CC BY
10естник АПК
Ставрополья
УДК 616.379-008.64-003.93(07)
Дилекова О. В.
Dilekova O. V.
C-KIT/SCF-R ЭНДОКРИНОЦИТОВ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
C-KIT/SCF-R ENDOCRINOCYTES PANCREAS OF CATTLE
При иммуногистохимическом исследовании поджелудочной железы 1-суточных телят мы выявили, что экспрессия трансмембранного рецептора белка тирозинкиназы С-№/ SCF-R в эндокринных островках является маркером ком-митированых клеток-предшественников р-эндокриноцитов. Кроме островков в железе были обнаружены клеточные кластеры, которые имеют инсулин и С-№ позитивное окрашивание. Исходя из этого, экспрессию С-№ можно рассматривать как критерий процессов развития, роста и диффе-ренцировки клеток предшественников в указанный момент времени, так как данный маркер необходим для миграции клеток и формирования островков.
При анализе морфометрических показателей нами было установлено, что площадь С-М позитивных клеток в кластерах больше островковых на 69 % при сохранении ЯЦО в обеих структурах 0,3 мкм. Сравнивая данные с инсулин позитивными клетками, мы выявили, что в кластерах по сравнению с островковыми клетками увеличение площади происходит на 94,8 %, при этом ЯЦО в кластерах составляет 0,4 мкм и 0,2 мкм в островках. Площадь инсулин позитивных клеток в островках по сравнению с площадью с С-№ позитивными клетками увеличена на 55,8 %, а в кластерах на 76,8 %. Повышенный показатель площади и ЯЦО в клетках кластеров, мы связываем с фазой гиперактивности ядер в результате функционального сдвига связанного с процессами активации и синтеза белков. Это приводит к быстрому включению аминокислот, увеличению гидратации цитоплазмы, увеличению цитоплазматических белков. Вместе с этим происходит и увеличение объема ядра, что необходимо клеткам для процессов синтеза, пролиферации, миграции и дифференцировки.
Таким образом, в результате исследования С-№ позитивных клеток, мы установили их дифференцировку и функциональное значение для поджелудочной железы, что может быть использовано в дальнейшем для изучения региональных стволовых клеток р-эндокриноцитов, их выделения и культивирования.
Ключевые слова: телята, поджелудочная железа, иммуногистохимическое исследование, С-кИ: позитивные клетки, инсулин позитивные клетки, дифференцировка, функциональное значение.
Immunohistochemical investigation of the pancreas one day old calves we found that expression of the transmembrane receptor protein tyrosine kinase C-kit / SCF-R in the islets endocrine lineage commitment of the cells is a marker for progenitor p-endocrine cells. Besides cell clusters were discovered which have insulin and C-kit positive staining. Accordingly, the C-kit expression can be regarded as a criterion for process development, growth and differentiation of progenitor cells to the specified point of time as is needed for this marker cell migration and formation of islands.
In the analysis of morphometric parameters we have found that the area of C-kit positive cells in the islet clusters larger by 69 % while maintaining both structures ratio of nucleus of the in cytoplasm 0,3 microns. Comparing the data with insulin positive cells, we found that clusters compared with islet cells increase in area occurs at 94,8 % while ratio of nucleus of the in cytoplasm clusters is 0,4 microns and 0,2 microns in the islets. Area insulin positive cells in the islets compared with the area with the C-kit positive cells was increased by 55,8 % and 76,8 % clusters. The increased area ratio and ratio of nucleus of the in cytoplasm cells clusters we associate with the phase hyperactivity nuclei resulting functional changes associated with the process of activation and protein synthesis. This leads to rapid incorporation of amino acids, increase the hydration of the cytoplasm, increased cytoplasmic proteins. Along with this, there is an increase in the nucleus and that the processes necessary for cell fusion, the proliferation, migration and differentiation.
Keywords: calves, pancreas, immunohistochemistry, C-kit positive cells, insulin positive cells, differentiation, functional significance.
