COMPLEX ANALYSIS OF NEW INTERSPECIFIC F1 HYBRIDS OBTAINED FROM CROSSING COTTON MONOSOMIC LINES OF THE G.HIRSUTUM L. WITH THE PIMA 3-79 LINE OF THE SPECIES G.BARBADENSE L. Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

_ Геномика, протеомика, _

— биоинформатика ^^

Genomics, proteomics and bioinformatics

UDK: 633.511.576.312.3

COMPLEX ANALYSIS OF NEW INTERSPECIFIC Fi HYBRIDS OBTAINED FROM CROSSING COTTON MONOSOMIC LINES OF THE G.HIRSUTUM L. WITH THE PIMA 3-79 LINE OF

THE SPECIES G.BARBADENSE L.

M.F. Sanamyan **, Sh.U. BobokhujayevSh.S. Abdukarimov2.

1National University of Uzbekistan named after Mirzo Ulugbek, Tashkent, Uzbekistan

2 Center for Genomics and Bioinformatics of the Academy of Sciences of the Republic of Tashkent, Uzbekistan.

*Corresponding author email: sanam_marina@rambler.ru

E-mail addresses of co-authors: bobohujayev@maiI.ru, sharofiddinabdukarimov@gmail.com

Annotation. Analysis of Fi hybrids obtained from crossings of five monosomic cotton lines of the species G. hirsutum L. with the donor line - Pima 3-79 of the species G.barbadense L., using SSR markers previously assigned to the chromosomes, revealed monosomic seedlings in seven hybrid families of four variants of crossings (with the participation of lines Mo69, Mo71, Mo76, Mo81), and also confirmed the earlier identification. This analysis contributed to the rapid identification of monosomic cytotypes at the seedling stage and the earlier involvement of hybrids in backcrossing. However, among the hybrid seedlings of one crossing variant (Mo79xPima 3-79), monosomic cytotypes were not found. Analysis of chromosome pairing in Fi hybrid monosomies lacking chromosome 4 of the cotton At-subgenome showed chromosome pairing normal for monosomies with the formation of 25 bivalents and one medium-sized univalent in all studied PMCs. The study of buds at the sporad stage revealed a high meiotic index and the formation of a small number of tetrads with micronuclei, while the study of pollen fertility revealed its variation between high and low, indicating a latent structural interspecific variability not recorded at the metaphase I stage of meiosis, leading to the formation partially unbalanced gametes.

Key world: cotton, G.hirsutum L., G.barbadense L., hybrids, SSR markers, monosomy,

chromosome pairing, sporades, pollen fertility. КОМПЛЕКСНЫЙ АНАЛИЗ НОВЫХ МЕЖВИДОВЫХ ГИБРИДОВ Fi, ПОЛУЧЕННЫХ ОТ СКРЕЩИВАНИЙ МОНОСОМНЫХ ЛИНИЙ ХЛОПЧАТНИКА ВИДА G.HIRSUTUM L.

С ЛИНИЕЙ PIMA 3-79 ВИДА G.BARBADENSE L.

М.Ф. Санамьян1, Ш.У. Бобохужаев1, Ш.С. Абдукаримов2 1.Национальный университет Узбекистана им. М. Улугбека, г. Ташкент, Узбекистан 2. Центр геномики и биоинформатики Академии наук Республики Узбекистан, г. Ташкент, Узбекистан

Соответствующий автор email: sanam_marina@rambler.ru Адреса электронной почты соавторов: bobohuiayev@maiI.ru. s h а г о f i del i n a b d u k a r i m о v @ g m a i I. с о m

Аннотация. Анализ гибридов Fi, полученных от скрещиваний пяти моносомных линий хлопчатника вида G. hirsutum L. с линией донором - Pima 3-79 вида G.

ЪагЪайепБе Ь., с помощью ранее приписанных к хромосомам ББИ-маркеров, обнаружил моносомные проростки в семи гибридных семьях четырех вариантов скрещиваний (с участием линий Мо69, Мо71, Мо76, Мо81], а также подтвердил ранее проведенную идентификацию унивалентов. Такой анализ способствовал быстрому выявлению моногамных цитотипов на стадии проростков и более раннему вовлечению гибридов в беккроссирование. Однако среди гибридных проростков одного варианта скрещивания (Мо79хР1та 3-79) моносомные цитотипы обнаружены не были. Анализ коньюгации хромосом у гибридных моносомиков с нехваткой хромосомы 4 А^убгенома хлопчатника показал нормальную для моносомиков конъюгацию хромосом с формированием 25 бивалентов и одного унивалента среднего размера во всех изученных МКП. Изучение бутонов на стадии спорад выявило высокий мейотический индекс и формирование небольшого числа тетрад с микроядрами, тогда как исследование фертильности пыльцы обнаружило ее варьирование между высокой и сниженной, что указало на скрытую структурную межвидовую изменчивость, не регистрируемую на стадии метафаза-1 мейоза, приводящую к формированию частично несбалансированных гамет.

Ключевые слова: хлопчатник, С.МгзиЬит Ц в.ЬагЬаёепзе Ь., межвидовая

гибридизация, ББЯ-маркеры, моносомия, конъюгация хромосом, спорады, фертильность пыльцы

Введение

Использование линий с замещением отдельных хромосом позволяет осуществлять

направленную интрогрессию

специфических хромосом или сегментов хромосом от одних видов к другим [23]. Интрогрессивные линии были получены у многих видов растений, поскольку дикие виды являются резервуаром полезных генов, сохранившихся в ходе эволюции под давлением дифференцированного отбора по сравнению с одомашненными видами [19].

Нынешняя база зародышевой плазмы хлопчатника претерпела сужение из-за монофилетического происхождения, образования

«генетически узкого горлышка», возникшего во время одомашнивания от общего предка, а также вследствие скрещиваний между однотипными

генотипами элиты [26, 18]. Все это стимулировало большой интерес к другим видам хлопчатника в качестве источников генетических вариаций [27].

