CC BY
13BRAF-МУТАЦИЯ В ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКЕ И ВЫБОРЕ ХИРУРГИЧЕСКОЙ ТАКТИКИ У БОЛЬНЫХ НОВООБРАЗОВАНИЯМИ
ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Ромащенко П.Н.
член-корреспондент РАН, д.м.н., профессор начальник кафедры и клиники факультетской хирургии Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова,
г. Санкт-Петербург Криволапое Д. С.
к.м.н., начальник хирургического (эндокринологического) отделения кафедры и клиники факультетской хирургии Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова,
г. Санкт-Петербург Симонова М. С. клинический ординатор кафедры и клиники факультетской хирургии Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова,
г. Санкт-Петербург
BRAF MUTATION IN DIFFERENTIAL DIAGNOSIS AND CHOICE OF SURGICAL TACTICS IN
PATIENTS WITH THYROID NEOPLASMS
Romashchenko P.N.
Corresponding Member of PAS, Doctor of Medical Sciences, professor Head of the Department and Clinic of Faculty Surgery of the Military medical Academy ofSM. Kirov,
Saint Petersburg Krivolapov D.S.
Ph.D. of Medical Sciences, Head of the surgical (endocrinological) Division
of the Department and Clinic of Faculty Surgery of the Military medical Academy ofSM. Kirov,
Saint Petersburg Simonova M.S.
Clinical resident of the Department and Clinic of Faculty Surgery of the Military medical Academy ofSM. Kirov,
Saint Petersburg DOI: 10.31618/nas.2413-5291.2022.3.75.561
АННОТАЦИЯ
Высокая частота выявления фолликулярных неоплазий щитовидной железы требует разработки новых наиболее эффективных методов их дифференциальной диагностики с целью ранней верификации высокодифференцированного рака, уменьшения количества необоснованных оперативных вмешательств, выбора их оптимального объема и улучшения результатов лечения. Проведенное исследование, в которое вошли результаты обследования и хирургического лечения 60 больных узловыми образованиями щитовидной железы, позволило оценить диагностическую значимость дооперационного определения мутации V600E гена BRAF в пункционном материале в выявлении папиллярного рака щитовидной железы и выборе рациональной хирургической тактики.
ABSTRACT
The high frequency of detection of thyroid follicular neoplasias requires the development of new most effective methods of their differential diagnosis in order to early verify well-differentiated cancer, reduce the number of unjustified surgical interventions, select their optimal volume and improve treatment results. The study, which included the results of examination and surgical treatment of 60 patients with thyroid nodules, made it possible to assess the diagnostic significance of preoperative determination of the BRAF V600E gene mutation in puncture material in identifying papillary thyroid cancer and determining rational surgical tactics.
Ключевые слова: образования щитовидной железы, папиллярный рак щитовидной железы, BRAF-мутация, молекулярно-генетическое исследование.
Key worlds: thyroid nodules, papillary thyroid cancer, BRAF-mutation, molecular genetic research.
