CC BY
8
УДК 547.82
Семёнкин А.С., Аббасова К.Р., Осипова Н.С., Завадовский Р.А., Поливанова А.Г., Шипуло Е.В.
C ИНТЕЗ 1,4-ДИГИДРОПИРИДИНОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ АНАЛОГОВ ГАММА-АМИНОМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ С ПОТЕНЦИАЛЬНОЙ ПРОТИВОСУДОРОЖНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
Семёнкин Алексей Сергеевич - аспирант 1-го года обучения кафедры химии и технологии биомедицинских препаратов, semyonkin@muctr.ru;
Осипова Н. С. - старший научный сотрудник научно-образовательной лаборатории систем доставки лекарственных веществ;
Завадовский Роман Александрович - студент 4-го года обучения кафедры химии и технологии биомедицинских препаратов;
Поливанова Анна Геннадьевна - кандидат химических наук, доцент кафедры химии и технологии биомедицинских препаратов, zagchem@mail.ru;
Шипуло Елена Владимировна - кандидат химических наук, старший научный сотрудник научно -образовательной лаборатории систем доставки лекарственных веществ;
ФГБОУ ВО «Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева», Россия, Москва, 125047, Миусская площадь, дом 9.
Аббасова Кенуль Расимовна - кандидат биологических наук, доцент кафедры физиологии человека и животных; ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», Россия, Москва, 119991, ул. Колмогорова, 1.
Статья посвящена синтезу 1,4-дигидропиридиновых производных гамма-аминомасляной кислоты и её аналогов, обладающих более высокой липофильностью и способностью к биоокислению с переходом в заряженную форму. Такие пролекарства потенциально обладают, с одной стороны, более высокой степенью проникновения через гемато-цефалический барьер (биодоступностью), с другой - способностью удерживаться в клетках мишенях более длительное время (оказывать пролонгированный терапевтический эффект).
Ключевые слова: пролекарства, химические системы доставки, габапентиноиды, гемато-энцефалический барьер
SYNTHESIS OF 1,4-DIHYDROPYRIDINE-DERIVATIVES OF GAMMA-AMINO-BUTYRIC ACID AND ITS ANALOGUES Semyonkin A.S.1, Abbasova K.R.2, Osipova N.S.1, Zavadovskiy R.A. 1, Polivanova A.G. 1, Shipulo E.V. 1
1 D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russian Federation
2 Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russian Federation
The article is devoted to the synthesis of 1,4-dihydropyridine derivatives of gamma-aminobutyric acid and its analogues, which have a higher lipophilicity and the ability to biooxidation with the transition to a charged form. Such prodrugs potentially have, on the one hand, a higher degree of penetration through the hematocephalic barrier (bioavailability), on the other hand - the ability to remain in target cells for a longer time (provide a prolonged therapeutic effect).
Key words: prodrugs, chemical delivery systems, gabapentinoids, blood-brain barrier
Введение
Заболевания центральной нервной системы являются одной из значительных угроз здоровью населения Земли. По данным ВОЗ, на долю неврологических заболеваний приходится 276 миллионов лет жизни, скорректированных по нетрудоспособности (DALY от англ. «Disability-adjusted life year»), что составляет 11,6% от всех DALY; эти заболевания привели к 9,0 миллионам смертей (16,5% от общего числа смертей), и для большинства заболеваний наблюдается рост случаев [1].
Многочисленные заболевания различной этиологии, такие как эпилепсия, клиническая депрессия, мигрени, болезни Паркинсона и Альцгеймера, заболевания вирусной и бактериальной
природы, имеют общую проблему - низкую эффективность медикаментозной терапии вследствие наличия специализированных барьеров, таких как барьер между кровью и цереброспинальной жидкостью, цереброспинальной жидкостью и кровью, а также между кровью и паренхимой мозга (гемато-энцефалический барьер - ГЭБ), который ограничивает доступ веществ и объектов из крови в клетки мозга [2]. Из этих барьеров наиболее изученным и наиболее значимым является ГЭБ, поскольку площадь его поверхности значительно превышает другие.