Поскольку вид С. ЬагЬаёепБе Ь. (2п = 52, геномная формула (2(АБ)2), имеет исключительно хорошее качество волокна, но характеризуется сниженной урожайностью,

селекционеры давно пытались объединить лучшие признаки двух культивируемых видов хлопчатника [С.ЫгБиШт Ь. и С.6агЬас/ел5е Ь.) в одном геноме, однако имели ограниченный успех. Несмотря на то, что эти два вида легко скрещиваются и дают фертильные гибриды первого поколения, в дальнейшем

наблюдается бесплодие,

цитологические нарушения,

отклонения при расщеплении.

ограниченная рекомбинация и плохие агрономические качества[2, 10], Поэтому создание у хлопчатника линий с замещением отдельных хромосом может способствовать переносу чужеродных полезных аллелей генов от одних видов в другие. У таких линий все генетическое содержание отдельной хромосомы или хромосомного плеча вида G.hirsutum L. заменяется соответствующей чужеродной

хромосомой или сегментом хромосомы вида G.barbadense L. Подобные хромосом-замещенные линии

представляют собой новые полезные инструменты для переноса, раскрытия и использования чужеродных полезных аллелей, детерминирующих важнейшие признаки качества волокна от вида G.barbadense L. [15, 8].

Вовлечение трех тетраплоидных видов хлопчатника: G.barbadense L. [24], G.tomentosum Nutt. Ex Seem [12] и G.mustelinum Miers ex Watt [16] позволило создать в США замещенные линии хлопчатника по отдельным хромосомам генома, а также выявить генетические эффекты замещений отдельных хромосом [11]; обнаружить новые эффекты аллелей,

контролирующих важные QTL [13], изучить признаки волокна [14]; определить влияние отдельных хромосом на урожайность и качество волокна [9], а также определить влияние на процентное содержание белка и масла в семенах хлопчатника

[19].

Однако, проведение

исследований с участием этих линий с использованием молекулярно-

генетических методов выявило отсутствие замещения хромосом у

некоторых из них [5, 17, 25], а «пять линий (CS-B05sh, CS-B06, CS-B07, CS-B12sh и CS-B15sh) содержали небольшую интрогрессию или вообще не содержали соответствующей интрогрессии целой хромосомы или участка хромосомы» [4], что затрудняло их дальнейшее

использование.

Поскольку в Национальном университете Узбекистана начато создание новых хромосом-замещенных линий хлопчатника, на основе ранее полученных моногамных линий [20], нами была разработана схема получения линий с замещением отдельных хромосом. Она включает получение гибридов между моногамными линиями хлопчатника вида G. hirsutum L. с линией донором Pima 3-79 вида G.barbadense L., а также пятикратное беккроссирование с использованием молекулярно-

генетического скрининга беккроссных гибридов на стадии проростков на всех этапах беккроссирования. Целью данной статьи явился анализ новых гибридов первого поколения с целью получения в дальнейшем на их основе линий с чужеродным замещением отдельных хромосом G. hirsutum L./ G. barbadense L.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Материалом для исследований служили новые межвидовые гибриды Fi, полученные от скрещиваний моногамных линий хлопчатника вида G.hirsutum L. с линией Pima 3-79 вида G.barbadense L., где моносомные линии Цитогенетической коллекции

Национального университета

Узбекистана, были созданы в единой генотипической среде высоко инбредной линии Л-458 [20],

полученной в результате

многолетнего инбридинга и отбора среди сортовой популяции 108-Ф. Линия Pima 3-79 вида G.barbadense L. была получена на основе удвоенного гаплоида, поэтому является абсолютно гомозиготной, и характеризующейся высоким качеством волокна. Эта линия является генетическим стандартом для этого вида хлопчатника в США [3].

Идентификация моногамных линий ранее была проведена с помощью набора транслокационных линий, любезно предоставленных проф. Техасского университета Д. Стелли и подтверждена с помощью молекулярных SSR маркеров в Центре геномики и биоинформатики АН РУз [21,22].

Гибридные семена

проращивались в бумажных рулонах в термостате при температуре 30°С в регуляторе роста композиция №1 0,1% в течение двух суток. Затем проросшие семена высевались в набитые земляной смесью пластмассовые стаканчики в пленочной теплице НУУз и поливались водопроводной водой по мере высыхания почвы. Через две недели после посева проводили учет всхожести гибридных семян, а после достижения стадии 4-5 настоящих листьев выполняли этикетирование гибридных проростков и сбор молодых листочков для молекулярно-генетического анализа на стадии проростков. Затем растения из стаканчиков пересаживались в закрытый грунт теплицы, где в дальнейшем проводились различные агротехнические мероприятия. В период начала бутонизации перед фиксацией 2-3 мм бутонов в спирт-

уксусной смеси (7:3) проводилось этикетирование подопытных растений большими этикетками и учет выживаемости гибридных растений.

В процессе цитологических анализов исследовался мейоз на стадии метафаза I (MI) в материнских клетках пыльцы (МКП) и спорад по методике, описанной ранее [1]. Для этого материнские клетки пыльцы (МКП) окрашивали железо-

ацетокармином. На временных давленых препаратах под световым микроскопом анализировали

метафазы первого деления мейоза и учитывали характер конъюгации хромосом, число уни- и бивалентов. При анализе стадии спорад анализировали по три бутона от каждого растения и подсчитывали мейотический индекс (МИ).

Для определения фертильности пыльцы, цветки собирались в день цветения и готовились временные препараты после окраски

ацетокармином. Для лучшего прокрашивания пыльцевых зерен препараты на сутки оставлялись в холодильнике, затем анализировались по 10 полей зрения с 2-3-х цветков от каждого растения.

