CC BY
12Уважаемые коллеги, читатели!
Вашему вниманию предлагается научная статья «Частота мутаций в гене коннексина 26 и связь с продукцией аутоантител к миелиновому (РО) белку при сенсоневральной тугоухости».
Статья посвящена малоизвестному аспекту нашей специальности - генетическим мутациям.
На этапе предварительного рецензирования был получен отзыв (см. в конце статьи), где высказаны существенные замечания, с которыми авторы не согласились.
Учитывая это, редакция журнала «Российская оториноларингология» сочла необходимым представить обе точки зрения на данную проблему и пригласить читателей высказать собственное мнение.
Редакция
УДК 616.28-009:575.24/.25
ЧАСТОТА МУТАЦИЙ В ГЕНЕ КОННЕКСИНА 26 И СВЯЗЬ С ПРОДУКЦИЕЙ АУТОАНТИТЕЛ К МИЕЛИНОВОМУ (РО) БЕЛКУ ПРИ СЕНСОНЕВРАЛЬНОЙ ТУГОУХОСТИ
М. З. Саидов, П. К. Рамазанова, Ю. А. Джамалудинов
ГОУ ВПО «Дагестанская государственная медицинская академия», г. Махачкала, Дагестан, Россия (Зав. каф. патологической физиологии - проф. М. З. Саидов,
зав. каф. болезней уха, горла и носа с курсом усовершенствованием врачей - проф. Г. А. Гаджимирзаев)
THE FREQUENCY OF MUTATIONS IN CONNEXIN 26 GENE AND JUNCTION WITH PRODUCTION OF AUTOANTIBODIES TO MYELIN PROTEIN ZERO (P0) IN PATIENTS WITH SENSORINEURAL HEARING LOSS
M. Z. Saidov, P. K. Ramazanova, U. A. Dgamaludinov
Dagestan State Medical Academy, Makhachkala, Dagestan, Russia
В работе представлены результаты изучения частоты патологических мутаций 35delG, 167delT, 235delC в гене коннексина 26 при наследственных формах сенсоневральной тугоухости. Определена связь мутаций в гене коннексина 26 с продукцией аутоантител к миелиновому (Р0) белку. Показано, что при прогрессирующих формах сенсоневральной тугоухости уровень аутоантител выше по сравнению с непрогрессирующими формами этого заболевания.
Ключевые слова: сенсоневральная тугоухость, мутации в гене коннексина 26 - 35delG, 167delT и 235delC, аутоантитела к миелиновому белку.
Библиография: 14 источников.
In paper direct results of investigation the frequency of pathologic mutations 35delg, 167deh; 235dek in connexin 26 gene on hereditary hearing loss. By the results was determinate junction the pathologic mutations with production of autoantibodies to myelin protein zero (p0). In progressive forms of sensorineural hearing loss the level of autoantibodies to myelin protein zero (p0) was higher then in patients with nonprogressive sensorineural hearing loss.
Keywords: sensorineural hearing loss, mutations in connexin 26 gene, autoantibodies to myelin protein zero (PO).
Bibliography: 14 sources.
В соответствии с устоявшимися представле- поражаются рецепторы наружных и внутренних ниями, сенсоневральная тугоухость (СНТ) явля- волосковых клеток улитки и частично слухового ется патологическим процессом, при котором нерва, вследствие чего индуцируются дегенера-
тивно-атрофические изменения в структурах внутреннего уха с последующим нарушением функции звуковосприятия. Изучение генетических основ атрофических и дегенеративных изменений нейроэпителия улитки при наследственной СНТ явилось настоящим прорывом в понимании патофизиологии СНТ.
