CC BY
15
https://doi.org/10.1 7116/molgen201 93701135
Быстрорастущий штамм вируса гепатита А MB-7/293 (ГЕПА-293), адаптированный к культуре клеток HEK293: вируспродуктивные свойства и анализ геномной РНК
Т.Ю. БОНДАРЕНКО1, В.А. ТЕРНОВОЙ1, В.А. СВЯТЧЕНКО1, Н.Н. КИСЕЛЕВ1, А.Н. ШВАЛОВ1, А.Г. КУСЛИЙ2, С.В. НЕТЕСОВ3
1ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Роспотребнадзора, р.п. Кольцово, Новосибирская область, Россия, 630559; 2ЗАО «ВекторБиАльгам», р.п. Кольцово, Новосибирская область, Россия, 630559; -'Новосибирский государственный университет, Новосибирск, Россия, 630090
Вирус гепатита А (ВГА) по настоящее время продолжает вызывать вспышки вирусного гепатита, который остается социально значимым заболеванием, несмотря на существующие вакцины. При производстве вакцин используются штаммы ВГА, требующие длительной инкубации инфицированных клеточных культур, до 4 нед. Известно несколько быстрорастущих на культурах клеток штаммов ВГА, до 7—10 сут. В данной работе приведены результаты вирусологической характеризации и анализа генома штамма ВГА MB-7/293 (ГепА-293), производного от одного из быстрорастущих штаммов MB-7/4647, полученного посредством адаптации его к культуре клеток HEK293 (клетки почки эмбриона человека). Показано, что штамм MB-7/293 при культивировании на культуре клеток HEK293 значительно превосходит родительский штамм MB-7/4647 по продуктивности, т.е. количеству инфекционного вируса и вирусспецифического антигена. Анализ нуклеотидной последовательности полноразмерной геномной РНК штамма MB-7/293 показал, что она отличается от последовательности генома MB-7/4647 3 нуклеотидными заменами в 5'-нетранслируемой области и 20 нуклеотидными заменами в кодирующей области, которые приводят к заменам 10 аминокислотных остатков в белках VP3, VP1, 2В и 2С. Сравнительный анализ геномных последовательностей штаммов МБ-7/293, МБ-7/4647 и других штаммов ВГА, включая ранее описанные быстрорастущие штаммы, позволил выявить мутации, оказывающие влияние на репродуктивные свойства вируса.
Ключевые слова: быстрорастущий штамм, вирус гепатита А, культура клеток HEK293, нуклеотидные замены, полный геном.
The fast-growing strain of hepatitis A virus MB-7/293 (HepA-293) adapted to cell culture HEK293: properties of virus production and analysis of a genomic RNA
T.Yu. BONDARENKO1, V.A. TERNOVOI1, V.A. SVYATCHENKO1, N.N. KISELEV1, A.N. SHVALOV1, E.V. KUSLIY2, S.V. NETESOV3
1FBUN State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector», Rospotrebnadzor, Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia, 630559; 2«VectorBiAlgam», Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia, 630559; 3Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia, 630090
Hepatitis A virus (HAV) continues to cause outbreaks of viral hepatitis which still remains a socially significant disease despite existing vaccines. The strains of HAV generally used for vaccine production require a long-term incubation of infected cell cultures, up to 4 weeks. There are several HAV strains that grow fast on cell cultures, 7—10 days. This paper presents the results of virological characterization and genome analysis of HAV strain MB-7/293 (HepA-293) derived from fast-growing HAV strain MB-7/4647 by its adaptation it to HEK293 cells (human embryonic kidney cells). It has been shown that the strain MB-7/293 when cultured in HEK293 cells significantly exceeds the parent strain MB-7/4647 in terms of productivity, i.e. the yield of infectious virus and the virus-specific antigen. The analysis of nucleotide sequence full-length genomic RNA of the strain MB-7/293 showed that it differed from that of the strain MB-7/4647 by three nucleotide substitutions in the 5'-untranslated region and twenty nucleotide substitutions in the coding region. It led to ten amino acid substitutions in the VP3, VP1, 2B and 2C proteins. Comparative analysis of MB-7/4647 and MB-7/293 genomes and genomes of other HAV strains, including known fast-growing strains, revealed mutations affecting reproductive properties of the virus.
Keywords: fast-growing strain, hepatitis A virus, HEK293 cell culture, nucleotide substitutions, complete genome.
© Коллектив авторов, 201 9
Для корреспонденции: Бондаренко Татьяна Юрьевна, канд. биол. наук, научный сотрудник отдела молекулярной вирусологии фла-вивирусов и вирусных гепатитов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Роспотребнадзора; e-mail: lemtat@ngs.ru
For correspondence: Tatyana Yu. Bondarenko, Ph.D., researcher of the department of molecular virology of flavivirus and viral hepatitis, the State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector» (SRC VB «Vector»); e-mail: lemtat@ngs.ru
Вирус гепатита А (ВГА) является представителем рода Hepatovirus, семейства Picornaviridae и вызывает гепатит А у людей и некоторых приматов. Вирионы ВГА представляют собой сферические частицы 27—32 нм в диаметре. Од-ноцепочечная молекула РНК положительной полярности упакована в капсид, формируемый структурными белками VP1, VP2, VP3, VP4. Кристаллическая структура вирусной частицы ВГА была определена ранее [1]. Неструктурные белки 2А, 2В, 2С, 3А, 3Cpro и 3Dpo1 являются функциональными в процессе репликации вирусного потомства.