Все цитологические

наблюдения проводили с помощью микроскопов "Laboval", 'AxioScope Al" (Carl Zeiss, Германия) и "Biomed" (Leica, Швейцария) при увеличении объективов 10х, 100х, бинокулярной насадки 1,6х и GF 12,5 х 120 и окуляра 10х.

Микрофотографирование выполнялось с использованием цифровой фотокамеры

MikroskopkameraAxioCamERc5s. При экспонировании использовался

зеленый светофильтр 3C-11-3. Фотографирование растений и их частей проводилось с помощью цифровой фотокамеры СапопА-610. Полученные данные обрабатывались статистически, согласно формулам, принятым для такого рода исследований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Унивалентные хромосомы

моносомных гибридов Fi, полученных от скрещиваний пяти моносомных линий хлопчатника G.hirsutum L. (Мо69, Мо71, Мо76, Мо79 и Мо81) с линией Pima 3-79, ранее уже были идентифицированы с помощью молекулярно-генетических маркеров, у которых была проведена хромосомная приписка.

Для облегчения обнаружения моносомных цитотипов, а также молекулярно-генетической идентификации специфических

хромосом, в пяти гибридных семьях Fi проводили молекулярно-генетический анализ гибридных растений на стадии проростков (4-5 настоящих листьев) до пересадки проростков в грунт теплицы.

В результате проведенного исследования на стадии проростков, выяснилось, что в варианте скрещивания (FiMo69x Pima 3-79) с нехваткой хромосомы 4 в двух гибридных семьях (2 п и 73 п) было обнаружено два гибридных проростка (73б и 73в) из десяти в одной семье, которые характеризовались

присутствием полиморфных аллелей только от вида G.barbadense, тогда как аллели линии Л-458 вида G.hirsutum отсутствовали, что указало на

локализацию двух хромосом-специфичных ББР-маркеров ТМВ0809, 01117 и выявило их моносомный цитотип. Поскольку ранее перечисленные маркеры были локализованы на хромосоме 4 Аг-субгенома хлопчатника [5, 6], можно считать, что вышеназванные гибридные проростки

характеризуются нехватками по этой хромосоме (Табл. 1; Рис. 1а,б).

Анализ двух других гибридных семей (46п и 74п) в варианте р1 (Мо71хР1та 3-79) с нехваткой хромосомы 4, также осуществленный на стадии проростков с использованием молекулярно-

генетических маркеров, показал присутствие полиморфных аллелей только от вида ЬагЬаёепзе у пяти моносомных гибридов (46г, 467, 469, 46и и 4612) из 14 в одной семье, а также у семи моносомных гибридов (744, 74з, 74?, 748, 74д, 7412 и 741з) из 16 в другой семье, тогда как аллели линии Л-458 вида С. Ь^иШт отсутствовали, что указало на локализацию двух хромосом-специфичных ББР-маркеров - ВМЬ2572, СЫ17 у моносомиков семьи 46п и трех других маркеров - ТМВ0809, СЫ17, СМ07 у моносомиков семьи 74п и выявило их моносомный цитотип. Поскольку все вышеперечисленные маркеры были ранее локализованы на хромосоме 4 А^субгенома

хлопчатника [5, 6, 7], можно считать, что вышеназванные гибридные проростки характеризуются

нехватками по этой хромосоме (Табл. 1; Рис. 1).

Таблица 1.

Анализ микросателлитных маркеров (5511) у проростков хлопчатника в _первом гибридном поколении_

Хромосома Вариант скрещивания Гибридная семья Номер гибридного растения Присутствие маркеров вида С. ЬагЬайете

4 р1Мо69хРш1аЗ-79 Семья 1 21 -

22 -

2з -

24 -

25 -

2б -

Семья 2 731 -

732 -

73з -

734 -

735 -

736 ТМВ0809, ОЫ17

73у -

738 ТМВ0809, СЫ17

73д -

73м -

р1Мо71хРтаЗ-79 Семья 1 461 -

462 ВМ1,2572,С]1117

46з -

464 -

465 -

46б -

467 В1ЧЬ2572, СЫ17

468

46д BNL2572.GM.17

46ы -

46ц В^2572,СМ17

4612 ВШ.2572,СМ17

4613 -

4614 -

Семья 2 741 -

74г -

74з -

744 ТМВ0809, СЫ17, СМ07

745 ТМВ0809, СЫ17, СМ07

74е

747 ТМВ0809, 01117, СИЮ7

748 ТМВ0809, 01117, 01107

74д ТМВ0809, СЫ17, вМ07

74ю -

74ц -

7412 ТМВ0809, СЫ17, 01107

7413 ТМВ0809, СМ17,01107

74м -

7415 -

7416 -

^ ^ ' ' г S

«л О Г- X

«Л О rv oo

- -J /"—N r ^ /"—\ /"—N ^ /—V ~> — <S C*\ rf 1Л

— V N t») TJ- _ 1 ( N ГГ) _». w I j. J _ ,_

G\ 04

r-- r~-

ON о 0\

Г-. (S. Г-.

® ? ? ® 0* Oi r— i— i— i—

ON 0\ ON Gs r^ r» r--

О; n

rn II

00 ' 3

я ri

t g ^

> -Я -

4 (S Uh

s®«J55seseisi!

ее к cc cc

се я cc cc

.3 .3 .3 .3 .3 .3 .3 .3

РцОчЛ&нОчСЦЛйч

xxxxxxxx C\O^O\0^C^C\O^C\

oooooooo

Я M

Я Я

• Я .я

а, а,

X X

0\ ON

VO so

О о

2 2

К S ® 15 и

з а я -J я я

■ я 3 -s -я

ец ¡V Рн а,

X X X X

■ Я -Я

л а,

.я -я .я .я .3 .3

рц РЦ Рн Оч £V (V

X X X X 7 7

• Я ■ я -я .я

а, Сч Рч рн

о

X X X X

(— Р—

о О .9 .<?

