CC BY
44БАКТЕР1АЛЬНИЙ РАК ВИНОГРАДУ I БЮЛОПЧН1 ЗАХОДИ ЩОДО ЗАХИСТУ В1Д НЬОГО
Власов В.В.
доктор сшьськогосподарських наук, директор Нацюнальний науковий центр «1нститут виноградарства i виноробства iu. В.€. Тмрова, Одеса, Украгна
Конуп Л.О.
кандидат бiологiчних наук, завiдуюча лабораторieю вiрусологii i мжробюлоги
Нацшнальний науковий центр «1нститут виноградарства i виноробства iu. В.€. Тагрова, Одеса, Украгна
CROWN GALL OF GRAPE AND
BIOLOGICAL AGENTS AGAINST OF THEM
Vlasov V.V., doctor of agricultural sciences, director National Scientific Centre "Institute of Viticulture and Wine Making named after V.Ye. Tairov", Odessa, Ukraine
Konup L.A., Ph.D., Head of the Laboratory of Virology and Microbiology National Scientific Centre "Institute of Viticulture and Wine Making named after V.Ye. Tairov", Odessa, Ukraine
АНОТАЦ1Я
За допомогою методу полмеразног ланцюговог реакци отриман дат про стутнь iнфiкованостi грунту ризосфери, мiжрядь винограднишв, а також коретв кущiв винограду опухолеобразующего штамами агробактерш. Встановлено, що патогены агробактери збериалися в грунтi до^джуваног дшянки протягом двох ротв. За допомогою полiмеразноi ланцюговог реакци з використанням пар праймерiв до по^довностей vir D2 i ipt Ti-плазмiди проведено тестування 171 штаму агробактерш, видыених з лози винограду i грунту виноградника. Отримано дан про кыьккть vir D2 - i ipt - пози-тивних штамiв. Вивчено гх антагошстичн властивостi щодо збудника бактерiального раку винограду. Видыен шта-ми Rhizobium vitis проявили бактерющногенную активтсть по вiдношенню до близькоспорiднених штамiв.
ABSTRACT
The data about contamination of soil from rhizosphere, soil between the rows and the grapevine roots with the tumorigenic agrobacteria strains were obtained by the help of polymerase chain reaction method. It was established that pathogenic agrobacteria survived in soil of the investigated plot during the period of two years. 171 agrobacteria strains isolated from grapevine cuttings and vineyard soil were tested by the polymerase chain reaction with primers based on the vir D2 and ipt genes. The data about quantity of vir D2 - and ipt - positive strains were obtained. Examine their antagonistic properties against the crown gall of grape. Isolated Rhizobium vitis strains showed bacteriocinogenic activity against closely related strains.
Ключовi слова: Agrobacterium vitis, грунт, полiмеразна ланцюгова реакщя, бактерiальний рак винограду.
Keywords: Agrobacterium vitis, soil, polymerase chain reaction (PCR), crown gall of grape.
ЯНгоБшт (А§гоЬас1егшт) tumefaciens (У^), А§гоЬас1егшт tumefaciens бювар 3, або згщно ново! номенклатура А§гоЬаС:егшт ^^ [1], е збудником бактерiаль-ного раку винограду - захворювання, яке призводить до значних втрат як на молодих насадженнях, так i на виноградниках, що плодоносять. Бактерiальний рак - системне захворювання; збудник розповсюджуеться по судиннш системi рослини, видшяеться зi здерев'янших пагошв та коршня [2]. 1нфжована рослина може не проявляти сим-птомiв захворювання i при вегетативному розмноженш бути джерелом розповсюдження А. на значнш тери-торп [3].
Джерелом шфекцп у г'рунт е коршня, яке залишаеть-ся тсля видалення шфжованих кущiв, а також самi хворi рослини [4, 5]. З шфжованого 1"рунту патоген може про-никати у здорову рослину [6]. Факторами, що сприяють розвитку бактерiального раку на винограднику, постають волопсть, холодн зими [3, 4, 7]. Бактерiальний рак - це ранева шфекщя, i збудник попадае до рослинних тканин ^зь пошкодження [8].