К настоящему времени расшифровано 111 полных и около 7000 частичных геномов ВГА, которые были изолированы при вспышках гепатита А, а также получены в процессе адаптации вируса к репликации в клеточных культурах. Самые ранние пробы, в которых была обнаружена РНК ВГА, датируются 1957 г. [2]. На момент написания данной статьи были известны полные геномы только двух российских штаммов ВГА — МВ-7/4647 (EU251188) и представленного здесь MB-7/293 (HQ437707) [3].
Продуцентами для вакцин против гепатита А «Avaxim», «Havrix» и «Vaqta» являются штаммы ВГА, для культивирования которых используются клетки Medical Research Council 5 (диплоидные клетки легкого человека). Производимая в России вакцина Геп-А-ин-Вак основана на штамме ВГА HAS-15, культивируемом в клетках 4647 (клетки почки зеленой мартышки). Штаммы ВГА, используемые в производстве вакцин, в силу их репликативных свойств требуют длительной инкубации инфицированных клеточных культур (24—28 сут). Это существенно осложняет технологический процесс и приводит к его удорожанию. Описаны относительно быстрорастущие штаммы ВГА: FG, HM175/43C и HM175/24A, которые приобрели быстрые репликативные свойства после адаптации к культуре клеток FRhK (клетки почки эмбриона макаки-резус) [4—6]).
В 1988 г. во время вспышки гепатита А в Новосибирске (Сибирский федеральный округ, Россия) от больного был выделен изолят ВГА, который после адаптации к клеточной культуре FRhK, проявил быстрые репликативные свойства и получил название «штамм MB-7» [7]. В дальнейшем путем длительного пассирования штамма MB-7 в культуре клеток 4647 был получен штамм МВ-7/4647 (VBA-07), сохранивший способность к быстрому росту. Полная последовательность генома штамма МВ-7/4647 была определена и проанализирована в работе [3].
В представленной работе приведены результаты исследования репликативных свойств полученного методом биоселекции нового быстрорастущего штамма ВГА MB-7/293 (адаптированный к культуре клеток НЕК293 вариант штамма МВ-7/4647) и рассмотрены особенности его генома в сравнении с родительским штаммом МВ-7/4647 и другими быстрорастущими штаммами ВГА. Идентичность антигенных свойств штаммов MB-7/293 и МВ-7/4647 была подтверждена нами ранее [8]. Штамм MB-7/293 рекомендуется для использования в производстве экономически выгодных иммунопрофилактических и диагностических препаратов.
Материал и методы
Клеточные культуры и вирусы. В исследовании использовали культуры клеток 4647 (клетки почки зеленой мартышки) и HEK293 (клетки почки эмбриона человека, экспресси-рующие гены Е1А и Е1В аденовируса 5-го серотипа), полу-
ченные из банка клеточных культур ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Клетки культивировали в среде Игла ДМЕМ (GibcoBRL), содержащей 10% эмбриональной сыворотки теленка (ЭСТ) (GibcoBRL), 2 мМ L-глютамина, 80 мкг/мл гентамицина сульфата при 37 °С в культуральных пластиковых флаконах («Costar», США). Для снятия клеток с субстрата применяли 0,25% раствор трипсина и 0,02% раствор Версена в соотношении 1:1. Культивирование и определение инфекционной активности in vitro штамма МВ-7/4647 проводили согласно [3]. Адаптацию штамма МВ-7/4647 к культуре клеток НЕК293 проводили методом биоселекции как описано в [8]. Полученный в результате адаптации штамма МВ-7/4647 к культуре клеток НЕК293, штамм MB-7/293 (ГепА-293) был подвергнут двум циклам клонирования методом предельных разведений, после чего были получены препаративные количества клонированного вируса. Препарат вируссодержащей суспензии клонированного штамма MB-7/293 с инфекционным титром 109 ИД50/мл (50% инфицирующая доза/мл) и содержащий ВГА-специфический антиген в титре 1:5120 был помещен на хранение при минус 70 °С.