Дилекова Ольга Владимировна -
кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры паразитологии и ветсанэкспертизы, анатомии и патанатомии им. проф. С.Н. Никольского, Ставропольский ГАУ г. Ставрополь Тел. 8-918-877-94-03 E-mail: Dilekova2009@yandex.ru
Dilekova Olga Vladimirovna -
candidate of biological Sciences, senior lecturer department of parasitology and animal halth examination, anatomy and pathological anatomy named after Professor S.N. Nikolsky Stavropol Stare Agrarian University Stavropol Tel. 89188779403 E-mail: Dilekova2009@yandex.ru
В последние десятилетия предпринимаются попытки существенным образом пересмотреть представления о стволовых клетках в организме млекопита-
ющих. Появилось большое число публикаций, в которых авторы сообщают об их обнаружении в различных тканях и органах. Одними из факторов, активизирующих по-
30
,,„ „„„„, Jj Ставрополья
научно-практическии журнал
пытки поисков стволовых клеток во всех дефинитивных структурах организма, явились полученные в середине XX столетия доказательства генетической идентичности всех соматических клеток конкретного многоклеточного организма [2, с. 44], [6, c. 26], [10, c. 507], [11, p. 1995].
В настоящее время в основе идентификации стволовых клеток взрослого организма лежит оценка их морфологии и поверхностных маркеров. Одним из наиболее перспективных маркеров стволовых клеток является C-kit (CD117), который является рецептором к фактору стволовых клеток Stem Cells Factor - SCF, что характеризует его как рецептор маркирующий «взрослые» стволовые клетки. C-kit - это трансмембранный рецептор белка тирозина, который кодируется доминантной аллелью white-spotting или ген W [3, с. 32].
При фосфориляции тирозина тирозинкиназой обеспечивается связывание трансмемранного рецептора C-kit с лигандом SCF что приводит к важным этапам межклеточного взаимодействия приводящих к регуляции большинства биологических процессов в клетке, таких, как пролиферация, дифференцировка, адгезия клеток и миграция, а также осуществляет антиапоптические события в прогениторных клетках [5, с. 289].
В научных публикациях встречаются данные об обнаружении C-kit-позитивных клеток у человека в сердце, желудке и кишечнике, мочеточниках, а также единичные сведения их идентификации в почках и поджелудочной железе. В основном исследования проводятся у человека и лабораторных животных в период пре-натального онтогенеза [7, с. 84], [8, с. 110], [14, p. 7]. Данные о выявлении C-kit-позитивных клеток у домашних и продуктивных животных в настоящее время отсутствуют и, одним из подходов, позволяющих установить их, является изучение экспрессии этого маркера в клетках.
Целью данного исследования было изучение популяции C-kit-позитивных клеток, их диффе-ренцировка и функциональное значение для поджелудочной железы.
Материал и методы. Объектом исследований была поджелудочная железа 1-суточных клинически здоровых телят крупного рогатого скота айширской породы (n=3). Убой животных проводился в соответствии с Директивой 2010/63/EU ЕВРОПЕЙСКОГО ПАРЛАМЕНТА И СОВЕТА ЕВРОПЕЙСКОГО СОЮЗА по охране животных, используемых в научных целях.
У каждого животного проводили отбор целой поджелудочной железы, которую фиксировали в 10 % нейтральном забуференном формалине. В области тела железы вырезали кусочки размером 1см3, Материал проводили через спирты возрастающей концентрации и ксилол, а затем заливали в гистологическую среду «Гистомикс» с использованием гистологического процессора замкнутого типа Tissue-Tek VIP™ 5 Jr и станции парафиновой заливки Tissue-Tek® TEC™ 5 фирмы Sakura (Япония). Из полученных блоков делали гистологические срезы толщиной 5-7 мкм.
Для иммуногистохимических реакций использовали моноклональные антитела к SCF-R (C-kit) (Diagnostic BioSystems, Нидерланды 1:25 - 1:50) и моноклональные мышиные антитела к инсулину клон К36аС10 (Diagnostic BioSystems, Нидерланды 1:25-1:50). Негативным контролем служили реакции с заменой первых антител раствором для разведения (SpringBio-Science, США).
