CC BY
107
УДК 619:579.62
10.18286/1816-4501-2016-2-87-91
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИИ К АНТИБИОТИКАМ И ПРОИЗВОДСТВЕННЫМ ШТАММАМ БАКТЕРИОФАГОВ
Золотухин Сергей Николаевич1, доктор биологических наук, профессор кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарной экспертизы»
Мелехин Андрей Сергеевич1, аспирант кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарной экспертизы»
Пименов Николай Васильевич2, доктор биологических наук, профессор кафедры «Биология и патология мелких домашних, лабораторных и экзотических животных» ФГБОУ ВО Ульяновская ГСХА1
ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»2
432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец,1; тел 8(8422)559535; e-mail: fvm.zol@yandex.ru1 109472, г. Москва, ул. Скрябина, 23; тел.: 8(495)377-91-17; e-mail: pimenov-nikolai@yandex.ru2
Ключевые слова: инфекционная диарея, патогенные энтеробактерии, антибиотики, бактериофаги.
В статье рассматривается чувствительность возбудителей диарейных заболеваний поросят сосунов к антибиотикам и бактертофагам. Показано, что ни один антибиотик не ингибирует стопроцентно изученных штаммов энтеробактерий. Наибольшим спектром литической активности по отношению к гомологичны бактериям обладал мор-ганеллезный бактериофаг Phagum М. morganii М-20 УГСХА, он лизировал 90,6% изученных микроорганизмов, остальные штаммы бактериофагов были активны по отношению к гомологичным бактериям в пределах 79,3-89,3%.
Введение
Проблема борьбы с массовыми желудочно-кишечными заболеваниями новорожденных животных в настоящее время остается актуальной. Благодаря работам отечественных и зарубежных исследователей установлено, что абсолютное большинство вспышек диарейных заболеваний молодняка имеют инфекционную природу, протекают массово, в виде энзоотических вспышек и наносят большой экономический ущерб животноводческим хозяйствам из-за гибели и снижения продуктивности заболевших животных [1, 2, 3, 4, 5, 6].
Имеющиеся на вооружении практических ветеринарных работников средства специфической профилактики этих заболеваний направлены против ограниченного количества возбудителей болезни (эшерихий, сальмонелл, клостридий перфрингенс) и не активны по отношению к другим патогенным микроорганизмам, в частности представителям семейства Enterobacteriaceae
(родов Proteus, Morganella, Citrobacter, En-terbacter, Klebsiella, Yersinia, Hafnia и др.). Перечисленные микроорганизмы, по данным разных авторов, широко распространены в природе и довольно часто циркулируют в животноводческих хозяйствах, вызывая массовые желудочно-кишечные заболевания молодняка животных [1, 2, 3, 4, 5, 6].
Применение антибиотиков «вслепую», без определения чувствительности выделенных микроорганизмов к используемым препаратам, не всегда дает желаемые положительные результаты. Это связано, в первую очередь, с появлением антибиотикоустойчи-вых штаммов микроорганизмов к двум, трем и более применяемым в хозяйствах препаратов [7].
Во многих литературных источниках говорится о положительном опыте лечения и профилактики некоторых заболеваний животных, вызываемых патогенными и условно-патогенными микроорганизмами с помощью специфических бактериофагов [8, 5, 9, 10, 11].
и
Sä es »1
Si
р и ш SS si ■ i
00 и
Поэтому перед исследователями стоит задача: определение чувствительности возбудителей инфекционной диареи к различным антибактериальным препаратам, в том числе и специфическим бактериофагам, что позволит более эффективно вести борьбу с заболеваниями, вызванными этими микроорганизмами и ускорить процесс ликвидации эпизоотического очага в конкретном хозяйстве.
Целью настоящего исследования являлось изучение чувствительности патогенных энтеробактерий, выделенных в различных хозяйствах из патологического и биоматериала из органов и тканей трупов и от больных диареей поросят-сосунов в период массовых желудочно-кишечных заболеваний к антибиотикам и производственным штаммам бактериофагов, используемым для изготовления поливалентного фагового биопрепарата.
Объекты и методы исследований
Чувствительность энтеробактерий к антибиотикам определяли методом диффузии в агар с помощью бумажных дисков, пропитанных соответствующими препаратами. Для этого использовали коммерческие наборы дисков, рекомендованные для бактерий семейства Enterobacteriaceae, родов Staphylococcus, Enterococcus и Pseudomonas (производитель - ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пасте-ра). Исследование проводили согласно МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» [12], а также в соответствии с методические рекомендации «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» [13].
