CC BY
23
Чувствительность к антибиотикам пневмококков, выделенных у детей города Красноярска
И. Н. Протасова1, 3, О. В. Перьянова1, 3, Н. В. Бахарева2,
А. Б. Салмина1, И. В. Рева4, 5, Т. Такано4, Я. Ивао4, Т. Ямамото4,
С. В. Сидоренко6, В. Г. Мельников7
1 Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого, Красноярск, Россия
2 Главное управление здравоохранения администрации города Красноярска, Красноярск, Россия
3 Российско-Японский центр микробиологии, эпидемиологии и инфекционных заболеваний, Красноярск, Россия
4 Международный медицинский научно-исследовательский центр, Ниигата, Япония
5 Школа биомедицины Дальневосточного федерального университета, Владивосток, Россия
6 НИИ детских инфекций, Санкт-Петербург, Россия
7 Международный научно-технический центр, Москва, Россия
Проведено исследование резистентности к антибактериальным препаратам и сероти-повой принадлежности 30 штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных от детей г. Красноярска. Полирезистентные штаммы составили 16,7% и характеризовались резистентностью к эритромицину, клиндамицину и тетрациклинам с высокими значениями МПК.
Большинство штаммов, в том числе полирезистентных, относится к серотипам, входящим в состав пневмококковых вакцин, из них 60% принадлежат к серотипам 23F и 19F.
Ключевые слова: Streptococcus pneumoniae, серотипирование, антибиотикорезистен-тность, вакцинация.
Antimicrobial Susceptibility of Pediatric Streptococcus pneumoniae Isolates in Krasnoyarsk
I. N. Protasova1' 3, O. V. Peryanova1' 3, N. V. Bakhareva2, A. B. Salmina1'3, I. V. Reva4'5, T. Takano4, Y. Ivao4, T. Yamamoto4, S. V. Sidorenko6, V. G. Melnikov7
1 Krasnoyarsk State Medical University named after Prof. V. F. Voino-Yasenetsky, Krasnoyarsk, Russia
2 Central Administration of Public Health of Krasnoyarsk City, Krasnoyarsk, Russia
3 Russian-Japanese Centre on Microbiology, Epidemiology and Infectious Diseases, Krasnoyarsk, Russia
4 International Medical Science and Research Center, Niigata, Japan
5 Biomedical School, Far Eastern Federal University, Vladivostok, Russia
6 Research Institute of Pediatric Infectious Diseases, Saint Petersburg, Russia
7 International Science and Technology Center, Moscow, Russia
Streptococcus pneumoniae strains isolated from children of Krasnoyarsk (Siberia, Russian Federation) were examined. Authors determined Streptococcus pneumoniae serotypes and antimicrobial resistance. 16.7%
Контактный адрес:
Ирина Николаевна Протасова
Эл. почта: ovsyanka802@gmail.com
of strains were multiple resistant with high MIC values for erythromycin, clindamycin and tetracycline (256, 128 and 32 mg/l, respectively). Prevalent serotypes were 23F and 19F. Most of serotypes (90%) belonged to those included in pneumococcal vaccines.
Key words: Streptococcus pneumoniae, serotyping, antimicrobial resistance, vaccination.
Введение
Streptococcus pneumoniae в настоящее время является одним из основных бактериальных патогенов человека. По оценке ВОЗ пневмококковые заболевания являются причиной ежегодной гибели 1,6 млн человек [1]. Среди детей в возрасте до 5 лет ежегодно регистрируется около 14,5 млн случаев тяжелых пневмококковых заболеваний (включая пневмонию, менингит и сепсис), приводящих к летальному исходу приблизительно в 500 тыс. случаев [2, 3].
В Европе и США S. pneumoniae является причиной 30-50% внебольничных пневмоний у взрослых, требующих госпитализации [4]. У детей частота обнаружения S. pneumoniae составляет 78% при долевой пневмонии и 13% при бронхопневмонии [5].
Спектр серотипов, вызывающих неинвазив-ные пневмококковые заболевания (средний отит и синусит) у детей до 5 лет, характеризуется значительным разнообразием. Инвазивные инфекции в основном обусловлены серотипами 1, 5, 6А, 6В, 14, 19F и 23F [6]. Некоторые серотипы (6B, 9V, 14, 19A, 19F и 23F) чаще других ассоциированы с лекарственной устойчивостью [7].
