CC BY
830
УДК 635.152:632.38
Вестник защиты растений, ,3, 2001
ДЕФОРМИРУЮЩАЯ МОЗАИКА РЕДИСА
Л.И.Моисеенко*, А.В.Крылов**
*Горнотаежная станция ДВО РАН, Владивосток **Амурский ботанический сад ДВО РАН, Благовещенск
При проведении модельных экспериментов получены дополнительные данные, подтверждающие, что заболевание, известное как деформирующая мозаика редиса, на Дальнем Востоке России вызывается смешанной инфекцией вирусами мозаики турнепса и мозаики редиса. На растениях, зараженных двумя патогенами, наблюдалась типичная картина заболевания. Электронной микроскопией выявлено наличие частиц двух типов с модальными размерами 760-780х11 нм, что соответствует морфологии вируса мозаики турнепса (потивирус) и полиэдрических 28-30 нм, что типично для вируса мозаики редиса (комовирус). Анализ суммарной РНК, выделенной из препарата, показал наличие трех типов молекул с массами 3.5 МD (РНК вируса мозаики турнепса) и две зоны 2.1 и 1.3 MD (РНК вируса мозаики редиса).
В 1975 году при обследовании овощных культур в южных районах Приморского края на лобе (Raphanus sativus. subsp. sinensis (Mill.) Sazon convar. loba Sazon) сорта "Октябрьская" (сем. Brassica-ceae) были обнаружены растения с признаками морщинистой мозаики. Электронно-микроскопическим анализом, реакцией кольцепреципитации и по кругу растений-хозяев А.В.Крыловым с соавторами (1981) было показано, что растения, обнаруженные в Приморье, заражены вирусами мозаики редиса (группа комови-русов, японо-американский штамм) и мозаики турнепса (группа потивирусов). Вирус мозаики турнепса из смешанной инфекции был выделен переносом персиковой тлей (Myzus persicae Sulz). Как отмечено А.В.Крыловым (1992), вирус
мозаики турнепса отличается более высокой точкой температурной инактивации, меньшее время сохраняет инфекцион-ность при комнатной температуре и имеет более узкий круг растений-хозяев.
На основании результатов, полученных В.Ф.Толкач (1995), дальневосточный штамм вируса мозаики турнепса отнесен к группе обычных.
В Японии подобное заболевание известно под названием деформирующей мозаики редиса - radish enation mosaic. Х.Точихара (1968) предположил, что заболевание является смешанной инфекцией вирусами мозаики турнепса и мозаики редиса. С целью детализации предыдущих результатов нами были проведены дополнительные исследования комплексного заболевания.
Материал и методы
Заражение растений и накопление ма- 12-17 день после заражения. Накопление териала проводили в вегетационном до- вирусов в растениях контролировали с мике и теплице с нерегулируемым режи- помощью электронного микроскопа. мом. Накопление материала осуществля- Для выделения патогенов использовали в растениях лобы сорта "Октябрьская", ли модификацию методики В.К.Новикова последовательно заражая их вирусами с соавторами (1984) для получения препа-мозаики турнепса и мозаики редиса. ратов вирусов картофеля. Свежесрезан-Механическую передачу производили ные листья лобы гомогенизировали в ка-традиционными методами (Шоймоши, лий - фосфатном буфере с умеренной 1974). Инокулюм готовили из листьев ионной силой (0.1М), содержащем 0.2% 2-больных растений, растирая их в 0.01М меркаптоэтанола, рН 7.6. Экстракт освет-фосфатном буфере, содержащем 0.5% 2- ляли центрифугированием (7000 g, 15 меркаптоэтанола (pH 7.6). Инокулирова- мин), а затем эмульгировали с хлорофор-ли от 10 до 20 растений в фазе семядо- мом (1/8 от объема) и бутанолом (8%). лей или 4-5 листьев. Листья собирали на Смесь интенсивно перемешивали в тече-
Вестник защиты растений, ,3, 2001 ние 15 мин при 4°С. Эмульсию разделяли центрифугированием. Вирусы, находящиеся в водной фазе, осаждали 6% поли-этиленгликолем (М.м. 6000) в присутствии 0.1М хлористого натрия. Сформировавшийся осадок собирали центрифугированием, ресуспендировали его в 0.05 борат-ном буфере (рН 7.6). От нерастворивших-ся частиц освобождались центрифугированием при 10000 g в течение 10 мин. Дальнейшую очистку проводили с помощью дифференциаль-ного центрифугирования (40000 g 90 мин и 10000 g 10 мин) или ультрацентрифугирования через слой 30% раствора сахарозы в течение 2 часов при 78000 g в бакет-роторе.