При проведении иммуногистохимических реакций депарафинированные и гидратиро-ванные срезы обрабатывали 3 % раствором Н2О2 в течении 10 мин для блокирования эндогенной пероксидазы. Затем срезы подвергали высокотемпературной обработке в 0,01 М ци-тратном буфере (рН 6,0) в течении 40 мин. Инкубация срезов с первичными антителами на C-kit b инсулин, проводили во влажной камере при температуре 27 °С в течении 24 часов. Со вторыми козьими антителами инкубацию проводили в течении 60 минут во влажной камере при температуре 27 °С [1, с. 68]. После инкубации применяли высокочувствительную систему визуализации Reveal biotin-free polyvalent DAB (SpringBioScience, США). Микроскопию срезов проводили на цифровом микроскопе со встроенным фотоаппаратом Olympus BX45.
С каждого препарата поджелудочной железы окрашенного позитивно на C-kit и инсулин, выполняли по 10 цифровых снимков (в формате jpg, размером 3136*2352 пикселей в палитре 24 бит) случайно выбранных полей зрения при увеличении х100, х200, х400 и х1000.
Морфометрические исследования проводили с использованием программы Видео-Тест Морфология 5.1 для Windows. Исследовали площадь эндокринного островка (10 измерений в каждом снимке), клеточных кластеров (1 измерение в каждом снимке), площадь клеток и ядер (10 измерений в каждом снимке). Рассчитывали ядерно-цитоплазматическое отношение в клетках по формуле - ЯЦО = Sя/Sц, где: Sя - площадь ядра клетки; Sц - площадь цитоплазмы.
Полученные цифровые данные были анализированы с применением статистического метода однофакторного дисперсионного анализа в программе Primer of Biostatistics 4.03 для Windows. Достоверными считали различия при р<0,05.
Результаты исследований. У 1-суточных телят при увеличении *200 в дольке железы просматриваются от 5 до 13 эндокринных островков. Среди них выявлены островки малых размеров, площадь которых составляет 1439,7±881,4 мкм, средних размеров 5307,6±945,8 мкм, и крупные островки, площадь которых достигает 14590,2±746,9 мкм. Округлость островков в среднем составила 0,47±0,03 отн.ед.
Повсеместно во всех исследованных гистологических срезах поджелудочной железы были выявлены следующие особенности. В железе визуализировались крупные кластеры клеток, отдельные из которых, достигали размеров сопоставимых с долькой железы. Отмечается, что они врастают в экзокринную часть железы. Средняя площадь клеточных кластеров составляет
1
2
Рисунок 1 - С-кК позитивные клетки в эндокринных островках. Ув. 1-х400, 2-х1000
301986,8±1622,5 мкм, округлость 0,42±0,02 отн. ед. Между клетками просматривается обильная васкуляризация за счет капилляров.
При анализе результатов реакций с антителами к С-кй у 1- суточных телят в островках были обнаружены позитивные клетки изучаемого маркера. Интенсивность окрашивания клеток была умеренно выражена, наблюдалось равномерное распределение иммунореактивности по всей клеточной мембране, в местах локализации рецептора белка тирозина.
С-кй-позитивные клетки визуализировались по одиночке на периферии островков. В островках небольших размеров количество С-кй позитивных клеток насчитывалось от 5 до 7. В средних и крупных островках, наблюдалось уравновешивание в количественном составе от 7 до 10 клеток. Площадь изучаемых С-кй позитивных клеток составила 111,6±28 мкм, ЯЦО 0,3±0,07 мкм, округлость 0,71±0,02 отн.ед. Экспрессия С-кй маркера также была выраже-
Рисунок 2 - С-Ш позитивные клетки в кластерах.
Иммуногистохимическая реакция на С-кК.
Ув. 1-х400, 2-х1000
на в клеточных кластерах, причем клетки, как и в островках, визуализировались только на периферии кластеров. Количество С-кИ: позитивных клеток в данных структурах составило от 10 до 20. Площадь их была увеличена на 69 %, по сравнению с островковыми клетками, и составила 161,8±55,5 мкм, ЯЦО 0,3±0,06 мкм, округлость 0,58±0,03 отн.ед.