Актуальность. Первичное выявление узловых образований щитовидной железы (УОЩЖ) требует от эндокринологов и хирургов проведения дальнейших диагностических действий с целью морфологической верификации патологического
процесса [4, 5, 10]. Для этого осуществляется пункционная тонкоигольная аспирационная биопсия (ПТАБ) образований под ультразвуковым контролем с последующим цитологическим исследованием полученного клеточного материала и его оценкой в
рамках общепризнанной международной цитологической классификации - The 2017 Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology [6]. При выборе тактики лечения наибольшие трудности по настоящее время сохраняются при выявлении фолликулярных неоплазий (IV цитологическая категория), диагностируемых примерно у 15% больных УОЩЖ и требующих проведения их дифференциальной диагностики [4]. Понимание того, что образование опухолевых клеток осуществляется вследствие мутаций в онкогенах, которые влекут за собой ингибирование апоптоза, неконтролируемую пролиферацию клеток и повышенную экспрессию определенных белков-рецепторов позволило с недавнего времени начать поиск перспективных биомаркеров рака щитовидной железы (РЩЖ), а также проводить молекулярно-генетический анализ, направленный на выявление экспрессии различных генов и оценку соматических мутаций [1, 2, 3, 7, 11, 12]. Некоторые международные клинические рекомендации указывают на необходимость дополнительного молекулярно-генетического
исследования пункционного материала,
соответствующего III, IV и V диагностическим категориям. Широкие научные исследования, проводимые по последнему вопросу, позволили европейской тиреоидологической ассоциации создать клинические рекомендации по молекулярной диагностике клеточного материала ЩЖ, где отражена возможность применения молекулярно-генетической панели, включающей наличие мутаций BRAF, NRAS, HRAS, KRAS, PAX8/PPARG, RET/PTC в дооперационной диагностике высокодифференцированного РЩЖ (ВДРЩЖ) [8]. Однако проведенные во всем мире исследования нередко дают противоречивые или неубедительные данные о диагностической значимости различных молекулярных-генетических маркеров. При этом большинство из них проведено на послеоперационном материале, в связи с чем еще более актуальным становится вопрос о поиске молекулярно-генетических маркеров, позволяющих проводить дооперационную дифференциальную диагностику образований с неопределенным потенциалом злокачественности [7, 8, 10]. Наибольший научный и практический интерес в выявлении ВДРЩЖ представляет соматическая мутация V600E гена BRAF, которая является сильнейшим индуктором митоген-активирующего MAP-киназного сигнального пути, повышает митотическую активность клеток и бесконтрольную пролиферацию тиреоцитов [1, 2, 3].
Цель исследования: оценить диагностическую значимость соматической мутации V600E гена BRAF в дифференциальной диагностике и выборе хирургической тактики у больных фолликулярными неоплазиями и папиллярным раком, а также выявлении особенностей его клинического течения.
Материалы и методы исследования. В исследование включены 60 больных УОЩЖ, прошедшие обследование и лечение в клинике факультетской хирургии имени С.П. Федорова Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова в период с
ноября 2019 по ноябрь 2020 года, у которых общий стандарт предоперационного обследования был дополнен определением мутации V600E гена BRAF в пункционном материале УОЩЖ методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), проведённым в клинической диагностической лаборатории ООО «МедЛабСПб» [2].
Полученный в результате ПТАБ клеточный материал из УОЩЖ помещали в пробирку с 2 мл буфера PBS (Phosphate buffered saline) и 142 мкл буфера ACD-A (Anticoagulant Citrate Dextrose Solution, formula A), затем перемешивали. 300 мкл полученной суспензии центрифугировали в течение 10 минут при 13000 об/мин, часть супернатанта при этом сливали, оставив 100 мкл осадка с надосадочной жидкостью. Нуклеиновые кислоты выделяли с помощью комплекта реагентов ПРОБА-НК, в результате чего получали 50 мкл раствора ДНК.
Детекцию мутации Т1799А (V600E) в гене BRAF проводили с помощью аллель-специфичной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Каждый образец ДНК подвергали двум ПЦР-реакциям с двумя олигонуклеотидными праймерами. Один из них комплиментарен только одному из вариантов мутации, где выявляются нуклеотиды T или А на 3'-конце, а другой универсальный. При отсутствии в образце ДНК А-мутации реакция проходила только в той пробирке, где использовался Т-праймер. Если же в образце ДНК была А-мутация, то соответственно ПЦР проявлялась в обеих пробирках.
В исследовании использовали следующие последовательности праймеров: общий праймер 5'-ggccaaaatttaatcagtgga-3', контрольный T-праймер 5'-gtgattttggtctagctacagt-3' и детектирующий А-праймер 5'-gtgattttggtctagctacaga-3'. Помимо праймеров в данную реакционную смесь добавляли буферный раствор, дезоксирибонуклеотиды, раствор MgCl2 и Hot-Taq. ПЦР-реакцию проводили на амплификаторе «ДТпрайм» (ООО «НПО ДНК-технология», Россия). Детекцию ампликонов (продуктов амплификации) выполняли в отдельном помещении с помощью электрофореза в 7% полиакриламидном геле, окрашивая раствором бромистого этидия с последующей визуализацией на аппарате MultiDoc-it (UVP, LLC, США) и фотофиксацией результата. ПЦР-реакцию считали положительной при визуализации светящегося фрагмента размером 119 пар нуклеотидов, определенного с помощью набора ДНК-маркеров 100 bp, нанесенного на тот же гель.