Для оценки чувствительности энтеро-бактерий использовали агар Мюллера-Хин-тон (МХА) без дополнительных добавок.
Инокулят готовили методом прямого суспендирования в стерильном изотоническом растворе колоний чистой 18-24-часовой культуры бактерий, выросшей на плотной неселективной питательной среде. Для этого стерильной бактериологической петлей собирали несколько колоний, суспендировали полученный материал в стерильном изотоническом растворе, доводя бактериальную суспензию до плотности 0,5 по стан-
и
Sä es »1
Si
р Ü ш SS Hi ■ i
00 s!
дарту мутности МакФарланда, что приблизительно соответствовало 108 КОЕ/мл путем добавления в суспензию микробной массы или разбавляли ее стерильным изотоническим раствором.
Перед использованием стандарт мутности энергично встряхивали. Суспензию использовали не позднее 60 минут после приготовления.
Затем бактериальную суспензию ино-кулировали на агар, для чего погружали стерильный ватный тампон в суспензию, удаляли избыток суспензии, отжав тампон о стенки пробирки. Далее наносили инокулят штриховыми движениями на всю поверхность агара в трех направлениях, поворачивая чашку Петри на 60°.
Диски в течение 15 минут плотно наносили на поверхность инокулированного исследуемой культурой и подсушенного агара.
Чашки с посевами ставили вверх дном в термостат для инкубирования при температуре 35±1°С на 16-20 ч.
Результаты учитывали, измеряя диаметр отсутствия роста микроорганизмов вокруг дисков, пропитанных антибиотиками, интерпретируя результаты согласно рекомендациям, изложенным в выше обозначенных инструктивных документах.
Эти же изоляты энтеробактерий изучали на чувствительность к гомологичным бактериофагам, используемым для изготовления лечебно-профилактического биопрепарата. Для этого штаммы фагов Phagum Morganella morganii М-20 УГСХА, Phagum Escherichia coli E-70 УГСХА, Phagum Citrobacter C-61 УГСХА, Phagum Proteus П-261 УГСХА, Phagum Enterobacter En-13 УГСХА из коллекции кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринар-но-санитарной экспертизы ФГБОУ ВО Ульяновская ГСХА, выделенные нами и депонированные во Всероссийской коллекции микроорганизмов ВГНКИ.
Для изучения спектра литической активности фагов (чувствительности культур) применяли метод нанесения капель бактериофагов на газон исследуемых штаммов микроорганизмов [14, 8]. С этой целью на поверхность МПА в чашках Петри пипеткой наносили 3-4 капли 18-24-часовой бульонной культуры исследуемых микроорганизмов. За-
тем равномерно распределяли по поверхности среды стерильным шпателем. Чашки с засеянными средами подсушивали в термостате в течение 15-20 минут. После чего на поверхность среды пипеткой легким прикосновением капли наносили исследуемый фаг, наклоняли чашку так, чтобы капли стекли, а затем инкубировали при температуре 37°С, оценку результатов проводили через 18-24 часа. В качестве контроля на поверхность плотной питательной среды с культурой наносили стерильный питательный бульон.
При положительном результате на поверхности агара наблюдали прозрачную зону лизиса исследуемой культуры. В контрольных чашках рост исследуемого микроорганизма был по всей поверхности среды без участков лизиса.
Результаты исследований
В рамках проводимых исследований была изучена чувствительность к пенициллину, гентамицину, ампициллину, неомици-ну, тетрациклину, стрептомицину, левоми-цетину, эритромицину, цефтриаксону и ци-профлоксацину у 235 штаммов энтеробакте-рии (76 вида E. coli, 53 M. morganii, 45 рода
Proteus, 32 - Citrobacter 29 - Enterobacter).
Почти все изученные штаммы были устойчивы к пенициллину, лишь 1 штамм эн-теробактеров и 5 штаммов протея обладали умеренной устойчивостью к этому препарату, что составило 2,6% от общего количества изученных изолятов энтеробактерий.
К гентамицину были чувствительны 34,8% изолятов E. coli, 56,2% штаммов рода Citrobacter, 31% - Enterobacter , 33,3% - Proteus и 56,6% штаммов вида М. morganii из числа изученных. Устойчивы к этому антибиотику были 34,2% изолятов E. coli, 25,0% энтеробактерий рода Citrobacter, 34,5% -Enterobacter, 40,0% - Proteus и 28,3% изолятов вида М. morganii и умеренную устойчивость показали 31,5% штаммов E. coli, 18,6% Citrobacter, 34,5% Enterobacter, 26,7% Proteus и 15,1% вида М. morganii.