В настоящее время установлено, что мутации в гене коннексина 26 (GJB2), локализованном в области 13q11-q13, являются доминирующими при наследственных формах СНТ. Наиболее важной является мутация 35delG, обозначающая делецию гуанина в 35 положении в гомозиготном состоянии, приводящая к сдвигу рамки считывания, образованию стоп-кодона и нарушению синтеза белка коннексина 26, ответственного за транспорт электролитов в волосковых клетках органа Корти, что приводит к блоку звуковосприятия [2, 3, 8]. Кроме этого, из всех описанных мутаций гена GJB2 наиболее практически значимыми, в отношении диагностики и прогноза, являются мутации 167delT и 235delC, обозначающие деле-ции нуклеотидов тимина в 167 положении и ци-тозина в 235 положении [3-5]. Тестирование этих мутаций также имеет высокую диагностическую ценность. Оценка клинической значимости экспрессии мутировавших генов коннексинов при СНТ предоставляет широкие возможности в отношении медико-генетического консультирования, скрининга детей с тугоухостью и показаний к кохлеарной имплантации [4, 5]. Клинически наследственная тугоухость и глухота представлены в форме синдромальных и несиндромальных вариантов с разнообразной симптоматикой.
Не менее важным аспектом проблемы СНТ является изучение ненаследственных форм этого заболевания. Известно, что такие факторы риска, как вирусные инфекции, применение ототоксических препаратов, черепно-мозговые травмы, менингит, сосудистые нарушения и др., могут провоцировать нарушение функции звуко-восприятия по типу СНТ [1]. В этом отношении участию иммунной системы в механизмах развития СНТ уделяется достаточно большое внимание. Интересными оказались данные об индукции гуморального аутоиммунного ответа на РО-белок, входящий в состав миелиновой оболочки клеток Шванна, присутствующих в слуховом нерве [6, 9, 10]. Показано, что у 27% пациентов с СНТ определяются антитела к РО-белку, причем эти антитела чаще встречались при прогрессирующей СНТ, нежели при внезапной потере слуха [13]. Антитела к РО-белку класса IgG были определены у всех больных с билатеральными формами СНТ и болезнью Меньера, в то время как только у 5 из 45 пациентов (11%) с односторонней потерей слуха определялись указанные антитела [9]. Очевидно, что эти и другие данные имеют непо-
средственное отношение к процессам демиели-низации нервных волокон и нарушению функции звукопроведения.
Идентификация аутоантител к миелиново-му белку при СНТ и патогенетические следствия этого процесса послужили основанием для выделения отдельной нозологической единицы -аутоиммунных форм СНТ [11-13]. Результаты подобных исследований меняют принципиальные подходы к диагностике и лечению СНТ. В частности, перспективно изучение частоты встречаемости аутоантител к миелиновому белку при наследственных формах СНТ. Несмотря на известные патофизиологические следствия генетических мутаций при наследственных формах СНТ, не исключается участие в том числе и аутоиммунных механизмов в дегенеративно-атрофи-ческих изменениях нейроэпителия улитки. Более того, известно, что эти формы СНТ могут прогрессировать под воздействием вышеуказанных факторов риска [14]. Принимают ли участие в этом прогрессировании аутоантитела к миелино-вому белку - этот вопрос остается неизученным.
Цель исследования. Изучение частоты мутаций 35delG, 167delr и 235de^ в гене коннексина 26 у больных СНТ, а также связи этих мутаций с типом наследования патологических генов и с уровнем сывороточных аутоантител к миелино-вому (РО) белку.
Пациенты и методы. Из числа учащихся МКУ школы-интерната I и II видов для глухих и слабослышащих детей и подростков г. Махачкалы были сформированы следующие тематические группы больных.
1. Пациенты с наследственной несиндромаль-ной СНТ, по данным аудиометрии, с III и IV степенями тугоухости. Пациенты этой группы имели все известные признаки наследственной природы СНТ без сопутствующих генетически обусловленных клинических синдромов (n = 42).
2. Пациенты с ненаследственной прогрессирующей СНТ, со II и с III степенями тугоухости, по данным аудиометрии. В эту группу включались лишь те пациенты, у которых по данным анамнеза и родословным наследственность не была отягощена. У родителей, дедушек, бабушек, братьев, сестер и ближайших родственников СНТ не отмечалась. В этих случаях выяснялся вероятный этиологический фактор прогрессирования СНТ (вирусные инфекции, применение ототоксиче-ских препаратов, черепно-мозговые травмы, менингит, сосудистые нарушения и др.) (n = 19).