Г- Г- Г- Г-

О .0 .О О о о

sslsSssSsiSliilC

т t

it im 11

Рис. 1. Электрофореграмма ДНК-ампликонов SSR-(Мо69х Pima 3-79, Мо71х Pima 3-79, Мо76х Pima 3-на стадии проростков: BNL2572. (Стрелками

Изучение трех гибридных семей (4П, 5П и 75п) в варианте Fi (Mo76xPima 3-79) с нехваткой хромосомы 4 также проводили на стадии проростков с использованием молекулярно-

генетических маркеров. В результате, в одной семье было обнаружено два моносомных проростка (44 и 47) из восьми изученных, в другой семье (5П) - ни одного моносомного проростка, а в третьей семье - один моносомный проросток (75i), которые показали присутствие полиморфных аллелей только от вида G. barbadense, тогда как аллели вида G.hirsutum линии Л-458 отсутствовали, основываясь на локализации двух хромосом-специфичных SSR маркеров - BNL2572, Ghll7, у моносомиков семьи 4п и трех других маркеров - Ghl07, ТМВ0809, Ghll7 у моносомика семьи 75п, что также выявило их моносомный цитотип. Поскольку все

вышеперечисленные маркеры ранее были локализованы на хромосоме 4 At-субгенома хлопчатника [5, 6], можно считать, что вышеназванные гибридные проростки

■маркеров у моносомных мехвидовых гибридов Fi 79, Мо81х Pima 3-79] по хромосоме 4 At-субгенома указаны отсутствующие у гибридов локусы).

характеризуются нехватками по этой хромосоме (Табл. 2; Рис.2).

Однако изучение двух гибридных семей (Зп и 76п) в варианте Fi (Mo79xPima 3-79) с нехваткой хромосомы 4, также проведенное на стадии проростков с использованием молекулярно-генетических маркеров не выявило гибриды с нехватками хромосом, по-видимому из-за отсутствия воспроизводства

моносомного состояния (Табл. 2; Рис. 2).

Изучение двух гибридных семей (47п и 77п) в варианте Fi (Mo81xPima 3-79) с нехваткой хромосомы 4 обнаружило в одной гибридной семье пять моносомных проростков (47i, 47г, 474, 47s и 47б) из семи изученных, а в другой семье - 11 моносомных проростков (77i, 77г, 77з, Hi, lis, 77g, 77ю, 77ц, 77i3, llie и 77is) из 18 изученных, которые показали присутствие полиморфных аллелей только от вида G. barbadense, тогда как аллели вида G.hirsutum линии Л-458 отсутствовали. Это указало на локализацию двух хромосом-специфичных SSR-маркеров - BNL2572,

Ghll7 у моносомиков семьи 47п и трех других маркеров - Ghl07, ТМВ0809, Ghll7 у моносомиков семьи 77п и подтвердило нехватку хромосомы 4

At-субгенома хлопчатника [5, 6], а также выявило их моносомный цитотип (Табл. 2; Рис. 3).

Таблица 2.

Анализ микросателлитных маркеров (5511) у проростков хлопчатника в первом

гибридном поколении

Хромосома Вариант скрещивания Гибридная семья Номер гибридного растения Присутствие SSR маркеров вида G. barbadense

4 Fi Mo76xPima 3-79 Семья 1 4i -

42 -

4з -

44 BNL2572, Ghll7

45 -

4б -

47 BNL2572, Ghll7

4s -

Семья 2 5i -

52 -

5з -

54 -

Семья 3 75i Ghl07, TMB0809, Ghll7

752 -

75з -

754 -

75s -

FiMo79xPima 3-79 Семья 1 3i -

32 -

Зз -

34 -

35 -

Семья 2 76i -

762 -

76з -

764 -

76s -

76б -

767 -

76s -

76g -

76ю -

76ц -

76i2 -

76i3 -

76i4 -

Mo81xPima 3-79 Семья 1 47i BNL2572, Ghll7

472 BNL2572, Ghll7

47з -

474 BNL2572, Ghll7

475 BNL2572, Ghll7

476 BNL2572, Ghll7

47у

Hi Ghl07, TMB0809, Ghll7

772 Ghl07, TMB0809, Ghll7

77з Ghl07, TMB0809, Ghll7

Iii -

lis -

lib -

111 Ghl07, TMB0809, Ghll7

778 Ghl07, TMB0809, Ghll7

Семья 2 77g Ghl07, TMB0809, Ghll7

11 w Ghl07, TMB0809, Ghll7

77ц Ghl07, TMB0809, Ghll7

11 VI

77a Ghl07, TMB0809, Ghll7

77i4 -

77is -

77i6 Ghl07, TMB0809, Ghll7

111! -

77i8 Ghl07, TMB0809, Ghll7

On *0 Г- I—

ir, ir, IT, SO Г- Г- r- r—

t^ Г"- Г t Г t^- t с— г

ON re г-

On ON

ON

r-

.a ^

PH is

I </". AH

00 ^ 7 * 3 Я 4 ^

T 3 w О - - _

rn m re re

.3 .3

Oh Ph

X X чо NO

r-o

on on

rn гл re re

.3 .3

Он Он

X X SO on

r- r-o о

s s

on on

On On

On ON

f> m m m m ro re re re re re re

■a .3

P Ph

X X

as on

r-о

s 2

.3 .3

P Он

X X ON On

r- r-o о

SS

.3 .3

P Он

X X On On

Г-О

SS

On On as Г-—

fi fi m re re re .3 -3 .3

Pi Рч Ph

XXX On ON On Г-- Г- r-

III

on oN on 0\

r- r- r-

■ II L

fi m r<-> fi

re re re 2

es я e S

.3 .3 .3 -3

P« Ph PH PH

XXX

on on oN oN

Г- Г- Г-

о о о J2

s s s s

Tf

о

сл О

Рис. 2. Электрофореграмма ДНК-ампликонов 55Я-маркеров у моногамных мехвидовых гибридов р1(Мо76хР1ша 3-79] и р1(Мо79хР1та 3-79] по хромосоме 4 А(-субгенома на стадии проростков: СМ07. (Стрелками указаны отсутствующие у гибридов локусы).