Сравнительное исследование кинетики накопления инфекционного вируса и вирусного антигена в клетках НЕК293 и 4647 инфицированных штаммами МВ-7/4647 и MB-7/293. Клетки НЕК293 и 4647 культивировали как монослойные культуры в культуральных флаконах 25 см2 («Orange», США). Посадочная доза клеток НЕК293 и 4647 составляла 106 клеток на флакон. При достижении культурами суб-конфлюентного состояния (70—80% от монослоя) проводили инфицирование штаммами МВ-7/4647 или MB-7/293 с множественностью 1,0 ИД50 на клетку. После адсорбции (1,5 ч при 37 °С) клетки отмывали, добавляли свежую куль-туральную среду и инкубировали при 37 °С. Клетки отбирали на 0-е сутки (инокулированные и сразу же отмытые клетки) и далее на 4, 5, 6, 7, 10, 12 и 14-е сутки после инфицирования для количественного определения содержания антигена ВГА и инфекционного вируса (клетки из каждого флакона снимали с субстрата раствором Версена, ре-суспендировали в 1 мл среды Игла ДMЕМ, трехкратно замораживали—оттаивали, клеточные лизаты осветляли центрифугированием и полученные супернатанты анализировали). Титр вирусспецифического антигена определяли иммуноферментным анализом (ИФА) с использованием тест-системы Вектогеп А-а/г-стрип (ЗАО «ВекторБи-Альгам», Новосибирск) согласно инструкции по применению. Инфекционный титр вируса штаммов MB-7/293 и МВ-7/4647 определяли микрометодом на 96-луночных культуральных планшетах («Orange scientific», США). С этой целью клетки 4647 высаживали на планшет в среде Игла ДMЕМ с 5% ЭСТ (20 тыс. кл./лунка в объеме 150 мкл на лунку) и инкубировали при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% СО2. Через сутки из лунок отбирали куль-туральную среду и проводили инфицирование клеток стандартными десятикратными разведениями тестируемых ви-руссодержащих суспензий в объеме 50 мкл на лунку (по 4 лунки на разведение). После адсорбции (1,5 ч при 37 °С) клетки отмывали, добавляли по 150 мкл среды Игла ДMЕМ с 5% ЭСТ на лунку и инкубировали в течение 10 сут. Учет результатов проводили по выявлению антигена ВГА в ли-затах клеток (после трехкратного замораживания—оттаивания), отобранных из каждой лунки планшета для титрования методом ИФА («Вектогеп А-а/г-стрип»). Значение титра вируса выражали через ИД50.
Определение и анализ геномной РНК штамма MB-7/293. Выделение вирусной РНК и синтез кДНК проводили ш-
Таблица 1. Олигонуклеотидные праймеры, использованные для амплификации и определения последовательности генома штамма 1^-7/293 (здесь и далее координаты приведены по 1^-7/4647 EU251188)
Позиция нуклеотида 5'-З'
Последовательность
61- -83 TGATACCTCACCGCCGTTTGCCT
127- -104 AAATAAGGGAAGGACAGGGAAAGG
780 -811 ACTGTTGGGAGTGGCCTTGACCACATCCTG TC
811 -780 GACAGGATGTGGTCAAGGCCACTCCCAACA GT
1023 -1002 CCAATCAGCAGAATGAATCAAG
1330 -1354 CATTTTAAAGATCCACAGTACCCAG
1585 15бЗ TCCTGATCCAAAGCAAAAGACAT
2179- -2215 AATGTTTTGCTCCTCTTTATCATGCTATGGA TGTTAC
2281 -2303 GGTTGTTATGCCAACTTGGGGGT
2910 -2933 TCTATTCAGATTGCAAATTACAAT
2944- -2912 CATCAGAATGATTGTAATTTGCAATCTGAAT AG
3094- -3114 CCCAGATCAGAGGAGGACAGA
3458 -3430 TTCATTTCTGTCCATTTCTCATCATTCA
3957 -3984 GAAACAGTTTTTAATTGGCAAATGGACT
4173- -4150 TTTTTGCTGGTTATCTTTGAGAAT
4735 -4707 CAATTTGAAGATGCTATTATAAAAGGAGA
4883 -4862 ATTGCATCATTTGTTTTAGCCA
5131 -5152 TTGCTGTGGGAGCTGCAGTTGG
5476 -5451 AAATAAAACTCCATCATTTCATAATC
6012- -5989 CGTTTTGGAGACTACATTCATTGA
6452 -6475 GTCCAAAAGATGAATTGAGACCAT
6632 -6606 CTGTCTATCAGGATCTATGCCAATAGC
бб 12 -6635 GGCATAGATCCTGATAGACAGTGG
6836 -6813 CAACAATTGTACAGCAGATGTTTA
6832 -6854 GTTGTTATCACGTCTATGGTTCA
7485 -7451 TTACTGATAAAAGAAATAAACAAACCTCAGA AATT
гласно [3]. Реакцию РНК-лигирования проводили в 50 мкл реакционной смеси следующего состава: 5 мкг РНК, 2 мкл ингибитора рибонуклеаз RNAsin («Promega», США) 50 ед. активности и 1 мкл РНК-лигазы 1 фага Т4 («New England Biolabs», Англия) 20 ед. активности в прилагаемом реакционном буфере. Реакционную смесь инкубировали 45 мин при 37 °С. Полученный препарат РНК осаждали стандартным образом. Затем проводили синтез кДНК с праймера 811—780 (табл. 1). ПЦР проводили с праймерами 6832-6854 и 127-104. ПЦР и получение ПЦР-фрагментов проводили согласно [3]. Определение нуклеотидной последовательности проводили методом Сэнгера на приборе ABI 3130xl Genetic Analyzer («Applied Biosystems», Япония) с помощью набора BigDye v3.1 согласно инструкции производителя с использованием праймеров из табл. 1. Выравнивание и филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программных пакетов Vector NTI 10 (www.invitrogen.com) и MEGA 8, соответственно.