Все больные, вошедшие в исследование, с целью определения показаний к хирургическому лечению и оценки диагностической значимости BRAF-мутации были разделены на четыре группы в зависимости от результатов цитологического исследования пункционного материала: в первую (n=21) вошли пациенты, у которых выявлены признаки РЩЖ (Bethesda VI); во вторую (n=3) -образований подозрительных на РЩЖ (Bethesda V); в третью (n=26) - фолликулярных опухолей -неоплазий различной степени (Bethesda IV); в
четвертую (n=10) - доброкачественных коллоидных узлов (Bethesda II) [6].
Статистическую обработку полученных данных проводили на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ STATISTICA for Windows 7,0. и Microsoft Excel (Microsoft Office 2013, США). Оценку показателей информативности методов исследования осуществляли по таким показателям как чувствительность, специфичность, точность положительная и отрицательная прогностическая ценность.
Результаты. Результаты комплексного обследования больных позволили определить показания к хирургическому лечению: фолликулярные опухоли и подозрение на РЩЖ - 29 (48,3%), РЩЖ - 21 (35%) и коллоидный зоб с компрессией органов шеи - 10 (16,7%). Тиреоидэктомия выполнена у 23 (38,3%) больных, гемитиреоидэктомия - у 27 (45%); субтотальная резекция ЩЖ - у 10 (16,7%). Хирургическое вмешательство было дополнено у 12 больных центральной (n=8) и боковой (n=4) лимфаденэктомией при подозрении на
метастатическое поражение соответствующей группы лимфоузлов. Оперативные вмешательства с использованием традиционного доступа были выполнены у 24 (40%) пациентов, при помощи минимально инвазивных - у 36 (60%).
Результаты планового гистологического исследования операционного материала позволили установить, что в первой группе пациентов с цитологически подтвержденным РЩЖ (п=21) окончательный диагноз ВДРЩЖ подтвердился у 20 (95,2%); у больных второй группы с подозрением на РЩЖ (п=3) - у 2 (66,7%). У 1 больного первой группы и у 1 второй были диагностированы фолликулярные аденомы. В третьей группе пациентов с фолликулярными неоплазиями из 26 больных у 22 (84,6%) гистологически были определены фолликулярные аденомы, у 4 (15,4%) - ВДРЩЖ. У всех исследуемых четвертой группы с «коллоидным зобом» (п=10) подтверждено наличие доброкачественного процесса в виде разной степени пролиферирующего коллоидного зоба (табл. 1).
Таблица 1
Результаты гистологического исследования операционного материала
Группы пациентов (заключение цитологического исследования) Заключение гистологического исследования Количество пациентов, чел.
абс. %
Bethesda VI (n=21/35%) Папиллярный рак 19 90,4
Фолликулярный рак 1 4,8
Фолликулярная аденома 1 4,8
Bethesda V (n=3/5%) Папиллярный рак 2 66,7
Фолликулярная аденома 1 33,3
Bethesda IV (n=26/46,3%) Фолликулярная аденома 22 84,6
Папиллярный рак 3 11,5
Фолликулярный рак 1 3,9
Bethesda II (n=10/16,7%) Узловой коллоидный зоб 10 100
Таким образом, по результатам гистологического исследования окончательный диагноз ВДРЩЖ различной распространенности был диагностирован у 26 больных. Установлено, что классический вариант гистологического типа папиллярного рака выявлен у 23 (88,5%), фолликулярный вариант папиллярного рака - у 1 (3,8%), фолликулярный рак - у 2 (7,7%).
Полученные результаты позволили установить высокие показатели чувствительности (100%) и отрицательной прогностической ценности (100%) в отношении ВДРЩЖ при цитологическом исследовании клеточного материала, полученного путем ПТАБ. Однако, с учетом группы фолликулярных неоплазий данный метод имеет низкую специфичность (29,4%), точность (60%) и положительную прогностическую ценность (29,8%).