ON Г»

<N

¿Г

^OJ '""^f -" X OS r- ^

о a 0\ o\ ON ON on

t^- P- |— Г"- I— r— .......

m m m m f^i m r'i

я к cc я ее ее cc

.3 .3 .3 .3 .3 .3 .3

Он Он Он Рн Он Рч Рн

X X X x X x X

oo oo oo oo oo oo oo

О О О О ООО

ON On ON СТ\

Г-— I—

■ ■ ■ 1

mm mm

cc re cc я

■3 -3 .3 .3

Рн Рн Рн Рн

X X X X

оо оо oo oo

О О О о

S S S S

г—

On On

г- г-

т

ее ее 2

■ Я Рн

X

оо оо О о

г-

On

г- г-

г- г-

ON ON г-

I I

т т,

ее го

• Я Рч

X

ОО ОО 00

5 *=<

Г- Г-

г~ г-

On on

Р~ г-

т т

ее ее

• 3 .3

Рн Рн

оо оо О О

-ч-о

PQ сл О

Рис. 3. Электрофореграмма ДНК-ампликонов SSR-(Mo81xPima 3-79] по хромосоме 4 Ai-субгенома на отсутствующие у гибридов локусы].

Таким образом, анализ гибридных проростков на ранней стадии развития с использованием ранее приписанных к хромосомам SSR-маркеров хлопчатника позволил обнаружить моногамные проростки в семи гибридных семьях четырех вариантов скрещиваний, что способствовало быстрому выявлению моногамных цитотипов и более раннему вовлечению их в беккроссирование. Однако среди гибридных проростков одного варианта скрещивания (Mo79xPima 3-79) моногамных проростков не было обнаружено.

Цитогенетический анализ

гибридных моносомиков Fl, полученных от скрещиваний пяти моногамных линий хлопчатника G.hirsutum L. с линией Pima 3-79 вида G. barbadense L. обнаружил гибридные межвидовые моносомики в четырех гибридных вариантах, причем во всех вариантах изучалось по нескольку семей из-за низкой

■маркеров у моносомных мехвидовых гибридов стадии проростков: ТМВ0809. (Стрелками указаны

воспроизводимости моносомного состояния в потомстве исходных растений с нехваткой хромосомы 4 А)— субгенома хлопчатника (Табл. 3).

Так, в двух комбинациях скрещиваний (р1Мо71хРта 3-79 и р1Мо81хР1та 3-79) цитогенетическим анализом было выявлено четыре гибридных моносомных растения, тогда как в двух других вариантах скрещиваний (р1Мо69хР1та 3-79 и р1Мо76хР1та 3-79) - по два гибридных моносомных растения (Табл. 3). Однако в одном варианте скрещивания (р1Мо79хР1та 3-79) вообще не было обнаружено моносомных гибридных растений.

Такие различия в

воспроизводимости моносомного состояния по хромосоме 4 А^ субгенома хлопчатника в разных гибридных потомствах могли быть обьяснены особенностями

происхождения первичных

моносомиков хлопчатника.

Таблица 3.

Анализ гибридных потомств Fi, полученных от скрещиваний моносомных линий вида G.hirsutum L. с линией Pima 3-79 вида G.barbadense L.

Хромосома Вариант скрещивания Общее число гибридных растений в семье Число изученных растений Число дисомиков (2п=52) Число моносомико в (2п=51)

FiMo69 х Pima 3-79

2 n 6 2 2 -

73 n 10 6 4 2

FiMo71 x Pima 3-79

46 n 14 4 3 1

74 n 16 5 2 3

FiMo76x Pima 3-79

4 4 n 8 4 3 1

5 n 4 2 2 -

75 n 5 2 1 1

FiMo79 x Pima 3-79

3 n 5 2 2 -

76 n 14 2 2 -

F1M08I x Pima 3-79

47 n 7 2 - 2

77 n 18 3 1 2

Анализ конъюгации хромосом у гибридных контрольных растений Fi (/I-458xPima 3-79) обнаружил отсутствие каких-либо нарушений на стадии метафаза I мейоза и формирование 26 нормальных бивалентов (Табл. 4).

Сравнительный анализ

конъюгации хромосом у гибридных моносомиков Fi, полученных от скрещиваний четырех моногамных линий с линией донором - Pima 3-79 вида G. barbadense L. обнаружил нормальную модальную конъюгацию хромосом с формированием 25 бивалентов и одного унивалента

разного размера во всех изученных МКП (Табл. 4, Рис. 4). Нормальная конъюгация хромосом у моногамных гибридов свидетельствовала об отсутствии формирования

дополнительных унивалентов, что могло служить гарантией появления явления «смены унивалента» у протестированных гибридов.

Анализ размеров моносом у моногамных межвидовых гибридных растений всех четырех вариантов скрещиваний обнаружил средний размер унивалентов с нехваткой хромосомы 4 А^субгенома

хлопчатника.

Таблица 4.

Конъюгация хромосом на стадии метафаза I мейоза у моносомных гибридов полученных от скрещиваний моносомных линий вида (¡.МгяиШт Ь. с линией Рнпа 3-

79 вида 6. ЪагЪмИете Ь.