Вторичную структуру 5'-нетранслируемых областей (5'-НТО) РНК рассчитывали с помощью программы Gene Bee service (http://www.genebee.msu.su/). Расчет профилей гидрофобности белков осуществляли методом Kyte и Doolittle (https://web.expasy.org/).
ЗЭ-структуры были рассчитаны на платформе SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) и представлены в программе Pymol (https://pymol.org/).
Результаты и обсуждение
Сравнительное исследование репликативных свойств штаммов MB-7/293 и МВ-7/4647 in vitro. Результаты определения кинетики накопления инфекционного ВГА и ви-русспецифического антигена в культурах клеток НЕК293 и 4647, инфицированных в идентичных условиях штаммами MB-7/293 и МВ-7/4647, представлены на рис. 1. При инфицировании культуры клеток НЕК293 штаммом MB-7/293 инфекционный вирус и вирусспецифический антиген появлялись в значительных количествах уже к 4-м суткам после заражения, максимальные значения отмечались на 6—7-е сутки. Инфицирование клеток НЕК293 родительским штаммом МВ-7/4647 не вызывало продуктивной вирусной инфекции клеток (отсутствие значимых количеств инфекционного вируса и вирусного антигена) на протяжении всего периода наблюдения, что свидетельствовало о неспособности неадаптированного штамма МВ-7/4647 к репликации в клетках НЕК293. Кинетика накопления инфекционного вируса и вирусспецифического антигена в клетках НЕК293, инфицированных MB-7/293, значительно опережала таковую в клетках 4647, инфицированных штаммом МВ-7/4647 (максимальные значения достигались на 10— 12-е сутки). При инфицировании культуры клеток 4647 достоверных отличий в репликатив-ной активности штаммов МВ-7/293 и MB-7/4647 не выявлялось. Ранее подобная способность к репродукции была отмечена у штамма GBM при адаптации к клеточным культурам FRhK и HFS в работе [9]. После проведения адаптации штамм GBM/FRhK был способен эффективно реплицироваться только на клетках FRhK, в противоположность этому штамм GBM/HFS эффективно репродуцировался как на FRhK, так и на HFS.
Для сравнения продуктивности штаммов MB-7/293 и MB-7/4647 в идентичных условиях проводили инфицирование культур клеток НЕК293 и 4647, соответственно (куль-туральные флаконы 175 см2, множественность заражения 1 ИД50/кл). Инфицированные клетки отбирали в сроки, когда концентрация вирусспецифического антигена достигала максимального значения на соответствующей культуре (клетки НЕК293, инфицированные штаммом MB-7/293, через 6 сут после заражения; клетки 4647, зараженные штаммом MB-7/4647, через 12 сут). В полученных клеточных лизатах (клетки ресуспендировали в 1 мл среды и подвергали трехкратному замораживанию—оттаиванию) определяли титры вирусспецифического антигена и инфекционные титры. Титры антигена ВГА в клетках НЕК293 и 4647, инфицированных штаммами MB-7/293 и MB-7/4647, составили 1:2560 и 1:640 соответственно, инфекционные титры 8,8±0,4 Lg ИД50/мл и 7,0±0,4 Lg ИД50/мл соответственно. Таким образом, штамм MB-7/293 при культивировании на культуре клеток НЕК293 значительно превосходил родительский штамм MB-7/4647, культивированный на клетках 4647, как по продуктивности (количеству ин-
Таблица 2. Отличия в нуклеотидных и в аминокислотных последовательностях штаммов МВ-7/293 и МВ-7/4647 (позиции н. по EU251188, а.о. по полипротеину ABX44727)
Район Позиция Нуклеотид Нуклеотид генома
генома нуклеотида генома МВ-7/293 [аминокис-
МВ-7/4647 лотная замена]
5'-НТО 13 C U
21 G A
702 U G
VP2 998 U C
VP3 1520 A U[Glu(257) ^ Asp]
VP1 2282 U C
2505 U A [Leu(586) ^ Met]
2B 3263 A U [Lys(839) ^ Asn]
3277 A G [Tyr(844) ^ Cys]
3287 G C [Glu(847) ^ Asp]
3327 G A [Asp(861) ^ Asn]
3425 C U
3504 U A [Tyr(919) ^ Asn]
2C 4014 A U [Asn(1089) ^ Tyr]
4063 G A [Ser(1105) ^ Asn]
4140 G A [Val( 1131) ^ Ile]
4712 U C
3A 5051 U C
3C 5559 C U
5744 C U
3D 6194 A C
6596 C U
6902 U C
фекционного вируса и вирусспецифического антигена), так и по кинетике накопления антигена ВГА.