При сравнительном анализе серийных срезов, на которых были проведены реакции с антителами к С-кй и инсулину, было выявлено, что С-кИ: и инсулин позитивные клетки в островках имеют одинаковую локализацию и сходное строение. Одновременно мы отметили, что в клеточных кластерах при реакции на инсулин так же была выявлена его высокая экспрессия, и обнаружено присутствие С-кй позитивных клеток на периферии кластеров, имеющих одинаковое строение и локализацию с инсулин позитивными клетками.
Однако при морфометрических исследованиях инсулин позитивные клетки имеют зна-
Рисунок 3 - Инсулин позитивные клетки в эндокринных островках. Ув. 3-х400, 4-х1000
Рисунок 4 - Инсулин позитивные клетки в кластерах. Иммуногистохимическая реакция на инсулин. Ув. 3-х400, 4-х1000
32
,,„ „„„„, Jj Ставрополья
научно-практическии журнал
чительные различия по количественным и качественным показателям по сравнению с C-kit позитивными клетками. Так было отмечено, что площадь инсулин позитивных клеток в островках по сравнению с площадью с C-kit позитивными клетками увеличена на 55,8 %, а в кластерах на 76,8 %. Интенсивность окрашивания инсулин позитивных клеток сильно выражена, экспрессия маркера равномерная цитоплазматическая.
Количество инсулин позитивных клеток в небольших островках составляет от 4 до 10, в средних от 12 до 16 и крупных островках от 17 до 22. Площадь клеток равна 200±53,8 мкм, ЯЦО 0,2±0,06 мкм, округлость 0,42±0,02 отн. ед. В кластерах количество инсулин позитивных клеток от 26 до 300. Площадь клеток составляет 210,8±47 мкм, что на 94,8 % больше площади островковых инсулин позитивных клеток, ЯЦО 0,4±0,07 мкм, округлость 0,48±0,02 отн.ед.
Обсуждение полученных данных. На основании полученных результатов исследования мы предполагаем, что экспрессия C-kit/ SCF-R в эндокринных островках поджелудочной железы 1-суточных телят является маркером коммитированых клеток-предшественников ß-эндокриноцитов. Последние данные, полученные Калигиным М.С (2011), Li J. (2007), а также Gong J. (2012) в исследованиях поджелудочной железы крыс и плодов человека, также пришли к выводу, что трансмембранный рецептор белка тирозинкиназы - C-kit является предшественником ß-эндокриноцитов.
В плодном периоде у человека Polak M. (2000), Piper K. (2004) и Jeon J. (2009) установили, что в экзокринной части железы присутствуют клеточные кластеры без определенной формы. Они состоят из одного типа эндокрино-цитов - инсулинпродуцирующих, которые к моменту рождения плода трансформируются в эндокринные островки.
Наши исследования, указывают на наличие у 1-суточных телят вышеописанных клеточных кластеров, которые имеют инсулин и C-kit позитивное окрашивание. Исходя из этого, экспрессию C-kit можно рассматривать как критерий процессов развития, роста и дифференцировки клеток предшественников в указанный момент време-
ни, так как данный маркер необходим для миграции клеток и формирования островков. Калигин М. С. (2011) описывают данный процесс, появлением на определенном этапе развития поджелудочной железы у плода человека О-кИ: маркера на плазмалемме клеток, который начинает взаимодействовать со своим лигандом - ЭОР Взаимодействие ЭОР/О-кИ активирует внутриклеточные протеины, рост и дифференцировку путем увеличения РйХ-1, который вызывает активацию генов инсулина. В результате в клетках начинают синтезироваться гормон, сами клетки начинают образовывать островки.