3. Пациенты с наследственной несиндромаль-ной прогрессирующей СНТ, со II степенью тугоухости, по результатам аудиометрии. В эту группу вошли пациенты с наследственной отягощенно-стью по СНТ, установленной по данным анамнеза и анализа родословных (заключение врача-ге-
нетика) и у которых имелось прогрессирование тугоухости под воздействием в основном указанных выше вероятных этиологических факторов (n = 14).
Верификация наследственных форм СНТ проводилась с обязательным участием врача-генетика.
Мутации 35delG, 167delT и 235delC в гене GJB2, а также состояние этих мутаций (гетерозиготное либо гомозиготное) изучались с использованием минисеквенирования и масс-спектрометрического способа детекции конечного продукта. Масс-спектрометрия, называемая еще «время-пролетная масс спектрометрия», или MALDI TOF масс-спектрометрия, была выполнена на установке BRUKER Autoflex III smart-beam в ФГУ «НИИ физико-химической медицины» ФМБА России в отделе генетики (зав. проф. В. М. Говорун).
Для определения аутоантител к миелиновому белку (РО) в сыворотке крови применен метод им-муноблот. С этой целью были использованы наборы ImmuBlot™ Anti-PO Antibody Western Blot.
В данном методе анализа аутоантител к ми-елиновому белку (РО) в качестве антигена использован очищенный РО белок из нервной ткани крупного рогатого скота. Этот белок наносили на нитроцеллюлозные полоски (стрипы). В случаях, когда в исследуемой сыворотке имелись аутоантитела к РО белку, происходило специфическое взаимодействие аутоантител с РО белком на стрипе и результат этого взаимодействия визуализировался в виде горизонтальной полоски, соответствующей положению маркера - 30 kD (anti-PO). Кроме этого, для контроля качества анализа на стрип был нанесен маркер другой молекулярной массы - 116 kD MW marker. Каждый анализ сопровождался постановкой соответствующего позитивного и негативного контролей. По интенсивности окраски полосок определяли относительный уровень аутоантител к РО в сыворотке крови. Положительный результат был представлен в виде + + + , + + и + в зависимости от интенсивности окраски полосок.
Статистическая обработка полученных результатов проведена с использованием про-
грамм Microsoft Excel и Stat Soft Statistica 6.1. Относительная доля изучаемых показателей представлена в процентах. Достоверность разницы частот изучаемого признака определяли с использованием Z-критерия после фи-преобразования Фишера с поправкой Йейтса. Достоверность отличий определяли по значению р. Критическим принят уровень статистической значимости р < 0,05.
Результаты и обсуждение. Прежде всего необходимо отметить, что в наших исследованиях были изучены частота и состояние (гетерозиготы или гомозиготы) наиболее актуальных мутаций в гене коннексина 26 (GJB2) в выборках больных с различными формами СНТ методами минисек-венирования и MALDI TOF масс-спектрометрии. По этой причине полученные результаты нельзя считать результатами, относящимися к категории генетических популяционных исследований. Важным элементом работы было определение зависимости генетических и аутоиммунных показателей от степени тугоухости.