Сравнительный анализ последовательностей геномов штамма MB-7/293 с родительским MB-7/4647 и другими быстрорастущими штаммами ВГА. Нуклеотидная последовательность генома штамма МВ-7/293 с 84-го нуклеотида (н.) по 7450-й н. была определена путем секвенирования перекрывающихся последовательностей ПЦР-фрагментов, полученных с помощью специфических праймеров (см. табл. 1).
Данные о геномах ВГА часто не содержат информации о первых 5'-концевых нуклеотидах нетранслируемой области. Для определения 5'-НТО нами была осуществлена сшивка концов геномной РНК с помощью РНК-лигазы. Посредством обратной транскрипции со специфического праймера была получена кДНК, после чего был амплифи-цирован фрагмент со 126-го по 1-й н., сшитый с 7055-го по 6832-й н. При последующем секвенировании была определена последовательность первых 83 н. 5'-НТО.
Полная последовательность генома штамма МВ-7/293 была депонирована в GenBank под номером HQ437707. Филогенетический анализ полной нуклеотидной последовательности генома штамма МВ-7/293 позволил отнести его к 1А генотипу, как и МВ-7/4647 [3]. Гомология геномов штамма МВ-7/293 с исходным МВ-7/4647 составила 99,7%. Рекомбинационных явлений в геноме МВ-7/293 не было выявлено.
В последовательности генома штамма МВ-7/293 в сравнении со штаммом МВ-7/4647 идентифицировано 3 нуклео-тидные замены в 5'-НТО и 20 в транслируемой области, которые приводили к заменам десяти аминокислотных остатков (а.о.) в белках УР3, УР1, 2В и 2С (табл. 2).
Обнаруженные в 5'-НТО замены в 13-м (C^U) и 21-м (G^A) нуклеотидах приводят к увеличению петли с 5 до 7 н. в расчетной вторичной структуре РНК, что, возможно, приводило к стабилизации петли в результате снижения внутреннего сопротивления и могло сказаться на эффективности репликации. Мутация U^G в 702 н. в районе IRES (internal ribosome entry site) приводит к изменению энергетической выгодности связи шпильки-стебля с 22,1 до 22,5 ккал/мол.
У штамма МВ-7/293, так же как у штамма МВ-7/4647 и двух быстрорастущих штаммов HM175/43C (M59809), HM175/24A (M59810), в отличие от штамма HAS-15 (JQ425480) и других штаммов ВГА, не обладающих быстрорастущим фенотипом, присутствует вставка из 13 н. в 5'-НТО. Эти 13 н. (149-GTAAATATTGATT-161) являются повтором и находятся в самом начале IRES.
Выявленные особенности в IRES могут вызывать изменения трансляционной активности вируса ввиду того, что IRES обеспечивает связывание мРНК ВГА с рибосомой для трансляции [10]. Ранее было показано, что мутации в IRES играют важную роль в изменении клеточного тропизма у пикорнавирусов [11].
Сравнительный анализ транслируемой области геномов штаммов МВ-7/4647 и МВ-7/293 показал, что найденные отличия приводят к заменам а.о. в структурных белках VP3 (1) и VP1 (1) и в неструктурных 2В (5) и 2С (3) (см. табл. 2).
На рис. 2 приведена реконструированная пространственная структура ВГА [1], благодаря которой можно визуализировать местоположение обнаруженных аминокислотных замен. Замена в N-концевой части структурного белка VP3 в 59 а.о. Glu(257, здесь и далее по полипротеину) ^ Asp, характерна только для штамма МВ-7/293 и этот аминокислотный остаток экспонирован на поверхности вириона (см. рис. 2, выделено серыми шарами).
При сравнительном анализе аминокислотных последовательностей со штаммом HAS-15 и рядом других штаммов у штаммов МВ-7/4647 и МВ-7/293 была выявлена замена в 72 а.о. белка VP3, Asp(316) ^His. Интересно, что в той же самой позиции у ранее описанных быстрорастущих вариантов ВГА HM175/43C и HM175/24A была идентифицирована замена Asp(316)^ Ala. Этот а.о. также экспонирован на поверхности вириона (данные не показаны). Следует отметить, что 72 а. о. VP3 входит в состав эпитопа, ответственного за взаимодействие с клеточным рецептором [12].