я 5 О Вариант скрещивания et S Размер унивалентов Изучено Среднее число на клетку

о S о а, X a. vo s c_ клеток в MI Унивалентов Бивалентов

Л-458 - - 25 - 26,00±0,00

Pima 3-79 - - 30 - 26,00±0,00

FJI-458xPima 3-79 680 - 20 - 26,00±0,00

FiMo69xPima 3-79 736 Средний 6 1,00±0,00 25,00±0,00

73s Средний 10 1,00±0,00 25,00±0,00

46i2 Средний 7 1,00±0,00 25,00±0,00

FiMo71 x Pima 3-79 744 Средний 6 1,00±0,00 25,00±0,00

74i2 Средний 7 1,00±0,00 25,00±0,00

4 74i3 Средний 8 1,00±0,00 25,00±0,00

FiMo76 x Pima 3-79 47 Средний 7 1,00±0,00 25,00±0,00

75i Средний 14 1,00±0,00 25,00±0,00

47i Средний 9 1,00±0,00 25,00±0,00

F1M08I x Pima 3-79 47s Средний 12 1,00±0,00 25,00±0,00

772 Средний 8 1,00±0,00 25,00±0,00

77io Средний 6 1,00±0,00 25,00±0,00

а б

Рис. 4. Конфигурации хромосом в метафазе I мейоза в материнских клетках пыльцы у гибридных растений хлопчатника, полученных от скрещиваний моносомных линий с нехваткой хромосомы 4 с линией Pima 3-79: а) гибрид F]Mo69xPima 3-79 (73g) f25"+1'): б) гибрид FjMoSIxPima 3-79 (77ю) (25 Ч ). (Стрелкамиуказаныуниваленты).

Анализ микроспор,

стадии спорад проведенный у

моносомных гибридных растений Рз., с нехватками хромосомы 4 А^субгенома хлопчатника обнаружил высокий мейотический индекс (от 93,81±0,74 до 96,90±0,33) и небольшое число тетрад с микроядрами (от 0,38±0,19 до 1,46±0,27%), как у моносомиков из разных гибридных семей, так и у 44

моносомиков внутри различных семей (Табл. 5; Рис. 5, 6).

Небольшое число тетрад с микроядрами косвенно

свидетельствовало о регулярности расхождения унивалентных хромосом у моносомных гибридов и формировании сбалансированных по числу хромосом гамет, поскольку число микроядер в тетрадах

показателем элиминации

моносомиков является интенсивности унивалентных хромосом.

Однако, в целом, выявление высокого мейотического индекса и формирования небольшого числа тетрад с микроядрами у гибридных

моносомиков хлопчатника в р1 косвенно свидетельствовало о регулярности мейотического деления и подтверждало нормальную для моносомиков хлопчатника

конъюгацию хромосом.

Таблица 5.

Анализ спорад у гибридов р1, полученных от скрещиваний моносомных линий вида С.ЫгвШит Ь.

с линией Р1таЗ-79 вида С.ЬагЬас/епяе Ь.

Хромосома Вариант скрещивания Гибрид Общее число спорад Мейотический индекс % тетрад с микроядрами

Л-458 - 1125 99,02±0,29 0,36±0,18

Pima 3-79 - 1130 98,58±0,35 0,27±0,15

Л-458 х Pima 3-79 680 2535 98,62±0,23 0,04±0,04

FiMo69xPima 3-79 736 1065 95,77±0,62 0,75±0,26

73s 1053 94,49±0,70 0,95±0,30

46i2 1489 95,70±0,53 0,94±0,25

FiMo71xPima 3-79 744 1332 94,97±0,60 1,20±0,30

74i2 1875 96,48±0,43 0,64±0Д8

4 74i3 2838 96,90±0,33 0,81+0,17

FiMo76xPima 3-79 4y 2050 96,83±0,39 1,46+0,27

75i 1050 93,81±0,74 0,38±0,19

47i 1243 93,81±0,74 0,40±0,18

FiMo81xPima 3-79 47s 1029 96,86±0,49 0,58±0,24

772 1409 95,92±0,62 0,50+0,19

77ю 1106 95,46±0,55 0,72±0,25

а б

Рис. 5. Спорады моносомного гибридного растения р1 Мо71хРппа 3-79 (4612]; а) две монады и нормальные тетрады; б] диада с двумя микроядрами и тетрады.

а б

Рис. 6. Спорады моносомного гибридного растения р1Мо81хР1та 3-79 (77ю); а] две монады и тетрады; б] нормальная тетрада и тетрада с микроядром.

Анализ фертильности пыльцы, проведенный у растений исходных линий и межвидового дисомного гибрида, обнаружил снижение фертильности, как у исходной линии Pima 3-79 (84,34±1,51%), так и у дисомного межвидового гибрида Fi Л-458 х Pima 3-79 (80,78±1,70%) по сравнению с исходной линией Л-458 (90,92+1,15%) (Табл. 6).

Сравнительный анализ фертильности пыльцы у моногамных гибридных растений Fi выявил сильные отличия, как между различными гибридными семьями, так и внутри некоторых семей. Гибридные моносомики двух семей с нехваткой хромосомы 4 одного варианта скрещиваний (FiMo69xPima 3-79) имели сходные показатели фертильности пыльцы (82,42±2,04 и 85,11 + 1,38%), тогда как моносомики другой семьи (FiMo71 х Pima 3-79) существенно отличались между собой по фертильности пыльцы (от 80,87±2,91 до 91,89±1,50%), в пределах

11% (Табл. 6; Рис. 7). В случае фертильности пыльцы с участием линии Мо81 выяснилось, что гибридные моносомики разных семей сильно различались между собой. Так, два гибридных моносомика (47i и 47s) первой семьи характеризовались более сильным снижением

фертильности пыльцы (до 82,10±2,53 и 89,53±1,84%), чем пять гибридных моносомиков (77i, 77в, Iii, 77s, II9) второй семьи (до 92,11±1,65 и 96,50±1,04%), за исключением одного гибридного моносомика (77ю) этой семьи (88,06±1,67%). Это указало на существование специфических

различий в фертильности пыльцы у гибридных моногамных растений с нехваткой хромосомы 4 генома хлопчатника. В целом, гибридные моносомики с нехваткой этой хромосомы выделялись

варьированием показателя

фертильности пыльцы от высокой до сниженной.