Как правило, боротьба з бактерiальным раком мае певн труднощi i наявшсть патогенно! бактерп у грунта ви-
ноградника дуже небезпечно, тому що вона легко розпо-всюджуеться на iншi рослини. Аналiз втрати врожаю вщ збудника бактерiального раку показав, что А. tumefaciens займае трете мюце серед бактерiальних патогешв рослин. Третий бювар A.tumefaciens, який вражае в основному виноград i видшяеться iз грунту винограднику, але з ризосфери винограду можна видшити й iншi види агробактерш. На тепершнш час бактерiальний рак, що розповсюджений у всьому свт е одним з найбшьш шкодочинних хвороб винограду. При цьому збитки вщ ще! хвороби досягають 75-80 % [7].
Вщкритим залишаеться питання про те, який строк е необхщним для оздоровлення 1"рунту вщ А. и^. За дани-ми дослщниюв, на рiзних дшянках збудник може видшя-тися з 1"рунту навиь через 16 роюв тсля видалення хворих рослин, а може не виявлятися вже через рж, що свщчить про природну елiмiнацiю патогена [9, 10].
Важливою проблемою перед закладанням винограднику е вибiр дшянки, вшьно! вщ А. [6, 11]. Тестування г'рунту на присутшсть патогенних агробактерш дозволяе не тшьки виявити заражен та вшьш вщ збудника дшянки, але також сприяе вивченню екологп збудника, розробщ
профшактичних заходiв, направлених на боротьбу з бак-терiальним раком.
На тепершнш час немае ефективних засобiв щодо за-хисту винограду ввд ще! хвороби, за винятком обмеження поширення хвороби з садивним матерiалом.
Актуальнiсть дано! роботи визначалась в виявленш бiологiчних заходiв боротьби iз збудником бактерiального раку винограду.
Мета дослвджень полягала в видiленнi, вдентифжацп непатогенних агробактерш, що мали антагонiстичнi вла-стивостi по вiдношенню до патогенних штамiв збудника бактерiального раку винограду та розробити технологш !х застосування при виробництвi щеп, на шкшках та маточ-них насадженнях.
МАТЕР1АЛ I МЕТОДИ ДОСЛЩЖЕНЬ
Матерiалом для проведення дослвджень були:- чубуки виноградно! лози сорпв Каберне Совiньйон, Пiно чорний, Мерло зовшшньо здоровi, без симптомiв бактерiального раку винограду; пiдщепи i прищепи при виробництвi щеп садивного матерiалу винограду; шкiлки i маточнi насад-ження прищепних сортiв винограду; грунт у ризосферi ви-ноградних кущв та мiжряддях винограднику.
При проведенш дослiджень були використанi мжро-бюлопчш методи видiлення агробактерiй на натвселек-тивне поживне середовище Рой i Сассера з послiдуючим пересiвом видшених бактерiй на картопляний агар. До-слiджуванi бактерп дiагностували i вдентифжували за до-помогою методу ПЛР^агностики.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛ1ДЖЕНЬ
Обстеження виноградникiв Одесько!, Микола!всько!
i Херсонсько! областей показало, ураження кувдв бак-терiальним раком значне. Бактерiальним раком уражу-ються як молодi насадження, так i багаторiчнi плодоноснi виноградники. Збитки ввд ще! хвороби великi. Сорти винограду чутливi до бактерiального раку у рiзнiй мiрi. Серед пвдщепних сортiв бiльш чутливими до зараження A. vitis е V. berlandieri x V. riparia Кобера 5ББ, V. berlandieri x V. riparia CO4 (табл.1). Пухлини виявляються на цих сортах частiше, шж на сортах V. riparia х V. rupestris 101 - 14 i V. riparia х V. rupestris 3309. Згвдно дослвдженням, пвдщепш сорти V. riparia i V. rupestris загалом бшьш резистентнi до ураження бактерiальним раком, нiж сорти V. vinifera. Високочутливими прищепними сортами винограду е Каберне Совшьон, Мерло, Рислшг рейнський. Ступiнь ураження певного сорту залежить ввд ктматично! зони куль-тивування винограду.
В результата фиосаштарного обстеження виноград-никiв Одесько!, Микола!всько! i Херсонсько! областей на загальнш площi 150 га на ураження бактерiальним раком встановлено, що у рiзних господарствах Одесько! обласп ураження бактерiальним раком становить ввд 5 до 25 %; у господарствi Микола!всько! областi - ввд 2 до 10 %; у господарствах Херсонсько! обласп - ввд 5 до 20 %.