При анализе морфометрических показателей нами было установлено, что площадь О-кИ позитивных клеток в кластерах больше островковых на 69 % при сохранении ЯЦО в обеих структурах 0,3 мкм. Сравнивая данные с инсулин позитивными клетками, мы выявили, что в кластерах по сравнению с островковыми клетками увеличение площади происходит на 94,8 %, при этом ЯЦО в кластерах составляет 0,4 мкм и 0,2 мкм в островках. Площадь инсулин позитивных клеток в островках по сравнению с площадью с ОкИ позитивными клетками увеличена на 55,8 %, а в кластерах на 76,8 %. Повышенный показатель площади и ЯЦО в клетках кластеров, мы связываем с фазой гиперактивности ядер в результате функционального сдвига связанного с процессами активации и синтеза белков. Это приводит к быстрому включению аминокислот, увеличению гидратации цитоплазмы, увеличению цито-плазматических белков. Вместе с этим происходит и увеличение объема ядра, что необходимо клеткам для процессов синтеза, пролиферации, миграции и дифференцировки. По данным Ташке К. (1976) и Квочко А. Н. (2002) первым результатом усиления клеточного обмена веществ является увеличение объема ядра, что согласуется с нашими исследованиями.
Таким образом, в результате исследования О-кИ позитивных клеток, мы установили их дифференцировку и функциональное значение для поджелудочной железы, что может быть использовано в дальнейшем для изучения региональных стволовых клеток р-эндокриноцитов, их выделения и культивирования.
Литература:
1. Выявление микроглии в препаратах головного мозга, длительное время хранившихся в растворе формалина / Е. Г. Сухо-рукова [и др.] // Морфология. 2012. Т. 142, № 5. С. 68-70.
2. Дыбан П. А. Новый подход к получению стволовых эмбриональных клеток при культивировании ранних зародышей мыши в диффузионных камерах // Морфология. 2004. Т. 126, № 4. С. 44.
3. Калигин М. С. О-кИ-маркер стволовых клеток эндокриноцитов поджелудочной железы человека // Морфология. 2011. Т. 140, № 4. С. 32-37.
References:
1. Identification of microglia in brain preparations for a long time kept in formalin solution / E. G. Sukhorukov [et al.] // Morphology. 2012. Vol. 142, № 5. P. 68-70.
2. Dyban P. A. A new approach to obtaining embryonic stem cells when cultured mouse early embryos in diffusion chambers // Morphology. 2004. Vol. 126, № 4. P. 44.
3. Kaligin M. S. C-kit-stem cell marker endocrine pancreas person / M.S. Kaligin [et al.] // Morphology. 2011. Vol. 140, № 4. P. 32-37.
4. Kvochko A. N. Protein-synthetic function of hepatocytes and pancreatic exocrine cells of Merino sheep in a postnatal ontogenesis //
естник АПК
Ставрополья
4. Квочко А. Н. Белково-синтетическая функция гепатоцитов и экзокринных панкреатических клеток мериносовых овец в постнатальном онтогенезе // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 2002. № 3. С. 70-72.
5. Колесник Е. А. Лечение стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта (GIST) // Онкология. 2009. Т. 11, № 4. С. 289-292.
6. Изменения в возрастной структуре стволовых кроветворных клеток старых мышей под влиянием фактора, ингибирую-щего их пролиферативную активность / И А. Орловская, Л. В. Дубинина, С. К. Хал-дояниди, В. А. Козлов // Цитология. 1994. Т. 25, № 3. С. 26-32.
7. Романова И. С., Шпыгова В. М. Внутристе-ночные артерии двенадцатиерстной кишки телят черно-пестрой породы месячного возраста // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. 2008. Т. 4, № 20-1. С. 84-85.
8. Свиридова И. К., Маршутина Н. В., Сергеева В. С. Иммунофенотип стволовых стромальных клеток костного мозга и липосак-та человека на этапах культивирования // Морфология. 2004. Т. 126, № 4. С 110-111.
9. Ташке К. Введение в количественную ци-тогистологическую морфологию. Бухарест : Академия социальной Республики Румынии, 1976. С. 191.
10. Фриденштейн А. Я. Стволовые клетки тканей с медленным обновлением клеточного состава // Цитология. 1994. Т. 36, № 6. С. 507.
11. Charlotte E., Edling B.H. c-Kit - A hematopoietic cell essential receptor tyrosine kinase // J. Biochemistry & Cell Biology. 2007. Vol. 39, № 11. P. 1995-1998.
12. Islet-derived stem cells from adult rats participate in the repair of islet damage / J. Gong, G. Zhang, F Tian, Y. Wang // J. Mol. Hist. 2012. Vol. 43, № 6. P. 745-750.