Проведенный анализ выявления мутации V600E гена BRAF методом ПЦР в клеточном
материале, полученном при ПТАБ из УОЩЖ, показал, что среди 26 пациентов с гистологически доказанным ВДРЩЖ данный маркер определен у 22 (84,6%). При этом BRAF-мутация отмечена у 22 из 24 больных папиллярной карциномой ЩЖ и исключена при фолликулярных карциномах. Среди 24 пациентов с фолликулярными аденомами, данный маркер выявлен у 1, что может быть связано с трудностями морфологической верификации признаков карциномы и требует дополнительного углубленного изучения операционного материала. BRAF-мутация также не выявлена у всех 10 пациентов с коллоидным зобом.
Оценка мутации V600E гена BRAF в группах больных показала, что среди 21 пациента с цитологически подтвержденным РЩЖ
фолликулярная аденома и фолликулярная карцинома диагностированы у 2 BRAF-отрицательных пациентов. У 2 больных второй группы папиллярная карцинома ЩЖ сопровождалась наличием мутации,
у 1 пациента с фолликулярной аденомой мутация не выявлена. В третьей группе пациентов мутация гена ВИЛР выявлена у всех 3 больных папиллярной карциномой ЩЖ и у 1 с фолликулярной аденомой, тогда как остальные пациенты были ВЯЛР-отрицательными (табл. 2).
Изучение диагностической значимости,
Изучение взаимосвязи BRAF-мутации с факторами агрессивного течения РЩЖ, такими как инвазивный и мультицентричный рост, его экстракапсулярное распространение и раннее метастазирование в регионарные лимфатические узлы показало, что данная мутация выявлена у всех 4 пациентов с мультицентричной опухолью, у всех 11 больных с метастатическим поражением регионарных лимфоузлов и у всех 10 с признаками прорастания капсулы ЩЖ и/или распространения карциномы за ее пределы. В то же время у 2 BRAF-отрицательных больных ни одного из вышеперечисленных факторов не было выявлено. Полученные данные свидетельствуют о том, что такая склонность к более агрессивному течению BRAF-положительного папиллярного РЩЖ требует выполнения радикального объема оперативного вмешательства - тиреоидэктомии и профилактической ЦЛАЭ, даже при микрокарциномах. Отсутствие данной
соматической мутации позволяет планировать органосберегающий объем резекции ЩЖ.
Таким образом, мутация V600E гена BRAF, определенная в пункционном материале методом ПЦР, является высокоспецифичным маркером папиллярной карциномы ЩЖ. Выявление BRAF-мутации у пациентов с фолликулярной опухолью с вероятностью до 97,1% позволяет говорить о наличии папиллярного РЩЖ с более агрессивным течением, в то время как BRAF-статус больных доброкачественными образованиями является отрицательным. Также нельзя исключить наличие BRAF-отрицательного фолликулярного и папиллярного РЩЖ.
позволило установить, что чувствительность выявления мутации V600E гена BRAF методом ПЦР составила 84,6%, специфичность - 97,1%, точность - 91,7%, положительная и отрицательная прогностическая ценность - 95,7% и 89,2% соответственно.
Таблица 2
Выводы:
1. Выявление мутации BRAF V600E в клеточном материале фолликулярных опухолей методом полимеразной цепной реакции с вероятностью до 97,1% указывает на наличие папиллярной карциномы щитовидной железы. BRAF-статус пациентов с фолликулярными карциномами и доброкачественными образованиями является отрицательным.
2. BRAF-положительные папиллярные карциномы характеризуются более агрессивным течением, что требует выполнения радикального объема оперативного вмешательства -тиреоидэктомии и профилактической центральной лимфаденэктомии, даже при микрокарциномах. Отсутствие данной мутации указывает на возможность выполнения гемитиреоидэктомии по общепризнанным показаниям.
Литература:
1. Березкина, И.С. Возможности традиционной и жидкостной цитологии в сочетании с иммуноцитохимической детекцией некоторых молекулярных маркеров в дооперационной диагностике высокодифференцированного рака щитовидной железы / И.С. Берёзкина, Т.В. Саприна, А.П. Зима [и др.] // Клиническая и экспериментальная цитология. - 2016. - Т.12, №1. - С. 38-45.