Ампициллин был активен в отношении 57,8% изолятов E. coli, 50% энтеробактерий рода Citrobacter, 34,5% Enterobacter, 37,7% Proteus и 60,4% изолятов вида М. morganii; устойчивы к нему были 27,3% изолятов E. coli, 31,3% энтеробактерий рода Citrobacter, 31,0% Enterobacter, 44,4% Proteus и 30,2%
Таблица 1
Результаты изучения чувствительности штаммов энтеробактерий к антибиотикам
№ пп Антибиотик Вид (род возбудителя и результаты изучения чувствительности
Escherichia coli Citrobacter Enterobacter Proteus Morganella morganii
Количество всего % чувствительных Количество всего % чувствительных Количество всего % чувствительных Количество всего % чувствительных Количество всего % чувствительных
1 Пенициллин 76 0 32 0 29 0 45 0 53 0
2 Гентамицин 76 34,8 32 56,2 29 31,0 45 33,3 53 56,6
3 Ампициллин 76 57,6 32 50,0 29 34,5 45 37,7 53 60,4
4 Неомицин 76 16,7 32 31,3 29 16,6 45 35,6 53 43,3
5 Тетрациклин 76 42,4 32 34,4 29 24,1 45 28,9 53 39,6
6 Стрептомицин 76 13,6 32 15,6 29 20,7 45 24,4 53 26,4
7 Левомицетин 76 60,6 32 56,6 29 51,7 45 64,4 53 66,0
8 Эритромицин 76 7,5 32 18,8 29 13,8 45 20,0 53 35,8
9 Цефтриаксон 76 84,7 32 81,3 29 72,4 45 77,8 53 77,3
10 Ципрофлоксацин 76 74,2 32 83,3 29 65,6 45 82,2 53 79,2
Таблица 2
Результаты изучения спектра литического действия и специфичности бактериофагов
№ пп Штамм бактериофага Вид (род) возбудителя и результаты изучения чувствительности
Escherichia coli Citrobacter Enterobacter Proteus Morganella morganii
Исследовано штаммов Количество чувствительных % Исследовано штаммов Количество чувствительных % Исследовано штаммов Количество чувствительных % Исследовано штаммов Количество чувствительных % Исследовано штаммов Количество чувствительных %
1 E-70 УГСХА 76 67/88,2 32 - 29 - 45 - 53 -
2 C-61 УГСХА 76 - 32 26/81,6 29 - 45 - 53 -
3 En-13 ГСХА 76 - 32 - 29 23/79,3 45 - 53 -
4 П-261 ГСХА 76 - 32 - 29 - 45 39/86,7 53 -
5 M-20 УГСХА 76 - 32 - 29 - 45 - 53 48/90,6
изолятов вида М. morganii. Умеренную устойчивость к этому препарату показали 14,4% E. coli, 18,8% Citrobacter, 34,5% Enterobacter, 17,8% Proteus 9,4% М. morganii.
Левомицетин активно ингибировал выделенные микроорганизмы в пределах 51,7-66%, к нему были устойчивы 17,8-31,3% и умеренно устойчивы в пределах от 3,1 до 20,7% изолятов энтеробактерий.
Невысокую активность проявили антибиотики неомицин, тетрациклин, стрептомицин и эритромицин. К этим антибиотикам были чувствительны 7,9-43,3%, устойчивы 20,8-74,2% и умеренно устойчивы 10,553,1% проверенных изолятов.
Наибольшую активность проявили препараты цефалоспоринового ряда, антибиотики цефтриаксон и ципрофлоксацин. К ним были чувствительны 65,6-84,2% изученных микроорганизмов, устойчивы 5,6-15,6% и умеренно устойчивы от 3 до 24,1% изоля-тов разных родов энтеробактерий.
Результаты изучения чувствительности выделенных и идентифицированных штаммов энтеробактерий отражены в таблице 1.
Исследования показали, что ни один из проверенных препаратов не ингибировал 100% выделенных изолятов энтеробактерий, вызывающих инфекционную диарею у поросят.
Результаты изучения диапазона лити-ческой активности производственных штам-
и
Sä es »1
Si
Р О Ш SS Hi ■ i
00 s!
мов бактериофагов отражены в таблице 2, из которой видно, что изученные штаммы бактериофагов обладали строгой специфичностью и не лизировали представителей энтеробактерий гетерологичных родов. Наибольшим спектром литической активности по отношению к гомологичным бактериям обладал морганеллезный бактериофаг Р^ адит М. тогдапи М-20 УГСХА, он лизировал 90,6% изученных микроорганизмов, остальные штаммы бактериофагов были активны по отношению к гомологичным бактериям в пределах 79,3-89,3%.