Результаты изучения частоты мутаций 35delG, 167delT, 235delC в гене GJB2 при наследственных фрмах СНТ в зависимости от степени тугоухости представлены в табл. 1. Видно, что при наследственной несиндромальной СНТ при II и III степенях тугоухости частота мутации 35delG одинаковая - 3,7%, а при IV степени тугоухости эта частота возрастает до 7,5%. Мутации 167delT и 235delC встречаются в этой группе больных только при IV степени тугоухости (в 5,6 и 3,7% случаев соответственно). При наследственной прогрессирующей несиндромальной СНТ наибольшая частота мутаций в гене GJB2 приходится на делецию 35delG. Примечательно, что при II степени тугоухости эта мутация встречается в три раза чаще по сравнению с группой больных с III степенью тугоухости - 16 и 4% соответственно. Мутация 167delT встречалась при III степени тугоухости - в 4% случаев, а мутация 235delC не встречалась вообще. Таким образом, наиболее частой является мутация 35delG, увеличение степени тугоухости при наследственных формах СНТ в целом сопровождается увеличением частоты изученных мутаций, а прогрессирование туго-
Т а б л и ц а 1
Частота мутаций 35delG, 167delr, 235deKI в гене GJB2 в зависимости от степени тугоухости, %
Мутация Наследственная несиндромальная СНТ, n = 42 Наследственная несиндромальная прогрессирующая СНТ, n = 14
II степень III степень IV степень II степень III степень
35delG 3,7 3,7 7,5 16 4
167delT - - 5,6 - 4
235delC - - 3,7 - -
Т а б л и ц а 2
Состояние мутаций 35delG, 167derr, 235deKI в гене GJB2 при наследственных формах СНТ, %
Мутация Наследственная несиндромальная СНТ, n = 42 Наследственная несиндромальная прогрессирующая СНТ, n = 14
35delG 167dett 235delC 35delG 167de!r 235de£
Гомозиготы - - - 4 - -
Гетерозиготы 11,3 5,6 3,7 22* 4 -
Мутации не обнаружены * р < 0,05 при сравнении гом с поправкой Йейтса. 88,7 озигот с гетер 94,4 озиготами по м 96,3 утации 35delG, 74 Z-критерий пос 96 ле фи-преобраз звания Фишера
ухости не сопровождается достоверными изменениями частоты патологических мутаций в гене коннексина 26.
Как отмечалось выше, минисеквенирование позволяет установить состояние патологического гена по конкретной мутации, а именно: гомозиготное или гетерозиготное. Известно, что при аутосомно-рецессивном типе наследования при СНТ тугоухость может наступить только в том случае, когда патологический ген находится в гомозиготном состоянии. В случаях аутосомно-доминантного наследования признаки заболевания проявляются и у гетерозигот. Результаты таких исследований в нашей выборке больных представлены в табл. 2. В таблице представлен процент случаев в каждой из групп больных, когда была выявлена соответствующая мутация в гомозиготном либо в гетерозиготном состоянии. Видно, что гомозиготные носители встретились в единственном случае - в группе с наследственной прогрессирующей несиндромальной СНТ по де-леции 35delG в 4% случаев. Все остальные случаи относились к гетерозиготному носительству. При наследственной несиндромальной СНТ мутации 35delG, 167delT, 235delC идентифицировалась в гетерозиготном состоянии, соответственно в 11,3, 5,6 и 3,7% случаев. При наследственной прогрессирующей несиндромальной СНТ в гетерозиготном состоянии были идентифицированы только две делеции в гене GJB2 - 35delG и 167delT, соответственно в 22 и 4% случаев. По мутации 35delG разница в частотах у гомозигот и гетерозигот была достоверной по Z-критерию
(р < 0,05). Очевидно превалирование гетерозиготного носительства патологических мутаций.
В группах больных, у которых по данным анамнеза, клинической картине, характеру родословных и заключению врача-генетика имелись наследственные формы СНТ, также был изучен тип наследования патологического гена. При этом учитывалось, что аутосомно-доми-нантный тип наследуется «по вертикали» - наличие больных в каждом поколении родословной. Вероятность рождения ребенка с тугоухостью при заболевании одного из родителей составляет 50%. Имеется одинаковая частота патологии у лиц мужского и женского пола, и, кроме этого, непораженные члены семьи, как правило, имеют здоровых потомков.
