., Трегубенко И.П. Комплексоны в биологии и медицине. М.: Химия, 1984. С.З
© В. А. Сотников - канд. техн. наук, доц. каф. промышленной биотехнологии КГТУ; В. В. Марченко - соискатель той же кафедры; В. С. Гамаюрова - д-р хим. наук, проф., зав. каф. промышленной биотехнологии КГТУ.