Вiзуальний ф^осаштарний контроль не дозволяе роз-тзнати кущi з латентною iнфекцiею i запобiгти заготов-ленню з них лози для вегетативного розмноження рослин.
В результата ПЛР дiагностики виноградно! лози i грунту було видшено значну кшьюсть непатогенних агробактерш (рис. 1, рис. 2), яю були використанi для подальшого дослвдження !хнiх антагонiстичних властивостей.
Рис. 1. Електрофорез продукпв амплiфiкацii ДНК штамiв агробактерiй з праймерами ipt в агарозному гелi 1, 7, 11 -ipt - позитивнi штами Agrobacterium sp., видiленi i3 виноградноi лози; 2 - 6, 8, 9, 12 - зразки винограду, що не метили ipt - позитивних штамiв агробактерш; 10 - патогенний штам Agrobacterium tumefacens Fa2; 13 - маркер молекулярноi
ваги (200 - 800 пар основ, "Ампл^енс", Роая).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 427 п.о.
Рис. 2. Електрофорез продукта амплiфiкацii ДНК штамiв агробактерш з праймерами ipt в агарозному гелi 3, 6 - ipt -позитивш штами Agrobacterium sp., видiленi iз грунту винограднику; 1, 2, 4, 7 - 12 - зразки винограду, що не мктили ipt - позитивних штамiв агробактерш; 5 - патогенний штам Agrobacterium tumefacens Fa2; 13 - маркер молекулярноi
ваги (200 - 800 пар основ, "Амплкенс", Роая).
Штами Agrobacterium sp. були видшеш iз грунту винограднику, iдентифiкованi по морфологи згвдно визначника Бергi
(табл. 1).
Таблиця 1
Порiвняльнi бiохiмiчнi i фiзiологiчнi характеристики iзолятiв Agrobacterium sp. i референтного штаму
Agrobacterium rhizogenes К 84
Бiохiмiчнi i фiзiологiчнi властивостi iзолятiв Agrobacterium sp. Agrobacterium rhizogenes К 84
Розмiр клiтин, мкм 0,6 х 1,5-3 0,8 х 1.5-3 мкм
Забарвлення за Грамом - -
Оптимальна температура росту, °С 25-27 25-27
Рухомкть + +
Аероби + +
Спори - -
Утворення 3-кетолактози + +
Гiдролiз крахмалу - -
Розжиження желатину - -
Утворення кислоти на джерелах вуглецю:
глюкоза + +
фруктоза + +
арабшоза + +
галактоза + +
манiт + +
Утворення амiаку + +
Примака: «+» - позитивна реакщя; «-» - негативна реакщя.
Колони на штучному м'ясо-пептонному i картопляному агарах пiсля двох дiб шкубаци при 25-27 °С мали розмiри 2-4 мм у дiаметрi, слизькi, незабарвленi. Поверхня колонiй гладка. Характер росту м'ясо-пептоному бульйонi - по-мутнiння й утворення осаду шсля 2-х дiб шкубаци при 25
- 27 °С. Оптимум рН середовища - нейтральний 6,0 - 7,3. Для встановлення антагошстичних властивостей iзолятiв Agrobacterium Бр. спочатку культуру нарощували у 2 мл середовища Б наступного складу в г на 1 л^р дистильовано! води: К2НР04 - 0,1; КН2Р04 - 0,4; №С1 - 0,1; MgSO4•7H2O
- 0,2; СаС12 - 0,02; БеС^ - 0,01; №Мо04^2Н20 - 0,002; малат
натрию - 5; дрiжджовий екстракт - 5; гiдролiзат казешу -5; рН 6,8. 1нкубували при 25-27 °С протягом 2-х дiб. Бак-терiальну культуру розводили у 100 разiв у серед овищi D (0,2 мл завиа + 9,8 мл середовища) i iнкубували при стру-шуваннi при 25-27 °С протягом 24 годин. Отриману завись, яка мала концентращю 109 бактерiальних кл^ин на 1 мл, використовували для нанесення на штучно уражеш дiлянки рослин. Антагонiстичнi властивостi iзолятiв непа-тогенних бактерiй дослiджували на виноградних кущах у полi та в лабораторних умовах на виноградних рослинах in vitro та тест-рослинах каланхое. Для зараження iзолятами
використовували п'яти- ceM^i4Hi кущi винограду copTiB Каберне Сoвiньйoн i Мерло рожеве, найбшьш чутливi до ураження збудником бактеpiальнoгo раку винораду, Mi-сячного строку рослини in vitro та piчнi тест-рослини ка-ланхое. В дocлiдi використовували по 10 рослин. Для цього на зелених пагонах винограду i каланхое на piвнi 3-5 мiж-вузля робили скальпелем надpiз, на рослинах in vitro - гол-кою i вносили бактеpiальнoю петлею завись бактеpiальних клiтин в кoнцентpацii 109 КУО/мл видшених агробак-теpiй. Через час тсля нанесення непатогенних бактерш
в той самий надрiз вносили таку ж кшьюсть вiрулентно-го референтного штаму А§гоЬас1ег1иш tumefacens Ба2. В водночас таким самим чином на шших рослинах вносили непатогенний штам А§гоЬас1ег1иш rhizogenes ИЬБ-2, що мае антагонiстичнi властивостi по вщношенню до збудни-ка бактерiального раку i А. tuшefacens Ба2. Мюце надрiзу закривали плiвкою Parafilш щоб бактерiальна плiвка не висихала. Облж результатiв проводили через 25-30 дiб по наявностi або вiдсутностi пухлин на рослинах (табл. 2).