Таблица 6.

Анализ фертильиости пыльцы у гибридов ¥1, полученных от скрещиваний моносомных линий вида С.й/геиШт Ь. с линией Р1шаЗ-79 вида С.ЬагЬас1епзе Ь.

Хромосома Вариант скрещивания Номер гибрида Общее число пыльцы Фертильность пыльцы, % Стерильность пыльцы, %

Л-458 - 628 90,92±1,15 9,08±1.15

Pima 3-79 - 581 84,34±1,51 15,66±1,51

Fi/l-458xPima 3-79 680 536 80,78±1,70 19,22±1,70

FiMo69xPima 3-79 736 665 85Д1±1,38 14,89±1,38

73s 347 82,42±2,04 17,58±2,04

46i2 311 89,71±172 10,29±172

FiMo71x Pima 3-79 744 183 80,87±2,91 19ДЗ±2,91

74i2 333 91,89+1,50 8,11±1,50

74i3 353 90,65±1,55 9,35±1,55

FiMo76 x Pima 3-79 47 - - -

4 751 905 90,94±0,95 9,06±0,95

47i 277 89,53±1,84 10,47±1,84

47s 229 82Д0±2,53 17,90±2,53

771 274 94,16±1,42 5,84±1,42

F1M08I x Pima 3-79 77 ъ 314 96,50±1,04 3,50±1,04

77i 974 94,97±0,70 5,03±0,70

778 266 92Д1±1,65 7,89±1,65

77g 259 94,21±1,45 5,79±1,45

77io 377 88,06±1,67 11,94±1,67

Рис. 7. Фертильная (окрашенная) и стерильная (неокрашенная) пыльца у гибридного моносомика (744), полученного от скрещивания моносомной линии с линией Pima 3-79: Fi Mo71xPima 3-79.

нормальную для моносомиков

Таким образом, сравнительный анализ коньюгации хромосом у гибридных моносомиков Fi с нехваткой хромосомы 4 At-генома хлопчатника, полученных от скрещиваний четырех моносомных линий с линией донором - Pima 3-79 вида G.barbadense L. обнаружил

конъюгацию хромосом с

формированием 25 бивалентов и одного унивалента среднего размера во всех изученных МКП. Выявление высокого мейотического индекса и формирования небольшого числа тетрад с микроядрами у гибридных

47

моносомиков Fi косвенно

свидетельствовало о регулярности мейотического деления и нормальной для моносомиков хлопчатника конъюгации хромосом.

Сравнительный анализ фертильности пыльцы выявил, что гибридные моносомики с нехваткой хромосомы 4 выделялись варьированием

показателя фертильности пыльцы между высокой и сниженной фертильности в пределах различных гибридных семей. Частичное снижение фертильности пыльцы

свидетельствовало о скрытой структурной межвидовой

изменчивости, не регистрируемой на стадии, метафаза I мейоза. Такая скрытая изменчивость проявляется в виде формирования частично несбалансированных гамет и, в дальнейшем, пыльцевых зерен на последующих стадиях развития мужских половых гамет.

Использованная литература

1. Санамьян М.Ф., Мусаев Д.А. Обнаружение и цитологическое изучение анеуплоидных и эуплоидных растений с транслокациями хромосом у хлопчатника Gossypium hirsutum L. // Генетика. 1990. T.26. №3. C.506-515.

2. Beasley J.О., Brown M.S. Asynaptic Gossypium plants and their polyploids //J. Agric. Res. 1942. V.65. № 9. P. 421-427.

3. Endrizzi J.E., Turcotte E.L., Kohel R.J. Genetics, cytology and evolution of Gossypium //Adv. Genet. 1985. V.23.-P. 271-375.

4. Fang, D.D.; Thyssen G.N.; Wang, M.; Jenkins, J.N.; McCarty, J.C.; Jones, D.C. Genomic confirmation of Gossypium

barbadense introgression into G.hirsutum and a subsequent MAGIC population. //Molecular Genetics and Genomics. 2023.

https://doi.org/10.1007/sQ0438-022-01974-3

5. Gutie'rrez O.A., Stelly, D.M., Saha, S., Jenkins, J.N., McCarty J.C., Raska, D.A.; Scheffler, B.E. Integrative placement and orientation of non-redundant SSR loci in cotton linkage groups by deficiency analysis. //Mol.Breed. 2009. V.23. P.693-707.

6. Hoffman S.M.; Yu J.Z.; Grum, D.S.; Xiao, J.; Kohel, R.J.; Pepper, A.E. Identification of 700 new microsatellite loci from cotton [G.hirsutum L.). ///. Cotton Science. 2007.V.11. P. 208-241.

7. Hulse-Kemp A.M., Lemm J., Plieske J. Development of a 63K SNP array for cotton and high-density mapping of intraspecific and interspecific populations of Gossypium spp. // G3 Genes|Genomes|Genetics. 2015. V.5. P. 1187-1209.

8. Jenkins J.N., McCarty J.C., Wu J., Saha S., Gutierrez O., Hayes R., Stelly D.M. Genetic effects of thirteen Gossypium barbadense L. chromosome substitution lines in top crosses with upland cotton cultivars: II. Fiber quality traits //Crop Sci. 2007. V.47. P.561-572.

9. Jenkins J.N., McCarty Jack C., Jr., Campbell B.T., Hayes R.W., Wu J., Saha S., Stelly D.M. Genotypic comparisons of chromosomes 01, 04, and 18 from three tetraploid species of Gossypium in top crosses with five elite cultivars of G. hirsutum L. //Euphytica. 2017. V. 213. P.107.