Идентифицированная замена в белке VP1 (95 а.о. Leu(586)^Mеt) у штамма МБ-7/293 уникальна среди описанных штаммов ВГА и локализуется в ранее выявленном иммунодоминантном районе [13]. На рис. 2 (выделено черными шарами) проиллюстрировано расположение этого а.о. на месте стыковки белков VP1 из пяти разных прото-меров в области вершины икосаэдра у оси 5-го порядка, где эти а.о. формируют небольшое углубление. Интересно, что это место стыковки белков VP1 из разных протомеров было нами замечено при замещении а.о. у штамма МБ-7/293, адаптированного к линии клеток человеческого происхождения — HEK293, после родителя МБ-7/4647, адаптированного к клеткам почки зеленой мартышки — 4647, т.е. при смене хозяина.
Непонятными являются причина и последствия появления делеции в N-концевой части белка VP1 ВГА. Деле-ция 6 а.о. в белке VP1 (517Thr-Thr-Met-Arg-Asp-Leu522) была обнаружена у быстрорастущих штаммов GBM/FRhK
0 2 4 6 8 ID 12 14 _С рок культивирования, сутки__
—M В-7/Щ ККНЕЮЭЗ ■ ■ мв-7.'4«?, кк некзга*
д MB-7/2SS ККЭД7 О МВ-7/«47, КК4Й47
1000
О 2 4 6 S 10 12 14
Срок культивирования, сутки
—*—МВ-7Д93 КК НЕК2ЭЗ -.- - M В-7 >4647, КК НЕ1С93
—£г— M В-7 Д93 КК 4647 —о- МВ-7/4647, КК 4647
Рис. 1. Кинетика накопления инфекционного ВГА (а) и антигена ВГА (б) в культурах клеток (КК) НЕК293 и 4647, инфицированных штаммом МВ-7/293 и штаммом МВ-7/4647.
* — все значения <2 Lg ИД50 (а) и <1:5 (б). По оси абсцисс — срок культивирования, сутки; по оси ординат — инфекционный титр, ^ ИД50.
и FG ([9], [5]). Ранее в работе B. Robertson и соавт. высказывалось предположение, что появление данной делеции, обусловлено пассированием ВГА на культуре клеток FRhK [14]. Поскольку не несущие этой делеции быстрорастущие штаммы МВ-7/293, МБ-7/4647, HM175/43C и HM175/24A имеют пассажную историю культивирования на клетках FRhK, это предположение представляется сомнительным.
Все известные быстрорастущие штаммы ВГА приобрели способность к быстрому росту после их первичной адаптации к клеткам FRhK, что, возможно, связано с эволюционной адаптацией вируса к специфическому кругу хозяев.
Следует отметить, что наибольшее число замен было выявлено в неструктурных белках 2В (5) и 2С (3), что согласуется с данными литературы о значительной изменчивости этих белков при адаптации к клеточным культурам [15]. Было показано, что белки 2В и 2С отвечают за взаимодействие с мембранными структурами клеток при формировании репликативного комплекса [16, 17]. Белок 2 В влияет на транспорт белков хозяина и
опосредованно на синтез интерферона, подавляя иммунный ответ [18, 19].
Стоит особо отметить замену в белке 2В, Ьуз(839)^ Л8п, у штамма МБ-7/293 рядом с сайтом протеолиза 2А/2В ^1п837/А1а838), которая присутствует у других быстрорастущих штаммов НМ175/43С и НМ175/24А и предположительно может влиять на скорость созревания этих белков и изменение репликативной активности вируса. Остальные мутации в неструктурных белках были штамм-специфическими и не совпадали с известными заменами в геномах штаммов, адаптированных к клеточным культурам.
Белок 2В имеет альфа-спиральный трансмембранный домен, позволяющий ему заякориваться в мембране эндо-плазматического ретикулума клетки-хозяина. Методом рентгеноструктурного анализа установлена структура ци-топлазматической части белка 2В [17]. Аминокислотные замены 10-го а.о., 01и(847)^А8р, и 24-го а.о., Ар(861)^ Л8п, имеющиеся в белке 2В штамма МБ-7/293, локализованы на концах бета-структур р1 и р3, описанные в работе [17].
Рис. 2. Реконструированная пространственная структура ВГА.
Замещения в а.о. штамма МВ-7/293 в сравнении с МВ-7/4647 отмечены: в белке УР1 — черными шарами, в белке УР3 — серыми шарами. По оси абсцисс — срок культивирования, сутки. По оси ординат — титр антигена в ИФА.
Поэтому они могут оказывать влияние на стабильность шпильки р2—р3 и взаимодействие мономеров белка 2В между собой. Анализ гидрофобности белкового профиля выявил, что в белке 2В штамма МВ-7/293 в отличие от штамма МВ-7/4647 произошло повышение гидрофобности на участке 839—847 а.о. (вконец белка) за счет мутаций 2-го а.о., Lys(839)^Asn, 7-го а.о., Туг(844)^ Cys, и 10-го а.о., Glu(847)^Asp. Таким образом, можно предположить значимость выявленных мутаций для взаимодействия мономеров белков 2В между собой и их функционирования.