Таблиця 2
Результати дослщження антагонiстичних властивостей iзолятiв агробактерiй по вiдношенню до збудника бактерiаль-
ного раку винограду A. tumefacens Fa2.
№ п/п Тест-культура Кшьюсть зараже-них рослин, шт. Пухлиноутворю-вання на пагонах рослин при ура-женш шокулятом Пухлиноутворювання на пагонах рослин при ураженш A. rhizogenes HLB-2
1. Виноград сорт Каберне Со-вшьйон 10 3 0
2. Виноград сорт Мерло рожеве 10 2 0
3. Контроль, без зараження антагошстами 10 9 10
4. Виноград in vitro сорт Каберне Совшьйон 10 1 0
5. Виноград in vitro сорт Мерло рожеве 10 0 0
6. Контроль, без зараження антагошстами 10 10 10
7. Тест-рослина каланхое 10 0 0
8. Контроль, без зараження антагошстами 10 10 10
На тепершнш час е цiлий ряд штамiв А. vitis, А. tuшefaciens и А. radiobacter, якi успiшно використовують-ся для попередження вторинного ураження здорових ро-слин винограду з 1"рунту. Цей метод представляеться нам дуже важливим i повинен бути включено до технологи посадки саджанщв винограду на постшне мюце.
ВИСНОВКИ
1. Проведена лабораторна дiагностика латентного ураження збудником бактерiального раку виноградникiв i грунту у ризосферi i мiжряддi.
2. Для виявлення непатогенних агробактерш було протестовано 157 чубукiв виноградно! лози, 58 зразкiв ри-зосфери i 34 зразка мiжряддя грунту виноградниюв.
3. Встановлено, що iз вае! кiлькостi протестованих зразкiв видшено 208 непатогенних штамiв агробактерiй i 2 з них мали антагошстичш властивостi, що було перевiре-но в лабораторних i польових умовах.
4. На основi отриманих даних розроблена техноло-гiя застосування мiкробiв-антагонiстiв проти збудника бактерiального раку.
СПИСОК Л1ТЕРАТУРИ
1. Ophel K., Kerr A. Agrobacterium vitis, new species for strains of Agrobacterium biovar 3 from grapevines// Int. J. Syst. Bacteriol. - 1990. - 40. - P. 236 - 241.
2. Lehoczky J. Root system of the grapevine as a reseivoir of Agrobacterium tumefaciens cells// Proc. 4 th Int. Conf. Plant Pathol. Bacteriol. (Angers, France, 1978). - Angers, 1978. - P. 239 - 243.
3. Burr T.J., Katz B.H. Grapevine cuttings as potential sites of survival and means of dissemination of Agrobacterium tumefaciens // Plant Dis. - 1984. - 68. - P. 976 - 978.
4. Burr T.J., Katz B.H. Isolation of Agrobacterium tumefaciens biovar 3 from grapevine galls and sap, and from vineyard soil// Phytopathology. - 1983. - 73. - P. 163 - 165.
5. Lehoczky J. Root system of the grapevine as a reseivoir of Agrobacterium tumefaciens cells// Proc. 4 th Int. Conf. Plant Pathol. Bacteriol. (Angers, France, 1978). - Angers, 1978. - P. 239 - 243.