При аутосомно-рецессивном типе наследования проявление заболевания в родословной «по горизонтали» часто у сибсов. Родители являются носителями мутантного гена и могут быть клинически здоровыми гетерозиготами. Гомозиготное состояние и соответственно клинические признаки СНТ могут быть переданы только 25% потомства. Также учитывалось еще одно важное обстоятельство, а именно: при данном типе передачи патологического гена даже оба глухих родителя могут иметь здоровых детей, а также то, что при аутосомно-рецессивном типе наследования проявление патологии более вероятно при кровно-родственных браках, нередких в Республике Дагестан. Эти данные отражены в родословных, составленных врачом-генетиком и находящихся в консультативных картах, учетной генетической
Т а б л и ц а 3
Частота мутаций 35delG, 167delТ, 235delС в гене GJB2 при различных типах наследования, %
Тип мутации Наследственная несиндромальная СНТ, n = 42 Наследственная несиндромальная прогрессирующая СНТ, n = 14
35delG 167dett 235de£ 35delG 167de!r 235de£
Аутосомно-доминантный - - - 6 - -
Аутосомно-рецессивный * р < 0,05 по Z-критерию пос. 11,3 ле фи-преобра 5,6 зования Фишер 3,7 а с поправкой Й 20* ейтса. 4 -
Т а б л и ц а 4
Уровень аутоантител к миелиновому белку (РО) при наследственной несиндромальной СНТ
и прогрессирующей СНТ, %
Аутоантитела к миелиновому белку (РО) Наследственная несиндромальная СНТ, n = 42 Прогрессирующая СНТ, n = 23
III степень, n = 20 IV степень, n = 33 II степень, n = 12 III степень, n = 11
+ + + 10 - - -
+ + 8 13 16,6 -
+ - 8 25 36,3
- 82 79 58,4 63,7
карте и индивидуальной карте обследованных пациентов.
С использованием указанного клинико-ге-неалогического метода были определены типы наследования каждой из мутаций в гене GJB2. Результаты представлены в табл. 3.
Видно, что в двух исследованных группах с наследственными формами СНТ превалирует аутосомно-рецессивный тип наследования мутаций 35delG, 167delT, 235delC в гене GJB2. При наследственной несиндромальной СНТ - в 11,3; 5,6 и 3,7% случаев соответственно. Во второй группе мутации 35delG, 167delT определялись в 20 и 4% случаев соответственно. И только в 6% случаев -делеции 35delG в группе больных с наследственной прогрессирующей несиндромальной СНТ был определен аутосомно-доминантный тип наследования. Причем частота делеции 35delG в последней группе больных достоверно различалась при сравнении аутосомно-доминантного и ауто-сомно-рецессивного типов наследования этой мутации (р < 0,05).
Таким образом, можно заключить, что, во-первых, при всех изученных нами наследственных формах СНТ основная доля мутационных изменений приходилась на делецию 35delG в гене GJB2 и, во-вторых, в большинстве случаев эта делеция находилась в гетерозиготном состоянии и наследовалась преимущественно по аутосомно-рецессивному типу.
С учетом данных, свидетельствующих о существенном значении аутоиммунного компонента в патогенезе СНТ, крайне важным представлялось изучение уровня продукции аутоантител к миелиновому (РО) белку и связи этой продукции с про-грессированием тугоухости при наследственных формах СНТ. В табл. 4 представлены данные по процентному распределению полуколичественного уровня аутоантител (интенсивность окраски позитивных стрипов при проведении иммунобло-та) при наследственной несиндромальной СНТ и прогрессирующей СНТ.
Видно, что большинство случаев при наследственной несиндромальной СНТ при III степени
тугоухости попадало на уровень в три креста -10% случаев - и только 8% случаев имели уровень аутоантител в два креста. При IV степени тугоухости уровень в три креста не встречался вообще, в два креста - в 13% случаев, в один крест - в 8% случаев. При прогрессирующей тугоухости картина иная. При II степени тугоухости уровень в два креста встречался в 16,6% случаев, а в один крест - в 25% случаев. При III степени все случаи (36,6%) имели интенсивность окраски только в один крест. Иными словами, во-первых, прогрессия тугоухости сопровождается большим уровнем аутоантител к миелиновому (РО) белку. Однако этот уровень по полуколичественному показателю незначителен (большинство случаев имели только один крест). Во-вторых, при наследственных формах СНТ, несмотря на более низкое количество позитивных случаев, полуколичественный уровень аутоантител был более высоким, особенно при III степени тугоухости.
Было интересно проанализировать связь продукции аутоантител к миелиновому (РО) белку с наличием мутаций в гене GJB2 при наследственных формах СНТ. Однако такой связи проследить не удалось, за исключением одного случая, когда при прогрессирующей несиндромальной СНТ при наличии аутоантител в два креста (++) была зарегистрирована мутация 35delG в гетерозиготном состоянии.