В белке 2С (РНК-хеликаза) было выявлено повышение гидрофобности на N-концевых участках 1087—1090 а.о. за счет мутации 4-го а.о., Asn(1089)^Tyr, и снижение ги-дрофильности 1101 — 1109 а.о. за счет мутации 18-го а.о., Ser( 1105)^Asn, а также снижение гидрофобности на участке 1127—1135 а.о. за счет мутации 44-го а.о., Val(1131)^Ile. Данные рентгеноструктурного анализа для этого белка пока отсутствуют. Замены, произошедшие в N-конце белка 2С, экспонированном на поверхности белка, вероятно, важны в белковых взаимодействиях.
При анализе полноразмерной геномной РНК было установлено, что геном штамма MB-7/293 отличается от MB-7/4647 тремя нуклеотидными заменами в 5'-НТО и двадцатью в кодирующей области, которые приводят к заменам десяти а.о. в белках VP3, VP1, 2В и 2С. Сравнительный анализ штаммов MB-7/293 и MB-7/4647 с другими штаммами ВГА, включая ранее описанные быстрорастущие штаммы, позволил выдвинуть следующие наиболее вероятные причины влияния выявленных мутаций на репродуктивные свойства вируса: 1) замены в 13-м и 21-м н. в 5'-НТО приводили к стабилизации РНК-петли, что может сказаться на эффективности репликации; 2) присутствие вставки-повтора из 13 н. (149—161) в районе начала IRES и мутация в 702-м н. в IRES, что может повлиять на трансляционную активность; 3) замена в 72-м а.о. белка VP3 Asp(316)^His, которая может влиять на скорость и прочность связывания этого белка с клеточным рецептором; 4) замена в белке 2В, Lys(839)^Asn, у штамма МБ-7/293 рядом с сайтом протеолиза 2А/2В, которая может влиять на скорость созревания этих белков и изменение репликативной активности вируса.
Таким образом, в результате проведенной адаптации штамма ВГА MB-7/4647 к клеточной культуре НЕК293 получен и охарактеризован быстрорастущий штамм МВ-7/293(ГепА-293), существенно превосходящий родительский штамм по продуктивности при культивировании in vitro, перспективный для использования в производстве экономически выгодных иммунопрофилактических и диагностических препаратов.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
Wang X, Ren J, Gao Q, Hu Z, Sun Y, Li X, et al. Hepatitis A virus and the origins of picornaviruses. Nature. 2015;517:85-88. https://doi.org/10.1038/nature 13806
Takahashi K, Suto T, Arai M, Mishiro S. Revelation of near-complete genome of hepatitis A virus that caused «Osarizawa Hepatitis 1957» from a vintage sample kept frozen for 53 years. Kanzo. 2011;52:376-379. https://doi.org/10.2957/kanzo.52.376
Bondarenko TY, Ternovoi VA, Svyatchenko VA, Kiselev NN, Chausov EV, Muntyanova MU, et al. Complete genomic sequence of rapidly replicating strain MB-7 of hepatitis a virus and its characterization in comparison with nucleotide sequence of other hepatitis a virus strain. Mol Genet Microbiol Virol. 2010;25:39-46.
https://doi.org/10.3103/S0891416810010088
Venuti A, Di Russo C, del Grosso N, Patti AM, Ruggeri F, De Stasio PR, et al. Isolation and molecular cloning of a fast-growing strain of human hepatitis A virus from its double-stranded replicative form. J Virol. 1985;56:579-588.
Beneduce F, Pisani G, Divizia M, Pana A, Morace G. Complete nucleotide sequence of a cytopathic hepatitis A virus strain isolated in Italy. Virus Res. 1995;36:299-309.
Lemon SM, Murphy PC, Shields PA, Ping LH, Feinstone SM, Cromeans T, et al. Antigenic and genetic variation in cytopathic hepatitis A virus variants arising during persistent infection: evidence for genetic recombination. J Virol. 1991;65:2056-2065.
Майданюк А.Г., Тюнников Г.И., Конакова В.Е., Бондаренко Е.П., Немцов Ю.В., Карпович Л.Г. и др. Выделение и изучение характеристик цитопатического штамма вируса гепатита А. Вопросы вирусологии. 1993;38(3):101-105. [Maidanyuk AG, Tyunnikov GI, Konakova VE, Bondarenko EP, Nemtsov YuV, Karpovich LG, et al. Vopr Virusol. 1993;38(3): 101-105. (In Russ.)].
Никулин Л.Г., Нетесов С.В., Святченко В.А., Куслий А.Г., Терновой В.А., Киселев Н.Н., и др. Штамм virus hepatitis A hominis для приготовления вакцинных и диагностических препаратов. Патент РФ №2306336, БИ №10, 2007. [Nikulin LG, Netesov SV, Svyatchenko VA, Kusliy AG,
5
1.
6
2
7
3.
8
4.
Ternovoi VA, Kiselev NN, et al. Virus hepatitis a hominis strain for producing vaccine diagnostic preparations. Patent RF, № 2306336; 2007. (In Russ.)].