13. Endocrine cell clustering during human pancreas development / J. Jeon, M. Correa-Medina, C. Ricordi, H. Edlund, J. A. E Diez // J. Histochem Cytochem. 2009. Vol. 57, № 9. P. 811-824.
14. Korochkin L. I., Revishchin A. V., Okhotin V. E. Neural stem cells and their significance in regeneration processes in the nervous system // Morphology. 2005. Vol. 127, № 3. P.7-16.
15. Li J, Quirt J., Do H. Q. Expression of c-Kit receptor tyrosine kinase and effect on beta-cell development in the human fetal pancreas // J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2007. Vol. 293. P. 475-483.
16. Beta cell differentiation during early human Pancreas development / K. Piper, S. Brick-wood, L. W. Turnpenny, I. T. Cameron, G. BallS., D. I. Wilson, N. A. Hanley // J. Endocrinol. 2004. Vol. 181, № 1. P. 11-23.
17. Early Pattern of differentiation in the human pancreas / M. Polak, L. Bouchareb-Banaei, R. Scharfinann, P. Czernichow // Diabetes. 2000. Vol. 49, № 2. P. 225-232.
Bulletin of the Russian Academy of Agricultural Sciences. 2002. № 3. P. 70-72.
5. Kolesnik E. A. Treatment stromal tumors of the gastrointestinal tract (GIST) // Oncology. 2009. Vol. 11, № 4. P. 289-292.
6. Changes in the age structure of the hematopoietic stem cells of old mice under the influence of factors inhibiting their proliferation activity / I. A. Orlovskaya, L. V. Dubinin, S. K. Haldoyanidi, V. A. Kozlov // Cytology. 1994. Vol. 25, № 3. P. 26-32.
7. Romanova I. S., Shpygova V. M. Intramural arteries duodenum calf intestine black-motley breed months of age // Proceedings of the Orenburg State Agrarian University. 2008. № 20-1. Vol. 4. P. 84-85.
8. Sviridova I. K., Marshutina N. V., Sergeev V. S. Immunophenotype stem bone marrow stromal cells and human liposakta on stages of cultivation // Morphology. 2004. Vol. 126, № 4. P. 110-111.
9. Tashko K. Introduction to quantitative cito-gistologicheskuy morphology. Bucharest : Academy of Social Republic of Romania, 1976. 191 p.
10. Friedenstein A. J. Stem cells of tissues with slow update cellular composition // Cytology. 1994. Vol. 36, № 6. P. 507.
11. Charlotte E., Edling B. H. c-Kit - A hematopoietic cell essential receptor tyrosine kinase // J. Biochemistry & Cell Biology. 2007. Vol. 39, № 11. P. 1995-1998.
12. Islet-derived stem cells from adult rats participate in the repair of islet damage / J. Gong, G. Zhang, F Tian, Y. Wang // J. Mol. Hist. 2012. Vol. 43, № 6. P. 745-750.
13. Endocrine cell clustering during human pancreas development / J. Jeon, M. Correa-Medina, C. Ricordi, H. Edlund, J. A. Diez // J. Histochem Cytochem. 2009. Vol. 57, № 9. P. 811-824.
14. Korochkin L. I., Revishchin A. V., Okhotin V. E. Neural stem cells and their significance in regeneration processes in the nervous system // Morphology. 2005. Vol. 127, № 3. P. 7-16.
15. Li J, Quirt J., Do H.Q. Expression of c-Kit receptor tyrosine kinase and effect on beta-cell development in the human fetal pancreas // J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2007. Vol. 293. P. 475-483.
16. Beta cell differentiation during early human Pancreas development / K. Piper, S. Brick-wood, L. W. Turnpenny, I. T. Cameron, G. BallS., D. I. Wilson, N. A. Hanley // J. Endocrinol. 2004. Vol. 181, № 1. P. 11-23.
17. Early Pattern of differentiation in the human pancreas / M. Polak, L. Bouchareb-Banaei, R. Scharfinann, P. Czernichow // Diabetes. 2000. Vol. 49, № 2. P. 225-232.