Образцы для электронного микроскопа готовили, используя модифицированный метод разбавленных суспензий (Развяз-кина и др.,1968). Для негативного контрастирования использовали растворы солей тяжелых металлов - 2% раствор фосфор-новольфрамовой кислоты (рН 6.5-7.0) или 2% водный раствор уранилацетата (рН 4.2). Поддерживающей пленкой служил 0.5-2% или 0.1-0.2% раствор коллодия в амилацетате или поливинилформальдеги-де соответственно. Препараты исследовали в электронных микроскопах ЭВМ-100 и Hitachi 7B. Электронно-оптическое увеличение составляло 20000-40000. Модальные размеры частиц определялись в Институте биохимии им. А.И.Баха РАН.
Для выделения РНК возбудителей заболевания из полученного препарата использовали модифицированный метод фенольной депротеинизации в присутствии додецилсульфата натрия. Все стадии очистки РНК производили при 4°С, pH буферов поддерживалась не менее 9.0. К вирусной суспензии (концентрация вируса не превышала 5 мг/мл) в 0.1М трис-
буфере рН 9.0 добавляли додецилсульфат натрия до 2% и 2 - меркаптоэтанол до 0.5% и прогревали 5 мин при 50 °С. После этого к раствору, содержащему патогены, добавляли равный объем смеси водона-сыщенный фенол:хлороформ:изоамило-вый спирт (25:24:1) и встряхивали в течение 20 мин до образования гомогенной эмульсии. Фазы разделяли центрифугированием при 8000 g в течение 10 мин. и отбирали водную (верхнюю) зону. Экстракцию повторяли 2-3 раза, пока в интерфазе не переставал обнаруживаться денатурированный белок. Нуклеиновую кислоту из водной фазы осаждали, добавляя 2.5 объема охлажденного абсолютного этанола, 1/20 объема 3М ацетата натрия рН 6.0 и оставляя пробирку на 2 часа при -70°С.
Количество различных типов нуклеиновых кислот в препарате, выделенном из листьев лобы, пораженных деформирующей мозаикой редиса, определяли методом электрофореза (Rickwood, Ha-mes,1992). Препарат анализировали в 3% полиакриламидном геле, содержащем 7М мочевину, 0.05М трис-боратный буфер и 0.008М ЭДТА (pH 8.3).
Электрофорез проводили при постоянном напряжении 200 В в течение 2 часов. В ячейку геля наносили 2-4 мкг РНК в 0.01М трис-боратном буфере, содержащем 8М мочевину, 0.002% бромфено-лового синего и 0.002% ксиленцианола. В качестве маркеров использовали РНК вируса табачной мозаики, обычный и некротический штаммы Y-вируса картофеля.
После окончания электро-фореза гель окрашивали 0.2% раствором метиленово-го синего в 0.4М ацетатном буфере, pH 5.0.
Результаты и обсуждение
После последовательного заражения формацией листовой пластины (рис.1). На
растений лобы дальневосточными изоля- нижней поверхности листовой пластины
тами вирусов мозаики турнепса и мозаи- иногда появлялись пластинчатые вырос-
ки редиса симптомы заболевания появ- ты-энации. Таким образом, наблюдалась
лялись на 12-17 день в виде мозаики и картина заболевания, типичного для де-
посветления жилок. Позднее развивались формирующей мозаики редиса.
локальные поражения в виде хлоротич- При просмотре полученного препара-
ных колец и рисунка с последующей де- та в электронном микроскопе было вы-
явлено наличие частиц двух типов: извитых нитевидных и полиэдрических. Модальные размеры нитевидных частиц составляли (760-780)х11 нм, что соответствует морфологии вируса мозаики турнепса (потивирус). Диаметр полиэдрических частиц был равен 28-30 нм, что типично для вируса мозаики редиса (комо-вирус).
Вестник защиты растений, 3, 2001 геле. Электрофорезом выявлено наличие трех типов молекул (рис.3). Зона с молекулярной массой 3.5 МD (рис.3а) соответствует молекулярной массе РНК потиви-русов и идентифицируется нами как РНК вируса мозаики турнепса. Две молекулы с массами 2.1 и 1.3 MD (рис.3б,в) - компоненты РНК вируса мозаики редиса - типичного представителя группы
кмб
Рис. 2
Рис. 3
Рис. 1. Листья лобы
а - с симптомами заболевания, вызванного комплексной инфекцией вирусами мозаики турнепса и мозаики редиса, б - здорового растения
На рисунке 2 представлена электронно-микроскопическая фотография препарата, выделенного из растений со смешанной инфекцией. Частицы вируса мозаики турнепса характеризуются небольшой степенью агрегации (рис.2а). Ви-рионы вируса мозаики редиса на фотографии отмечены буквой б (рис.2б). Количество частиц каждого возбудителя в поле зрения микроскопа приблизительно одинаково. Примеси в препарате отсутствуют.