За последние 30 лет устойчивость пневмококков к антибактериальным препаратам существенно возросла. Впервые пенициллинорезистентные пневмококки были выделены в Австралии в 1967 г., позже — в Новой Гвинее (1974 г.), Южной Африке (1976 г.) и Испании (1979 г.). В настоящее время большинство пенициллино- и эритромицинорези-стентных штаммов во всем мире относится к серо-типам 6B, 6A, 9V, 14, 15A, 19F, 19A и 23F. После начала применения 7-валентной пневмококковой вакцины в 2000-х годах стали регистрироваться другие (невакцинные) серотипы, среди которых большое значение приобрел полирезистентный серотип 19А [8]. В РФ, по данным многоцентрового исследования ПеГАС, в 1999-2009 гг. полирезистентные штаммы S. pneumoniae составляли от 11,8 до 14,5% [9]; при этом все они сохраняли чувствительность к левофлоксацину, моксифлоксацину, ванкомицину, линезолиду и эртапенему.
Резистентность S. pneumoniae к антибактериальным препаратам обусловлена несколькими механизмами: изменением структуры пенициллинсвя-зывающих белков за счет модификации генов pbp2x, pbp1a и pbp2b (устойчивость к бета-лактамам), метилированием рибосом при наличии генов erm (устойчивость к макролидам, а также линкозамидам и стрептограмину), эффлюксом макролидов (гены mef) [8], защитой рибосом с помощью белка tetM, способствующего отщеплению тетрациклина от 30S субъединицы рибосом по ГТФ-зависимому пути
(ген tetM) [10]. По данным многих авторов, частота встречаемости различных серотипов, механизмы и уровень резистентности S. pneumoniae к антибактериальным препаратам могут существенно различаться в зависимости от региона [6, 8, 11, 12].
В г. Красноярске и Красноярском крае проблема антибиотикорезистентности пневмококков до настоящего времени остается неизученной, в связи с чем целью нашего исследования явилось определение чувствительности к антибиотикам и серо-типовой принадлежности штаммов S. pneumoniae, выделенных от детей в возрасте до 5 лет.
Материал и методы_
В исследование включено 30 штаммов S. pneu-moniae, полученных от детей г. Красноярска в возрасте до 5 лет.
Для выделения пневмококков использовали кровяной агар на основе Columbia Agar (BioRad, Франция) с добавлением 5% эритроцитарной массы [13], а также Chocolate Agar Base без селективной добавки (HiMedia, Индия). Инкубацию проводили в эксикаторе при температуре 35 °С в течение 24 ч. Идентифицировали пневмококки на основании морфотинкториальных, культуральных и антигенных свойств (Slidex pneumo-Kit, ЬюМепеих, Франция). Для хранения штаммов при -80 °С использовали триптиказо-соевый бульон (CONDA Pronadisa, Испания) с добавлением 30% глицерина.
Исследование чувствительности к антимикробным препаратам проводили согласно рекомендациям CLSI (2012) методом разведений в агаре Мюллера-Хинтон с добавлением 5% крови барана [14]. Для приготовления инокулюма использовали суточную чистую культуру S. pneumoniae, которую суспендировали в 0,9% стерильном растворе хлорида натрия до мутности, эквивалентной 0,5 по стандарту McFarland. Полученную взвесь наносили на поверхность приготовленного агара с антибиотиком и инкубировали при температуре 35 °С в условиях СО2-инкубатора в течение суток. Интерпретацию результатов проводили согласно критериям CLSI (2012) и EUCAST (для доксици-клина и миноциклина) [15]; оценку уровня чувствительности к цефдиторену проводили в соответствии с данными M. Soriano [16], к панипенему — в соответствии с данными M. L. Grayson et al. [17].
В качестве контроля использовался штамм S. pneumoniae АТСС 49619.
Серотипирование S. pneumoniae проводили методом ПЦР, используя 40 пар праймеров, рекомендованных CDC [18].
Фрагменты cps-генов, имеющихся у всех кап-сульных штаммов S. pneumoniae, амплифициро-
вали по следующему температурному профилю: при 94 °С — 2 мин.; 94 °С — 15 с, 56 °С — 10 с, при 72 °С — 15 с, 35 циклов; 72 °С — 10 мин.; 4 °С — хранение [19]. Данное исследование использовалось в качестве теста, подтверждающего принадлежность к пневмококкам.