6. Burr T.J., Katz B.H., Bishop A.L. Population of Agrobacterium in vineyard and nonvineyard soils and grape roots in vineyards and nurseries// Plant Dis. - 1987. - 71. - P. 617 - 620.
7. Burr T.J., Bazzi C., Sule S., Otten L. Crown gall of grape: biology of Agrobacterium vitis and the development of disease control strategies// Plant Dis. - 1998. - 82. - P. 1288 -1297.
8. Байдербек Р. Опухоли растений. - М.: Колос, 1981. - С. 114.
9. Bouzar H., Oudah D., Krimi Z., Jones J.B., Trovato M., Petit A., Dessaux Y. Correlative association between resident plasmids and the host chromosome in a diverse Agrobacterium soil population// Appl. Environm. Microbiol. - 1993. - 59. - P.
1310 - 1317.
10. Krimi Z., Petit A., Mougel P., Dessaux Y., Nesme X. Seasonal fluctuations and long-term persistance of pathogenic populations of Agrobacterium spp. in soils// Appl. Environm. Microbiol. - 2002. - 68, № 7. - P. 3358 - 3365.
11. Haas J.H., Moore L.W., Ream W., Manulis S. Universal PCR primers for detection of phytopathogenic Agrobacterium strains// Appl. Environm. Microbiol. - 1995. -61, №8. - P. 2879 - 2884.
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЛЕГОЧНОЙ ТКАНИ С ТУБЕРКУЛЕМОИ В ФАЗЕ ПРОГРЕССИРОВАНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ВОСПАЛЕНИЯ
Лискина И.В.
доктор медицинских наук, старший научный сотрудник заведующая лабораторией патоморфологии
Мельник О.А. младший научный сотрудник лаборатории патоморфологии ГУ «Национальный институт фтизиатрии и пульмонологии им. Ф.Г. Яновского НАМН Украины», г. Киев
MORPHOLOGICAL FEATURES OF LUNG TISSUE WITH TUBERCULOMA AT THE PROGRESSION OF SPECIFIC INFLAMMATION
Liskina I.V.
Doctor of Medical Science, senior researcher,
the Head of the laboratory of pathomorphology
Melnyk O.A.
junior researcher of the laboratory of pathomorphology
SO «National institute of phthisiology and pulmonology named after F.G. Yanovsky National academy of medical sciences of Ukraine», Kiev
АННОТАЦИЯ
Подробно представлены цитологические и гистологические особенности легочной ткани с наличием туберкулемы в условиях прогрессирования специфического туберкулезного воспаления, изученные на резекционном материале человека. Контролем служили случаи туберкулемы легких с низкой активностью туберкулезного воспаления. Представлены иллюстрации некоторых гистологических признаков. Предложен ряд цитологических и гистологических признаков, которые достоверно характеризуют прогрессирование туберкулезного воспаления при туберкулемах легких.
ABSTRACT
Cytological and histological peculiarities of lung tissue with tuberculoma are presented in detail in the progression phase of tuberculosis inflammation. Surgical resections of human lung were used as a material. Cases of pulmonary tuberculomas with a low activity of tuberculosis inflammation served as a control. Some histological signs are illustrated. A number of important cytological and histological signs are proposed for an objective estimation of the progression phase of tuberculosis inflammation at pulmonary tuberculomas.
Ключевые слова: туберкулема легких, цитологические и гистологические признаки, прогрессирование туберкулезного процесса.
Keywords: pulmonary tuberculoma, cytologic and histological signs, progression of tuberculosis process.
Актуальность работы. В настоящее время среди всех морфозом [6, 7, 9, 16]. Еще в 60-80-е годы прошлого века клинико-морфологических форм туберкулеза легких ту- проводился ряд исследований с целью выяснения актив-беркулемы остаются актуальной и недостаточно изучен- ности специфического воспалительного процесса при ту-ной проблемой фтизиатрии. Это, в частности, связано беркулемах легких. В работах определяли выраженность со значительным удельным весом случаев туберкулем в специфических клеточных реакций легочной ткани в со-структуре современного легочного туберкулеза, длитель- поставлении с биохимическим исследованием белкового ностью эпидемии туберкулеза в странах постсоветского спектра казеозных масс из туберкулем и туберкулезных пространства (России, Украине) и его негативным пато- очагов; сопоставляли результаты рентгенологического