Основные подходы к преодолению ГЭБ при разработке лекарственных препаратов разделяются на пассивные и активные. К пассивным можно отнести использование лекарственных веществ,
способных самостоятельно проходить через клетки барьера путём диффузии (в этом случае есть ограничения по молекулярной массе и гидрофильно-гидрофобным характеристикам молекулы. Другой вариант - использование того факта, что при некоторых заболеваниях целостность ГЭБ нарушается в определённое окно времени. Однако, часто разрушение ГЭБ происходит уже на такой стадии, когда лечение неэффективно (например, в случае ишемического инсульта ГЭБ критическими для выживаемости нейронов, находящимися в области полутени, являются первые 3 часа, в течение которых поступление нейропротекторных веществ способно значительно изменить исход, но ГЭБ теряет целостность на более поздних стадиях заболевания, от 6 до 24 часов [3,4]. В случае опухолевых заболеваний на определённом этапе происходит образование нового барьера, кровь-опухоль, который, хотя и является более проницаемым, тем не менее является препятствием на пути проникновения ЛВ в опухоль, отчасти в силу своей гетерогенности [5].
К активным способам доставки лекарственных средств относят искусственное открытие ГЭБ при помощи гиперосмотических растворов и ультразвука и др. Очевидно, что в таком случае помимо необходимого лекарственного вещества в мозг способны проникать и другие вещества, что может привести к нарушению гомеостаза мозга и его повреждению [6]. Использование коллоидных средств доставки является весьма многообещающим, но их способность проходить через ГЭБ зависит от многих параметров [7], либо требует дополнительных свойств поверхности, таких как специфические взаимодействия с рецепторами на поверхности клеток ГЭБ [8]. Дополнительно, такие носители ЛВ (липосомы, полимерные мицеллы, наночастицы, конъюгаты с белками и проч.) сложны в разработке и производстве. На данный момент нет зарегистрированных препаратов на основе коллоидных носителей, показанных для лечения заболеваний головного мозга, несмотря на десятилетия испытаний (тем не менее, их появление -лишь вопрос времени и связано отчасти с существующими нормами и регуляциями в области фармации).
Ещё один подход при конструировании новых более эффективных препаратов - химическое обратимое изменение свойств лекарственного вещества, в результате которого дочерние молекулы получают необходимые свойства для преодоления ГЭБ, такие как повышенная липофильность, либо способность взаимодействовать со специфическими рецепторами. В рамках этого подхода реализуются различные варианты конструирования новых молекул. Так, например, к пролекарствам, как правило, относят структуры, способные превращаться в активное соединение в один этап. Другая группа веществ - soft drugs, представляют собой химические системы доставки с более сложными модификациями структуры исходной молекулы, которые переходят в ее через несколько
стадий биотрансформации. Метаболизм soft drugs предсказан заранее на основе известных данных о биологических процессах в организме. Этот более сложный вариант конструирования получил название ретрометаболический подход. Как правило, ключевыми стадиями биотрансформации
ретрометаболических препаратов являются изменение окислительно -восстановительного
состояния и гидролитическое (ферменативное) разрушение сложноэфирных и/или амидных связей.
Таким образом, наряду с поиском новых активных структур, модификация известных лекарственных веществ различными способами с целью получения новых более эффективных терапевтических препаратов для лечения заболеваний центральной нервной системы является актуальной задачей для современной медицинской химии.
Следует отметить, что даже в случае лекарственных веществ, способных проникать через ГЭБ, поиск путей оптимизации их активной структуры, тем не менее, актуален по ряду причин. Прежде всего из-за ограниченности транспортных систем. Так, например, лекарственные вещества из класса габапентиноидов (производных гамма-аминомасляной кислоты) обладают способностью проникать через ГЭБ посредством взаимодействия с LAT1 рецепторами. Однако, как было показано ранее [9], возможности этой транспортной системы существенно ограниченны, ввиду насыщаемости рецепторов, а пассивному транспорту габапентиноидов препятствует их высокая растворимость. Увеличение доз вводимых препаратов может привести к значительным побочным эффектам, поэтому были предприняты попытки разработать системы доставки, позволяющие повысить эффективность транспорта через ГЭБ и, как следствие, достигать терапевтического эффекта при меньших количествах вводимого вещества [10].
Один из вариантов модификации структуры габапентиноидов подразумевает введение двух ключевых фрагментов: сложноэфирной группы с насыщенным или ароматическим радикалом, а также 1,4-дигидропиридинового цикла, связанного с основной молекулой амидной связью [11]. Такая модификация позволяет, во-первых, значительно повысить общую липофильность молекулы и, как следствие, увеличить эффективность проникновения через ГЭБ посредством пассивного транспорта. С другой стороны, за счёт способности фрагмента 1,4-дигидропиридина к биоокислению до заряженного пиридиния уже непосредственно в клетках-мишенях, молекула получает способность удерживаться там в значительно большем количестве, поскольку заряженные соединения с трудом проникают через липофильные клеточные барьеры и, таким образом, не могут подвергаться обратному транспорту. Совокупность этих модификаций в итоге увеличивает биодоступность, а также обеспечивает более длительный терапевтический эффект исходного препарата.