2. Борискова, М.Е. Оптимизация хирургической тактики лечения BRAF-положительного папиллярного рака щитовидной железы / М.Е. Борискова, У.В. Фарафонова, П.А. Панкова, М.А. Быков, Э.А. Рамазанова //
Выявление мутации У600Е гена ВКАК
Цитологическое Окончательный гистологический диагноз Кол-во пациентов BRAF- мутация + BRAF-мутация
заключение абс. %
Папиллярный рак 19 90 17 2
Папиллярный рак Фолликулярный рак 1 4,8 - 1
(п=21/35%) Фолликулярная 1 4,8 1
аденома
Подозрение на рак (п=3/5%) Папиллярный рак 2 66,7 2 -
Фолликулярная аденома 1 33,3 - 1
Фолликулярная опухоль Фолликулярная аденома 22 84,6 1 22
(п=26/46,3%) Папиллярный рак 3 11,5 3 -
Фолликулярный рак 1 3,9 - 1
Узловой коллоидный зоб (п=10/16,7%) Коллоидный зоб 10 100 - 10
Клиническая и экспериментальная тиреоидология.
- 2018. - Т.14, №1. - С. 25-33.
3. Лукьянов, С.А. Перспективы использования молекулярно-генетических панелей в дооперационной дифференциальной диагностике узловых образований щитовидной железы / С.А. Лукьянов, С.В. Сергийко, С.Е. Титов, Ю.А. Веряскина / Новости хирургии. - 2020. - Т.28, №3.
- С. 284-289.
4. Майстренко, Н.А. Современные подходы к диагностике и хирургическому лечению заболеваний щитовидной железы / Н.А. Майстренко, П.Н. Ромащенко, Д.С. Криволапов // Военно-медицинский журнал. - 2018. - №1. - С. 3746.
5. Ромащенко, П.Н. Современные диагностические и малоинвазивные технологии в хирургии щитовидной железы / П.Н. Ромащенко, Н.А. Майстренко, Д.С. Криволапов [и др.] // Вестник российской Военно-медицинской академии. - 2019. - №S1. - C. 101-105.
6. Cibas E.S. The 2017 Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology / E.S. Cibas, S.Z. Ali // Thyroid. - 2017. - Т.27, №11. - P.1341-1346.
7. Nagar, S. Evaluation of genetic biomarkers for distinguishing benign from malignant thyroid neoplasms / S. Nagar, S. Ahmed, P. Peeples [et al.] //
The American Journal of Surgery. - 2014. - Vol. 207, №4. - P. 596-601.
8. Paschke, R. European Thyroid Association Guidelines regarding thyroid nodule molecular fineneedle aspiration cytology diagnostics / R. Paschke, S. Cantara, A. Crescenzi [et al.] // European Thyroid Journal. - 2017. - Vol. 6, №3. - P. 115-129.
9. Sanabria, A. Growing incidence of thyroid carcinoma in recent years: Factors underlying overdiagnosis / A. Sanabria, L.P. Kowalski, J.P. Shah [et al.] // Head Neck. - 2017. - Vol. 40, № 4. -P. 855-866.
10. Siegel, R.L. Cancer statistics / R.L. Siegel, K.D. Miller, A. Jemal // CA: A Cancer Journal for Clinicians. - 2016. - Vol. 66, № 1. - P. 7-30.
11. Vuong, H. G., Prognostic implication of BRAF and TERT promoter mutation combination in papillary thyroid carcinoma-A meta-analysis / H.G. Vuong, A.M. Altibi, U.N. Duong, L. Hassell // Clinical Endocrinology (Oxf). - 2017. - Vol. 87. - P. 411-417.
12. Zhang, H. Synergistic inhibition of MEK/ERK and BRAF V600E with PD98059 and PLX4032 induces sodium/iodide symporter (NIS) expression and radioiodine uptake in BRAF mutated papillary thyroid cancer cells / H. Zhang, D. Chen // Thyroid Research. - 2018. - Vol.13, №11. - P. 1-6.