39 пар праймеров, используемых для амплификации фрагментов cps-генов, кодирующих серог-руппы/серотипы 1, 2, 3, 4, 5, 6A/6B/6C, 7F/7A, 7C/ (7B/40), 8, 9L/9N, 9V/9A, 10A, 10F/ (10C/33C), 11A/11D, 12F/ (12A/44/46), 13, 14, 15A/15F, 15B/15C, 16F, 17F, 18A/18B/18C/18F, 19A, 19F, 20, 21, 22A/22F, 23A, 23B, 23F, 24A/24B/24F, 31, 33F/ (33A/37), 34, 35A/ (35C/42), 35B, 35F/47F, 38F/25F, 39F, были сгруппированы в 10 мультиплексных реакций, проводимых последовательно [19]. Амплификация проводилась на приборе Applied Biosystems по следующему температурному профилю: при 94 °С — 2 мин.; 94 °С — 10 с, 54 °С — 15 с, при 72 °С — 10 с, 39 циклов; 72 °С — 2 мин.; 4 °С — хранение.
Продукты амплификации детектировали в 1,5% агарозном геле (Sigma, США) с последующей визуализацией этидием бромида (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) при УФ-излучении (А 310 нм) в трансиллюминаторе Molecular Imager® Gel Doc XR System (Bio-Rad, США). Размеры ПЦР-продуктов определяли сравнением с маркером молекулярных масс (100 bp DNA Ladder; Евроген, Россия).
Статистическая обработка и анализ полученных результатов осуществлялись с использованием компьютерных программ Microsoft Office Excel 2007 и Microsoft Office Access 2007.
Результаты_
Исследовано 30 штаммов S. pneumoniae, полученных от детей из Красноярского краевого дома ребёнка, детских образовательных коллективов г. Красноярска (МБДОУ № 64, МБДОУ № 222), неорганизованных детей, прикреплённых к город-
30,0 30,0
Распределение серотипов исследуемых штаммов (в %).
ской детской поликлинике № 1, а также от детей, госпитализированных по поводу острого среднего отита и менингита.
Большинство штаммов (90%) было выделено из носоглотки бактерионосителей, 6,7% (2 штамма) — из отделяемого среднего уха, 3,3% (1 штамм) — из крови.
Большинство штаммов (73,3%) принадлежали к серотипам 23F, 19F и серогруппе 6 (6ABC). В целом, до 90% относились к серотипам, входящим в состав пневмококковых вакцин, разрешенных к применению в РФ (рисунок).
Чувствительность S. pneumoniae определяли к 15 антимикробным препаратам: пенициллину, цефа-лоспоринам (цефаклор, цефдиторен, цефтриаксон), карбапенемам (имипенем, панипенем), макролидам (эритромицин), линкозамидам (клиндамицин), тетрациклинам (тетрациклин, доксициклин, мино-циклин), фторхинолонам (левофлоксацин), глико-пептидам (ванкомицин), оксазолидинонам (линезо-лид), ансамицинам (рифампицин) (табл. 1).
Исследуемые штаммы демонстрировали высокую чувствительность к пенициллину, доля умеренно резистентных составила 6,7%. Это коррелирует с данными исследования ПЕГАС [9], согласно которым доля нечувствительных к данному препарату штаммов в Российской Федерации составляет 8,111,2%. В то же время, доля штаммов, нечувствительных к пероральному цефалоспорину II поколения цефаклору, составила 20%; к пероральному цефалоспорину III поколения цефдиторену — 10%; к парентеральному цефалоспорину III поколения цефтри-аксону — 10%. При этом значения МПК90 составили 16, 0,5 и 1 мг/л соответственно, т. е. для цефаклора они находятся в диапазоне резистентности.
Карбапенемы обладали практически 100% активностью в отношении S. pneumoniae (за исключением одного штамма, умеренно резистентного к имипенему) при значениях МПК90 0,063 (ими-пенем) и 0,031 мг/л (панипенем). Необходимо отметить, что панипенем, широко применяемый в Японии, в настоящее время в клинической практике в Российской Федерации не используется.
Штаммы, нечувствительные к эритромицину (УР + Р), составили 16,6% от общего числа, что в 3 раза выше аналогичного показателя в 20062009 гг. по данным исследования ПЕГАС (4,6%). Штаммы, устойчивые к клиндамицину, составили 10%, что также превышает общероссийские показатели (от 2,9 до 4,5% за период 1999-2009 гг.).