9. Graff J, Normann A, Feinstone SM, Flehmig B. Nucleotide sequence of wild-type hepatitis A virus GBM in comparison with two cell culture-adapted variants. J Virol. 1994;68:548-554.
10. Ehrenfeld E, Teterina NL. Initiation of translation of picornavirus RNAs: Structure and function of the internal ribosome entry site. Mol Biol Picornaviruses, Washington, DC: AMS Press.; 2002; 159-169.
11. Kauder SE, Racaniello VR. Poliovirus tropism and attenuation are determined after internal ribosome entry. J Clin Invest. 2004;113:1743-1753. https://doi.org/10.1172/JCI21323
12. Wang X, Zhu L, Dang M, Hu Z, Gao Q, Yuan S, et al. Potent neutralization of hepatitis A virus reveals a receptor mimic mechanism and the receptor recognition site. Proc Natl Acad Sci USA. 2017;114:770-775. https://doi.org/10.1073/pnas. 1616502114
13. Ping LH, Jansen RW, Stapleton JT, Cohen JI, Lemon SM. Identification of an immunodominant antigenic site involving the capsid protein VP3 of hepatitis A virus. Proc Natl Acad Sci USA. 1988;85:8281-8285.
14. Robertson BH, Brown VK, Khanna B. Altered hepatitis A VP1 protein resulting from cell culture propagation of virus. Virus Res. 1989;13:207-212. https://doi.org/10.1016/0168-1702(89)90016-6
15. Emerson SU, Huang YK, McRill C, Lewis M, Purcell RH. Mutations in both the 2B and 2C genes of hepatitis A virus are involved in adaptation to growth in cell culture. J Virol. 1992;66:650-654.
16. Jecht M, Probst C, Gauss-Müller V. Membrane permeability induced by hepatitis A virus proteins 2B and 2BC and proteolytic processing of HAV 2BC. Virology. 1998;252:218-227.
https://doi.org/10.1006/viro.1998.9451
17. Vives-Adrián L, Garriga D, Buxaderas M, Fraga J, Pereira PJB, Macedo-Ribeiro S, et al. Structural basis for host membrane remodeling induced by protein 2B of hepatitis A virus. J Virol. 2015;89:3648-3658. https://doi.org/10.1128/JVI.02881-14
18. Paulmann D, Magulski T, Schwarz R, Heitmann L, Flehmig B, Vallbracht A, et al. Hepatitis A virus protein 2B suppresses beta interferon (IFN) gene transcription by interfering with IFN regulatory factor 3 activation. J Gen Virol. 2008;89:1593-1604.
https://doi.org/10.1099/vir.0.83521-0
19. de Jong AS, de Mattia F, Van Dommelen MM, Lanke K, Melchers WJ, Willems PH, et al. Functional analysis of picornavirus 2B proteins: effects on calcium homeostasis and intracellular protein trafficking. J Virol. 2008;82:3782-3790.
https://doi.org/10.1128/JVI.02076-07
Поступила в редакцию 07.05.2018 После доработки 22.05.2018 Принята к публикации 30.06.2018
Сведения об авторах:
Бондаренко Татьяна Юрьевна [Bondarenko Tatyana Yurievna], к.б.н., научный сотрудник отдела молекулярной вирусологии флавивиру-сов и вирусных гепатитов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Роспотребнадзора, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область, Россия; e-mail: lemtat@ngs.ru; https://orcid.org/0000-0002-0346-7736
Терновой Владимир Александрович [Ternovoi Vladimir Aleksandrovich], канд. биол. наук, зав. лабораторией молекулярной эпидемиологии ООИ, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Роспотребнадзора, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область, Россия; https://orcid.org/0000-0003-1275-171X
Святченко Виктор Александрович [Svyatchenko Victor Aleksandrovich], к.б.н., зав. лабораторией вирусологии флавивирусов, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Роспотребнадзора, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область, Россия; https://orcid.org/0000-0002-2729-0592 Киселев Николай Николаевич [Kiselev Nikolai Nikolaevich], старший научный сотрудник отдела молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Роспотребнадзора, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область, Россия; https:// orcid.org/0000-0002-9737-9130
ШваловАлександр Николаевич [Shvalov Aleksandr Nikolaevich], канд. ф.-м.н., с.н.с. отдела молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Роспотребнадзора, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область, Россия; https://orcid. org/0000-0001-6890-1575
Куслий Александр Георгиевич [Kusliy Aleksandr Georgievich], канд. биол. наук, директор по качеству ЗАО «ВекторБиАльгам», 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область, Россия; https://orcid.org/0000-0002-0732-9314
Нетесов Сергей Викторович [Netesov Sergei Viktorovich], член-корреспондент РАН, д-р биол. наук, зав. лабораторией бионанотехноло-гии, микробиологии и вирусологии Факультета естественных наук Новосибирского государственного университета, 630090, Новосибирск, Россия; https://orcid.org/0000-0002-7786-2464.