Из полученного препарата возбудителей болезни вирусов мозаики турнепса и редиса была выделена суммарная РНК. Выделение проводили методом феноль-ной депротеинизации в присутствии до-децилсульфата натрия при щелочных значениях pH. Полученный препарат анализировали в 3% полиакриламидном
Рис. 2. Электронно-микроскопическая фотография возбудителей деформирующ ей мозаики редиса: а - нитевидные вирионы вируса мозаики турнепса, б - полиэдрические частицы вируса мозаики редиса
Рис. 3. Электрофореграммы РНК вирусов мозаики турнепса (а) и редиса (б, в), г - РНК вируса табачной мозаики (М.м. 2.0 МБ)
комовирусов. Вирусы этой группы обладают двухкомпонентным геномом, содержание нуклеиновой кислоты в частицах составляет около 34% (Гиббс, Харри-сон,1978). Наши результаты также совпадают с данными, полученными для РНК вируса мозаики редиса. Для патогена характерно наличие двух типов раздельно инкапсулированных молекул РНК с молекулярными массами 2.1 и 1.3 МБ (Сапоцкий,1990).
Итак, наши исследования показали, что симптомы болезни, включая вырос-ты-энации на нижней поверхности листовых пластин, были подобны описанным для деформирующей мозаики редиса. Электронной микроскопией препарата обнаружено присутствие частиц двух типов (рис.1). Анализ РНК, выделенной
г
в
Вестник защиты растений, ,3, 2001 из полученного препарата, выявил наличие трех типов молекул, соответствующих РНК вируса мозаики турнепса и двум инкапсулированным молекулам РНК вируса мозаики редиса (рис.2).
Таким образом, нами в модельных экс-
периментах получены дополнительные данные, подтверждающие, что заболевание, известное как деформирующая мозаика редиса, является смешанной инфекцией вирусами мозаики турнепса и редиса.
Гиббс А., Харрисон Б. Основы вирусологии растений. М., Мир, 1978, 430 с.
Крылов А.В., Малевич В.М., Сапоцкий М.В., Гнутова Р.В., Рублева Н.В. Вирус мозаики редиса - новый для СССР комовирус. /Биологические науки, 3, 1981, с.24-30.
Крылов А.В. Вирусы растений Дальнего Востока. М., Наука, 1992, 110 с.
Новиков В.К., Николаева О.В., Варицев Ю.А., Гатаулина И.А., Рампян А.Х. Выделение очищенных препаратов вирусов картофеля для приготовления диагностических антивирусных сывороток. /Теория и практика использования иммунитета сельскохозяйственных культур к вирусным болезням. Тез. докл. УШ всесоюзн. совещ. Вильнюс, 1984, с.250-251.
Развязкина Г.М., Полякова Г.П., Штейн-Марголина В.А. Упрощенный метод обнаружения в электронном микроскопе частиц из
сока больных растений. /Вопросы вирусологии, 5, 1968, с.633-634.
Сапоцкий М.В. Дальневосточный изолят вируса мозаики редиса. Идентификация и структура генома. Автореф. канд. дисс., М., 1990, 24 с.
Толкач В.Ф. Идентификация и биологическая характеристика поти- и тобамовирусов (дальневосточные изоляты). Автореф. канд. дисс., Владивосток, 1995, 24 с.
Шоймоши Ф. Вирусология. Кирай З., Клемент З., Шоймоши Ф., Вереш И. Методы фитопатологии, М., Колос, 1974, с 6-80.
Rickwood D., Hames B.D. Gel electrophoresis of nucleic acid: A practical approach. IRL Press Ltd., Oxford and Washington, D.C., 1982, 145 р.
Tochihara H. Radish enation mosaic virus. /Ann. Phytopahol. Soc. Japan, 34, 1968, p.129.
DISTORTING MOSAIC OF RADISH
L.I.Moiseenko, A.V.Krylov Model studies have been carried out with the plants of the family Brassicaceae to corroborate the complex nature of distorting radish mosaic, a disease found in the South of Primorskyi Krai (Russian Far East). Symptoms on leaves are similar to those shown for radish mosaic. Using electronic microscopy has allowed finding the presence of both comoviruses (radish mosaic virus) and potyviruses (turnip mosaic virus) in a sample preparation. An analysis of RNA extracted from the preparation obtained has shown the presence of three molecular types, one of which corresponds to RNA of turnip mosaic virus, and two others - to two encapsulated RNA molecules of radish mosaic virus. Some supplementary data have been obtained confirming that a disease known as distorting radish mosaic in the Russian Far East is caused by mixed infection by both radish and turnip mosaic viruses.