Целью нашего исследования являлось получение с использованием ретрометаболического подхода новых неописанных ранее производных габапентина, прегабалина и фенибута и изучение их противоэпилептической активности на
пентилентетразольной модели эпилепсии у крыс.
На первом этапе реализации проекта были получены производные гамма-аминомасляной кислоты, габапентина и прегабалина с общей формулой I.
лв
>узия
м
>5
NAD+
NAD(H)
—-v фермента ( ^В ) ШЙНЬ[0 j-|g —"" гидролиз
Рис. 1. Принцип действия окислительно-восстановительных химических систем доставки
Данные производные могут быть использованы в лекарственных композициях либо в виде свободного основания (I), либо в виде нетоксичных фармацевтических приемлемых солей (II) неорганических или органических кислот (например, в виде гидрохлорида, сукцината, аскорбата и других).
Как показано ранее [1] использование подобных препаратов в виде свободного основания или его соли не является принципиальным, поскольку в биологических средах (in vivo) и та и другая форма
способна преобразовываться в четвертичную соль III, которая будет обеспечивать удерживание искомого препарата в клетках головного мозга и обуславливать более длительный терапевтический эффект.
В рамках нашего исследования целевые препараты предполагается первоначально использовать в виде свободных оснований, поскольку такая более липофильная форма обладает большей потенциальной способностью проникновения через ГЭБ. Кроме, того, поскольку на втором этапе работы предполагается получение наносомальных форм целевых веществ на основе полилактидных наночастиц, перевод полученных соединений в форму соли также нецелесообразен, поскольку более липофильная структура будет лучше включаться в полимерную матрицу.
Для получения целевых соединений первоначально была использована реализованная ранее разными исследовательскими коллективами синтетическая схема, которая включает четыре стадии:
• модификацию карбоксильной группы -этерификацию габапентина различными спиртами (бензиловый спирт, циклогексанол, изо-пропанол, н-бутанол), с получением гидрохлоридов соответствующих эфиров;
• модификацию аминогруппы - получение соответствующих амидов никотиновой кислоты;
• кватернизацию полученных производных иодистым метилом;
• восстановление промежуточных соединений дитионитом натрия с получением целевых 1,4-дигидропиридиниевых производных.
Общая схема получения целевых соединений представлена ниже (рис. 2).
H,N
Рис. 2. Исходная схема синтеза производных ГАМК и её аналогов
По аналогии с представленной в литературе методикой [12, 13] этерификацию исходного габапентина проводили в среде спирта в присутствии тионилхлорида. Образующийся в этих условиях промежуточный хлорангидрид легко вступает во взаимодействие со спиртом, давая в качестве продукта гидрохлорид соответствующего эфира габапентина. Для осаждения целевого продукта из раствора к реакционной массе либо сразу прибавляли небольшое количество диэтилового эфира, либо проводили предварительную отгонку спирта в
вакууме. Полученные кристаллические технические продукты дополнительно перекристаллизовывали из смеси диэтиловый эфир / этанол в различных соотношениях в зависимости от их растворимости. Выходы эфиров габапентина составляли от 58 до 90%.
Модификацию аминогруппы синтезированных на первой стадии производных габапентина и получение соответствующих амидов никотиновой кислоты проводили в среде пиридина при активации карбоксильной группы циклогексилкарбодиимидом.
Выделение продукта проводили по стандартной методике, включающей удаление фильтрацией циклогексилмочевины, отгонку пиридина, экстракцию целевого продукта этилацетатом, промывку экстрактов водой и упаривание экстрагента. Кроме того, для продукта 2а потребовалась дополнительная очистка колоночной хроматографией (элюент хлороформ:метанол, градиентное элюирование). Все продукты были получены с чистотой более 95 % в виде вязких жёлтых масел.
Кватернизацию полученных производных габапентина иодистым метилом проводили в среде ацетона по стандартной методике.
Восстановление соединений 3 а - 3 с дитионитом натрия до соответствующих целевых 1,4-дигидропиридиниевых производных проводили в деаэрированной воде в атмосфере аргона. Полученные соединения обладают высокой способностью к окислению на воздухе и на свету, ввиду чего их хранение следует проводить в инертной атмосфере в закрытой от попадания света ёмкости. Полученные целевые соединения первоначально представляют собой вязкие жёлтые масла, которые проявляют ограниченную способность к кристаллизации в смеси гексан / этилацетат.