Препараты группы тетрациклинов (тетрациклин, доксициклин, миноциклин) в 86,7% случаев обладали активностью в отношении исследуемых штаммов, при этом значения МПК90 находились в диапазоне резистентности. Согласно общероссий-
Таблица 1. Результаты определения чувствительности к антимикробным препаратам выделенных штаммов S. pneumoniae
Препарат МПК50, мг/л МПК90, мг/л Диапазон МПК, мг/л Ч, % УР, % Р, %
Пенициллин 0,125 2 0,016-4 93,3 6,7 0
Цефаклор 0,5 16 0,25-64 80 3,3 16,7
Цефдиторен 0,031 0,5 0,008-1 90 0 10
Цефтриаксон 0,063 1,0 0,008-2,0 90 10 0
Имипенем 0,016 0,063 0,004-0,25 96,7 3,3 0
Панипенем 0,008 0,031 0,002-0,63 100 0 0
Эритромицин 0,063 4,0 0,031-256 83,4 3,3 13,3
Клиндамицин 0,063 0,063 0,016-256 90 0 10
Тетрациклин 0,125 32 0,125-32 86,7 0 13,3
Доксициклин 0,063 4 0,063-8 86,7 0 13,3
Миноциклин 0,031 4 0,031-4 86,7 0 13,3
Левофлоксацин 1 1 0,5-1 100 0 0
Ванкомицин 0,25 0,5 0,25-0,5 100 0 0
Линезолид 0,5 1 0,5-1 100 0 0
Рифампицин 0,063 0,063 0,015-512 96,7 0 3,3
Примечание. Ч - чувствительные, УР - умеренно резистентные, Р - резистентные штаммы.
Таблица 2. Характеристика 5 полирезистентных штаммов S. pneumoniae
Серотип/ серогруппа Пенициллин Цефаклор Цефдиторен Цефтриаксон Имипенем Панипенем Эритромицин Клиндамицин Ванкомицин Линезолид Тетрациклин Доксициклин Миноциклин Левофлоксацин Рифампицин
19F УР P Ч Ч УР Ч P P Ч Ч Ч Ч Ч Ч Ч
19F УР P Ч Ч Ч Ч УР Ч Ч Ч P P P Ч Ч
6ABC Ч P P УР Ч Ч P P Ч Ч P P P Ч Ч
6 ABC Ч P P УР Ч Ч P P Ч Ч P P P Ч Ч
9VA Ч P P УР Ч Ч P Ч Ч Ч P P P Ч P
ским показателям, от 25 до 27% штаммов пневмо-коккков нечувствительны к тетрациклину.
Все штаммы S. pneumoniae характеризовались чувствительностью к левофлоксацину, ванкомици-ну и линезолиду.
К рифампицину устойчивость выявлена у одного штамма.
Из 30 исследованных штаммов 5 (16,7%) обладали полирезистентностью (табл. 2). Четыре из них были выделены из носоглотки детей-бактерионосителей (дом ребенка), один штамм — из отделяемого среднего уха.
Все полирезистентные штаммы демонстрировали устойчивость к цефаклору со значениями МПК от 16 до 64 мг/л (при этом МПК пенициллина составила от 2 до 4 мг/л), а также к эритромицину. У трех штаммов, резистентных к эритромицину, значения МПК находились на высоком уровне и составляли 256 мг/л; МПК клиндамицина у дан-
ных штаммов составила 128 мг/л, МПК тетрациклина — 32 мг/л.
Обращает на себя внимание штамм, резистентный к рифампицину (МПК составила 512 мг/л). Данный штамм получен от годовалого ребенка с острым отитом, принадлежал к серогруппе 9 (9^А) и характеризовался устойчивостью к цефа-лоспоринам, тетрациклинам и эритромицину.
Необходимо отметить, что все полирезистентные штаммы сохраняли чувствительность к левофлок-сацину, панипенему, ванкомицину и линезолиду.
Заключение_
Пневмококковая инфекция является актуальной проблемой в педиатрической практике. Основной группой риска являются дети первых 5 лет жизни, особенно маловесные, недоношенные, с хроническими заболеваниями, врожденными аномалиями развития и иммунодефицитными состояниями.
Болезни, вызываемые S. pneumoniae, наносят значительный ущерб демографической и экономической ситуации в Красноярском крае. Экономические потери региона при лечении острых отитов, менингитов, сепсиса пневмококковой этиологии у детей раннего возраста, с учетом прямых и непрямых экономических затрат, составляют порядка 350 млн руб.
Наши предыдущие исследования по изучению назофарингеального носительства пневмококков среди детей г. Красноярска показали высокий уровень бактерионосительства как среди организованных (49,6%), так и среди неорганизованных (53,4%) детей [20], что говорит о необходимости введения пневмококковых вакцин в региональные программы иммунизации.
В г. Красноярске и Красноярском крае впервые начато серотипирование пневмококков и исследование их антибиотикорезистентности.
Согласно полученным нами данным, большинство серотипов исследуемых штаммов S. pneumoni-
Литература
1. World Health Organization. Pneumococcal conjugate vaccine for childhood immunization - WHO position paper. Wkly Epidemiol Rec 2007; 82:93-104.