Выводы
Большинство штаммов энтеробактерий, выделенных при массовых желудочно-кишечных заболеваниях поросят-сосунов, обладали полирезистентностью к антибиотикам: пенициллину, гентамицину, ампициллину, неомицину, тетрациклину, стрептомицину, левомицетину, эритромицину. Наибольшую активность проявили препараты цефалоспоринового ряда, антибиотики цефтриаксон и ципрофлоксацин. К ним были чувствительны 65,6-83,3% изученных микроорганизмов, устойчивы 9,1-16,7% и умеренно устойчивы 3-12% культур. Ни один из проверенных препаратов не ингибиро-вал 100% выделенных изолятов энтеробак-терий, вызывающих инфекционную диарею у поросят.
Штаммы бактериофагов из серии УГ-СХА обладали строгой специфичностью и не лизировали представителей энтеробактерий гетерологичных родов. Наибольшим спектром литической активности по отношению к гомологичны бактериям обладал морганеллезный бактериофаг Phagum M. morganii M-20 УГСХА, он лизировал 90,6% изученных микроорганизмов, остальные штаммы бактериофагов были активны по отношению к гомологичным бактериям в пределах 79,3-89,3%.
Библиографический список
1. Моно- и смешанные инфекционные диареи новорожденных телят и поросят / Х.З. Гаффаров, А.В. Иванов, Е.А. Непоклонов [и др.]. - Казань: Издательство «Фэн», 2002. - 592 с.
2. Золотухин, С.Н. Малоизученные эн-теробактерии и их роль в патологии животных: монография / С.Н. Золотухин . - Улья-новск,2004. - 125 с.
3. Золотухин, С.Н. Смешанная кишечная инфекция телят и поросят, вызываемая патогенными энтеробактериями / С.Н. Золотухин, Л.С. Каврук, Д.А. Васильев. - Ульяновск, 2005. - 126 с.
4. Золотухин, С.Н. Неспецифическая профилактика смешанной кишечной инфекции телят и поросят / С.Н. Золотухин, Л.П. Пульчеровская, Л.С. Каврук // Практик. -2006. - № 6. - С. 72.
5. Применение биокомпозитного материала «ЛитАр» в сочетании с бактериофагами при лечении переломов конечностей у животных / С.Н. Золотухин, В.Ю. Пичугин // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2011. - №3. -С.45-49.
6. Мелехин, А.С. Этиология смешанной кишечной инфекции поросят-сосунов / А.С.Мелехин, Д.С. Золотухин, С.Н. Золотухин // Вестник ветеринарии.- 2011. - Том 59, № 4. - С. 75-77.
7. Золотухин, С.Н., Чувствительность патогенных энтеробактерий, выделенных при диареях молодняка животных к антибиотикам и специфическим бактериофагам / С.Н.
Золотухин, А.С. Мелехин, Д.А.Васильев, Л.С. Каврук, Н.И.Молофеева, Л.П.Пульчеровская, Б.М.Коритняк, Е.А.Бульканова // Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных. Материалы межународной научно-практической конференции. Ульяновск - 2006. -С. 233-236.
8. Золотухин, Сергей Николаевич Бактериофаги Morganella morganii и их применение при желудочно-кишечных заболеваниях поросят / С.Н.Золотухин : автореф. дис. ... канд. ветеринарных наук. - М., 1994. - 16 с.
9. Ленёв, С.В. Бактериофаги для лечения и профилактики сальмонеллеза птиц / С.В. Ленёв, Н.А. Дрогалина, С.А. Бугаев // Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для человека и животных. Материалы Международной научно- практической конфиренции. 21-23 июня 2006 года. - Ульяновск,2006. - С. 417.
10. Фагопрофилактика смешанной кишечной инфекции поросят-сосунов, вызываемой патогенными энтеробактериями /
A.С. Мелехин, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев, Д.С. Золотухин, Г.А.Шевалаев // Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения. Материалы международной научной конференции. - Ульяновск , 2012. -Том 1. -С. 262-267.
11. Пименов, Н.В. Бивалентный бактериофаг против сальмонеллеза птиц / Н.В. Пименов // Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии: Сборник научных трудов молодых ученых. -М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2011. - Выпуск 7. - С. 168-174.
12. МУК 4.2.1890-04 Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: Методические указания. - М.: Федеральный центр россанэ-пиднадзора Минздрава России, 2004. - 91 с.
13. Методические рекомендации «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам».-Москва, 2014 - 154 с.
14. Ганюшкин, В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии /
B.Я Ганюшкин. - Ульяновск, 1988. - 45с.