10. Reinisch A.J., Dong J., Brubaker C.L., Stelly D.M., Wendel J.F., Paterson A.H.

A detailed RFLP map of cotton, Gossypium hirsutum x Gossypium barbadense: chromosome

organization and evolution in a disomic polyploidy genome //Genetics. 1994. V.138. P. 829-847.

11. Saha S„ Wu J., Jenkins J.N., McCarty J.C., Jr., O.A. Gutierrez, Stelly D.M., Percy R.G., Raska D.A. Effect of chromosome substitutions from Gossypium barbadense L. 3-79 into G. hirsutum L. TM-1 on agronomic and fiber traits //Journal of Cotton Science. 2004. V.8. P 162-169.

12. Saha S„ Jenkins J.N., Wu J., McCarty J.C., Gutierrez O.A., Percy R.G., Cantrell R.G., Stelly D.M. Effects of chromosome-specific introgression in upland cotton on fiber and agronomic traits //Genetics. 2006a. V. 172. P. 1927-1938.

13. Saha S„ Raska D.A., Stelly D.M. Upland cotton (Gossypium hirsutum L.) x Hawaiian cotton (G.tomentosum Nutt. ex Seem.) Fi hybrid hypoaneuploid chromosome substitution series //Journal of Cotton Science. 2006b. V.10. P. 263-272.

14. Saha S„ Jenkins J.N., Wu J., McCarty J.C., Stelly D.M. Genetic analysis of agronomic and fibre traits using four interspecific chromosome substitution lines in cotton // Plant Breeding. 2008. V.127. P.612—618.

15. Saha S„ Wu J., Jenkins J. N„ Jack C. McCarty, Russell Hayes, Stelly D.M. Genetic dissection of chromosome substitution lines of cotton to discover novel Gossypium barbadense L. alleles for improvement of agronomic traits //Theor. Appl. Genet. 2010. V.120. P.1193-1205.

16. Saha S„ Raska D.A., Stelly D.M., Manchali Sh., Gutierrez O.A.

Hypoaneuploid chromosome

substitution Fi hybrids of Gossypium hirsutum L. x G.mustelinum Miers ex Watt //Journal of Cotton Science. 2013b. V. 17. P.102-114

17. Saha S„ Stelly D.M., Makamov A.K., Ayubov M.S., Raska D., Gutie'rrez O.A., Manchali Sh., Jenkins J.N., Deng D., Abdurakhmonov I.Y. Molecular confirmation of Gossypium hirsutum chromosome substitution lines //Euphytica. 2015. V.245. P.l-15.

18. Saha S„ Jenkins J.N., McCarty J.C., Hayes R.W. Stelly D.M., Campbell B.T. Registration of Two CS-B17-derived Upland Cotton Recombinant Inbred Lines with Improved Fiber Micronaire. //Journal of plant registrations. 2018. V.12. P.97-100.

19. Saha S„ Bellaloui N., Jenkins J.N., McCarty J.C., Stelly D.M. Effect of chromosome substitutions from Gossypium barbadense L., G. tomentosum Nutt. Ex Seem and G. mustelinum Watt into G. hirsutum L. on cottonseed protein and oil content.//Euphytica. 2020. V.216. P.118.

https://doi.org/10.1007/slQ681-020-02644-4

20. Sanamyan M.F., Petlyakova J., Rakhmatullina E.M., Sharipova E. Chapter 10. Cytogenetic collection of Uzbekistan. In: Abdurakhmonov IY. (Ed). World Cotton Germplasm Resources. Croatia: In Tech. 2014. P. 247-287.

21. Sanamyan M.F.; Makamov, A.K.; Bobokhujaev, Sh.U.; Usmonov, D.E.; Buriev, Z.T.; Saha S.; Stelly D.M. The Utilization of Translocation Lines and Microsatellite Markers for the Identification of Unknown Cotton Monosomic Lines. //Cotton Research.

Edited by Dr. Abdurakhmonov, I.Y. Eds.; Intech open. Croatia. 2016, Chapter 8, pp. 167-183.

22. Sanamyan, M.F.; Bobokhujaev, Sh.U. Identification of univalent chromosomes in monosomic lines of cotton (Gossypium hirsutum L.) by means of cytogenetic markers. //Vavilov Journal of Genetics and Breeding. 2019. V.23. №7. P. 836-845.

23. Shchapova A., Kravtsova L. The production of wheat-rye substitution lines by using the Giemsa staining technique // Cereal Res. Comm. 1982. V. 1-2. P. 33-39.

24. Stelly D.M., Saha S„ Raska D.A., Jenkins J.N., McCarty J.C., Jr., Gutie'rrez O.A. Registration of 17 upland (Gossypium hirsutum) cotton germplasm lines disomic for different G. barbadense chromosome or arm substitutions //Crop Sci. 2005. V.45. P.2663-2665.

25. Ulloa M„ Wang C„ Saha S„ Hutmacher R.B., Stelly D.M., Jenkins J.N. Burke J., Roberts P.A. Analysis of root-knot nematode and fusarium wilt disease resistance in cotton (Gossypium spp.) using chromosome substitution lines from two alien species //Genetica. 2016. V.144. P.167-179.

26. Wendel J.F., Brubaker C.L., Alvarez I., Cronn R.C., Stewart J.M. Evolution and natural history of the cotton genus. In: Paterson AH (Ed.) Genetics and Genomics of Cotton. Springer, New York, USA. 2009. P.3-22.

27. Zhang, B. Transgenic Cotton: From Biotransformation Methods to Agricultural Application. In: Zhang B. (eds) Transgenic Cotton. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols), Humana Press, Totowa, NJ. 2013,958.