Результаты работы представлены в Таблице №1.
Таблица №1
Соединение R LogP Суммарный выход, %
4a CH2C6H5 2,83±0,44 25,2
4b Ц-С6Н11 3,14±0,43 33,2
4c CH2CH2CH3 2,14±0,43 24,9
В результате проведённой работы установлено, что предложенная в литературе четырехстадийная схема позволяет получать целевые соединения с выходом не более 35%, а в отдельных случаях - около 25%. Учитывая довольно низкий суммарных, а также тот факт, что в качестве реагентов на разных стадиях используются высокотоксичные и вредные вещества (тионилхлорид, пиридин и метилиодид), что в свою очередь обуславливает дополнительные сложности при очистке продуктов в процессе наработки фармацевтических субстанций, поиск новых подходов и оптимизация методик синтеза ключевых промежуточных продуктов является актуальной задачей этого направления исследований.
Благодарности
Авторы выражают благодарность Российскому фонду фундаментальных исследований за предоставление гранта №20-015-00220 А, при поддержке которого выполняется работа. Список литературы
1. Feigin V.L. et al. Global, regional, and national burden of neurological disorders, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016
// The Lancet Neurology. - 2019. - Vol.18. - № 5. -P. 459-480.
2. Profaci C.P. et al. The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions / C.P. Profaci, R.N. Munj, R.S. Pulido, R. Daneman //Journal of Experimental Medicine. - 2020. - Vol. 217. - №. 4.
3. Albayrak S. et al. Effect of transient focal ischemia on blood-brain barrier permeability in the rat: correlation to cell injury / S. Albayrak, Q. Zhao, B.K. Siesjö, M.-L. Smith //Acta neuropathologica. - 1997. - Vol.94. -№.2. - P. 158-163.
4. Pardridge W.M. Targeting neurotherapeutic agents through the blood-brain barrier //Archives of neurology. - 2002. - Vol.59. - №.1. - P. 35-40.
5. Arvanitis C.D. The blood-brain barrier and blood-tumour barrier in brain tumours and metastases / C.D. Arvanitis, G.B. Ferraro, R.K. Jain // Nature Reviews Cancer. - 2020. - Vol.20. - №.1. - P. 26-41.
6. Meairs S. Ultrasound, microbubbles and the blood-brain barrier / S. Meairs, A. Alonso // Progress in biophysics and molecular biology. - 2007. - Vol.93. -№.1-3. - P. 354-362.
7. Jo D.H. Size, surface charge, and shape determine therapeutic effects of nanoparticles on brain and retinal diseases. D.H. Jo, J.H. Kim, T.G. Lee, J.H. Kim // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. - 2015. - Vol.11. - №.7. - P. 1603-1611.
8. Lajoie J.M. Targeting receptor-mediated transport for delivery of biologics across the blood-brain barrier. J.M. Lajoie, E.V. Shusta // Annual review of pharmacology and toxicology. - 2015. - Vol.55. - P. 613-631.
9. Dickens D. et al. Transport of gabapentin by LAT1 (SLC7A5) / D. Dickens, S.D. Webb, S. Antonyuk, A. Giannoudis, A. Owen, S. Rädisch, S.S. Hasnain, M. Pirmohamed // Biochemical pharmacology. - 2013. -Vol.85. - №.11. - P. 1672-1683.
10. Wilson B. Albumin nanoparticles for the delivery of gabapentin: preparation, characterization and pharmacodynamic studies / B. Wilson, Y. Lavanya, S.R.B. Priyadarshini, M. Ramasamy, J.L. Jenita // International Journal of Pharmaceutics. - 2014. -Vol.473. - №.1-2. - P.73-79.
11. Pop E. Chemical systems for delivery of antiepileptic drugs to the central nervous system / E. Pop, N. Bodor. // Epilepsy research. - 1992. - Vol.13. - №.1. - P. 116.
12. Namdeo K. P. Synthesis and Anticonvulsant Activity of Prodrug of Gabapentin / K.P. Namdeo, S.K. Shrivastava // Asian Journal of Chemistry. - 2011. -Vol.23. - №.4. - P. 1861.
13. Anderson W.R. et al. Anxiolytic activity of a brain delivery system for GABA / W.R. Anderson, J.W. Simpkins, P.A. Woodard, D. Winwood, W.C. Stern, N. Bodor // Psychopharmacology. - 1987. - V.92. -№.2. - C. 157-163.