Заключение. Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что при наследственных формах СНТ превалирующей является мутация 35delG в гетерозиготном состоянии, встречающаяся до 16% случаев в изученной нами выборке больных из дагестанской популяции. В большинстве случаев тип наследования патологических мутаций -аутосомно-рецессивный. Изучение связи продукции аутоантител при СНТ с генетическими характеристиками показало, что при наследственных формах СНТ аутоиммунный компонент присутствует, хотя и незначительно, а про-грессирование тугоухости, в том числе и при наследственных формах СНТ, сопровождается
увеличением уровня аутоантител к миелиново-му (РО) белку. Констатация последнего факта определяет участие аутоиммунитета в патогене-
зе СНТ и обоснованность рекомендаций по применению курсов кортикостероидной терапии в комплексном лечении этих больных [7].
ЛИТЕРАТУРА
1. Анализ генов 12SrRNA и tRNASer(UCN) мтДНК у больных несиндромальной сенсоневральной тугоухостью/ глухотой наследственной этиологии из различных регионов России / Л. У. Джемилева [и др.] // Генетика. -2009. - № 7. - С. 982-991.
2. Гены белков-коннексинов, принимающих участие в процессе звуковосприятия / Л. У. Джемилева [и др.] // Вестн. оторинолар. - 2006. - № 4. - С. 15-20.
3. Глазников Л. А., Пониделко С. Н., Говорун М. И. Роль генетических мутаций у больных с приобретенными формами сенсоневральной тугоухости // Вестн. оторинолар. - 2012. - № 4. - С. 37-39.
4. Маркова Т. Г. Организация медико-генетического консультирования в отношении наследственных нарушений слуха // Вестн. оторинолар. - 2009. - № 1. - С. 34-36.
5. Результаты аудиологического обследования детей первого года жизни с сенсоневральной тугоухостью, обусловленной мутациями в гене GJB2/ М. Р. Лалаянц [и др. ] // Вестн. оторинолар. - 2011. - № 3. - С. 31-35.
6. Anti-68 kDa antibodies in autoimmune sensorineural hearing loss: are these autoantibodies really a diagnostic tool? / C. Bonagur [et al.] // Autoimmunity. - 2007 - Vol. 40, N 1. - P. 73-78.
7. Antibodies to myelin protein zero (P0) protein as markers of auto-immune inner ear diseases / B. N. Pham [et al.] // Autoimmunity. - 2007. - Vol. 40, N 3. - P. 202-207.
8. Autoimmune sensorineural hearing loss in young patients: an exploratory study / J. P. Tomasi [et al.] // Laryngoscope. - 2001. - Vol. 111, N 11. - P. 2050-2053.
9. Buniel M. C., Geelan-Hansen K., Weber P. C. Immunosuppressive therapy for autoimmune inner ear disease l // Immunotherapy. - 2009. - N 1 (3). - P. 425-434.
10. Lucotte G., Dieterlen F. The 35delG mutation in the connexin 26 gene (GJB2) associated with congenital deafness: European carrier frequencies and evidence for its origin in ancient Greece // Genet. Test. - 2005. - Vol. 9, N 1. -P. 20-25.
11. P0 antigen detection in sudden hearing loss and Meniere's disease: a new diagnostic marker? / D. Passali [et al.] // Acta Otolaryngol. - 2004. - Vol. 124, N 10. - P. 1145-1148.
12. Ruckenstein M. J. Autoimmune inner ear disease // Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. - 2004. - Vol. 12, N 5. - P. 426-430.
13. Solares C. A., Hughes G. B., Tuohy V. K. Autoimmune sensorineural hearing loss: an immunologic perspective // Neuroimmunol. - 2003. - Vol. 138, N 1-2. - P. 1-7.
14. Yehudai D, Shoenfeld Y, Toubi E. The autoimmune characteristics of progressive or sudden sensorineural hearing loss // Autoimmunity. - 2006. - Vol. 39, N 2. - P. 153-158.
Саидов Марат Зиявдинович - докт. мед. наук, профессор, зав. каф. патологической физиологии Дагестанской
государственной медицинской академии. Россия, Республика Дагестан, 367000, г. Махачкала, пл. Ленина, д. 1;
тел.: 8-988-300-90-45, е-mail: marat2002@pochta.ru