2. World Health Organization. Progress in introduction of pneumococcal conjugate vaccine worldwide, 2000-2012. Wkly Epidemiol Rec 2013; 88:173-80.
3. O'Brien K.L., Wolfson L.J., Watt J.P., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet 2009; 374:893-902.
4. World Health Organization. Pneumococcal vaccines -WHO position paper. Wkly Epidemiol Rec 2012; 87:129-44.
5. Vuori-Holopainen E., Peltola H. Reappraisal of lung tap: review of an old method for better etiologic diagnosis of childhood pneumonia. Clin Infect Dis 2001; 32:715-26.
6. Johnson H.L., Deloria-Knoll M., Levine O.S., et al. Systematic evaluation of serotypes causing invasive pneumo-coccal disease among children under five: the pneumococ-cal global serotype project. PLoS Med 2010; 7:e1000348.
7. Kyaw M.H., Lynfield R., Schaffner W., et al. Effect of introduction of the pneumococcal conjugate vaccine on drug-resistant Streptococcus pneumoniae. N Engl J Med 2006; 354:145-63.
8. Reinert R.R. The antimicrobial resistance profile of Streptococcus pneumoniae. Clin Microbiol Infect 2009; 15 (Suppl 3):7-11.
9. Козлов Р.С., Сивая О.В., Кречикова О.И., Иванчик Н.В. Динамика резистентности Streptococcus pneumoniae к антибиотикам в России за период 19992009 гг. (Результаты многоцентрового исследования «ПеГАС». Клин микробиол антимикроб химиотер 2010; 12:329-41.
10. Grohs P., Trieu-Cuot P., Podglajen I., et al. Molecular basis for different levels of tet(M) expression in Streptococcus pneumoniae clinical isolates. Antimicrob Agents Chemother 2012; 56:5040-5.
ae (90%) относились к вакцинальным, входящим в состав 13-валентной пневмококковой вакцины.
Количество полирезистентных штаммов составило 16,7%, что выше средних показателей по РФ. Обращает на себя внимание высокий уровень резистентности к эритромицину (16,6%) и цефалоспо-ринам (10-20%). Серотипы всех полирезистентных штаммов также принадлежали к вакцинальным.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о целесообразности и перспективности вакцинации против пневмококковой инфекции как одного из путей сдерживания распространения резистентности S. pneumoniae к антибактериальным препаратам.
Исследования, направленные на совершенствование диагностики, терапии и профилактики пневмококковых инфекций, позволят снизить показатели заболеваемости и смертности среди детей и приведут к улучшению демографической и социально-экономической ситуации в Красноярском крае.
11. Савинова Т.А., Филимонова О.Ю., Грудинина С.А., Сидоренко С.В. Генетическое разнообразие пени-циллиноустойчивых Streptococcus pneumoniae. Журн инфектол 2009; 1:66-71.
12. Reinert R.R., Filimonova O.Y., Al-Lahham A., et al. Mechanisms of macrolide resistance among Streptococcus pneumoniae isolates from Russia. Antimicrob Agents Chemother 2008; 52:2260-2.
13. Кречикова О.И., Козлов Р.С., Богданович Т.М., и др. Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам Streptococcus pneumoniae (методические рекомендации). Клин микробиол антимикроб химиотер 2000; 2:88-98.
14. CLSI. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-second informational supplement. CLSI document M100-S22. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2012.
15. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing - EUCAST. Available from: URL: http://www. eucast.org/
16. Soriano F., Gimenez M.J., Aguilar L. Cefditoren in upper and lower community-acquired respiratory tract infections. Drug Des Devel Ther 2011; 5:85-94.
17. Grayson M.L., Crowe S.M., McCarty J.S., et al., editors. Kucers' the use of antibiotics: A clinical review of antibacterial, antifungal, antiparasitic, and antiviral drugs. 6th ed. CRC Press; 2010.
18. Streptococcus Laboratory. Available from: URL: http:// www.cdc.gov /ncidod/biotech/strep/protocols.htm
19. Савинова Т.А. Генетическое разнообразие и молекулярные основы резистентности Streptococcus pneumoniae к /3-лактамным антибиотикам. Автореф. дисс... канд. биол. наук. М., 2011.
20. Бахарева Н.В., Протасова И.Н., Перьянова О.В. и др. Бактерионосительство Streptococcus pneumoniae среди детей г. Красноярска. Эпидемиол и вакцино-проф 2012; 4:73-7.
