CC BY
24
DOI: 10.23868/201903010
боковой АмиотроФичЕский склероз: особенности иммунофенотипа гемопоэтических костномозговых клеток-предшественниц как возможный биомаркер ранней диагностики фатальной болезни
А.С. Брюховецкий1, 3, Л.Ю. Гривцова2
1 Центральная клиническая больница РАН, Москва, Россия
2 Медицинский радиологический исследовательский центр им. А.Ф. Цыба, филиал НМИНЦ радиологии, Обнинск, Россия
3 ЗАО Клиника «НейроВита», Москва, Россия
amyotrophic lateral sclerosis: characteristics of the immunophenotype of hematopoietic precursor cells as a potential biomarker for early diagnostics of fatal disease
A.S. Bryukhovetskiy1 3, L.Y. Grivtsova2
1 Central Clinical Hospital of the RAS, Moscow, Russia
2 A.F. Tsyb Medical Radiological Research Center, the branch of NMRRC, Obninsk, Russia
3 CJSC "NeuroVita" Clinic, Moscow, Russia
e-mail: neurovita-as@mail.ru
Боковой амиотрофический склероз, также известный под названием болезнь моторного нейрона, это фатальное нейроде-генеративное заболевание человека, проявляющееся дегенерацией двигательных нейронов, гипотрофией и атрофией мышц. Причины и патогенез бокового амиотрофического склероза пока не ясны и эффективного лечения не существует, диагностика осуществляется на основе клинико-нейрофизиологиче-ского обследования, когда погибло уже более 80% мотонейронов. Цель работы: прицельное сравнительное картирование, профилирование и изучение протеомных маркеров клеточной поверхности аутогенных гемопоэтических стволовых клеток больных с боковым амиотрофическом склерозом и здоровых доноров для выявления уникальных молекулярных характеристик их фенотипа и особенностей иммуноспецифического про-теомного ландшафта клеточной поверхности гемопоэтических стволовых клеток, которые могут стать фундаментальными мо-лекулярно-биологическими маркерами формирования патоспе-цифической недостаточности иммунной системы и обеспечить надежные критерии для проведения ранней диагностики этого неизлечимого заболевания.
На мобилизованных гемопоэтических стволовых клетках периферической крови в 86 образцах, полученных от 62 пациентов с боковым амиотрофическим склерозом, и в 61 образце, полученном от 54 здоровых доноров, в популяции Сй34+-клеток оценена экспрессия антигенов HLA-DR, CD38, CD117, CD13, CD33, CD56, CD90, CD45, CD10, CD71 и др. Анализ результатов показал различия в количестве субпопуляций гемопоэтиче-ских стволовых клеток у больных боковым амиотрофическим склерозом в сопоставлении с донорами и позволил ввести понятие специфического для бокового амиотрофического склероза иммунофенотипического профиля мембранных антигенов гемопоэтических стволовых клеток, который верифицирует ней-роспецифическую иммунную недостаточность на уровне клеток-предшественниц костного мозга и дает возможность молекуляр-но-биологически диагностировать семейные и спорадические варианты бокового амиотрофического склероза до клинической манифестации болезни. Полагаем, что в дебюте боковой амио-трофический склероз это болезнь гемопоэтических клеток-предшественниц, проявляющаяся в ряде патологических изменений на уровне генома и протеома гемопоэтических стволовых клеток, находящих отражение в субпопуляционном составе гемопоэти-ческих стволовых клеток и их иммунофенотипических характеристиках, что является причиной генетически детерминированного истинного аутоиммунного генеза заболевания, которое лишь в финале проявляется в виде болезни моторного нейрона. Однако дальнейшие исследования требуют больших выборок пациентов и экспериментальной проверки этих научных фактов.
ключевые слова: боковой амиотрофический склероз, болезнь моторного нейрона, иммунофенотический профиль, мембранные антигены, гемопоэтические стволовые клетки.
Amyotrophic lateral sclerosis also known as motor neuron disease is a fatal neurodegenerative disease that manifests by degeneration of motor neurons, hypotrophy and atrophy of the muscles. The causes and pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis are not clear so far, the effective therapy is absent. Amyotrophic lateral sclerosis is diagnosed by clinical and neurophysiologic examination and only when over 80% of motor neurons are dead. The multiparameter flow cytometry was used to evaluate the expression of HLA-DR, CD38, CD117, CD13, CD33, CD56, CD90, CD45, CD10, CD71 in 86 samples of the mobilized hematopoietic stem cells from 54 amyotrophic lateral sclerosis cases and in 61 samples of mobilized hematopoietic stem cells from 54 healthy donors. The analysis showed differences in the hematopoietic stem cells subpopulations of amyotrophic lateral sclerosis donors as compared to those of healthy donors and allowed for the introduction of the notion of the amyotrophic lateral sclerosis-specific immu-nophenotypic profile of hematopoietic stem cells membrane antigens. The profile allows for verification of neurospecific immune insufficiency at the level of progenitor cells of the bone marrow and diagnostics of the family and sporadic amyotrophic lateral sclerosis in a molecular-biological way at the earliest stage before clinical manifestation of the disease. We suppose that the amyotrophic lateral sclerosis makes its debut as the disease of hematopoi-etic stem cells and manifests as pathologic changes at the level of hematopoietic stem cells genome and proteome that are represented in the subpopulation composition of hematopoietic stem cells and their immunophenotypic characteristics, becoming the cause of genetically determined genuine autoimmune origin of the disease so that the motor neuron disease manifests only in the end. However, further research with larger samples and experimental check of the evidence is required.
Keywords: amyotrophic lateral sclerosis, motor neuron disease, immunophenotypic profile, membrane antigens, hematopoietic stem cells.
Введение
К нейродегенеративным болезням (НДБ) человека относят большую группу неизлечимых нервных болезней, таких как болезнь Альцгеймера [1, 2], болезнь Пика, болезнь Паркинсона, системные корковые и мозжечковые атрофии, корково-базальная дегенерация, фронтотемпоральная деменция, оливопонтоце-ребеллярная дегенерация и еще целый ряд нервных заболеваний [3-5]. В настоящее время основные причины и патогенез многих НДБ человека остаются неизвестными [1-3, 6]. Считается, что в основе большинства НДБ лежат генетические, протеомные и дис-метаболические изменения в нейронах головного мозга и спинного мозга, приводящие к дегенерации нейронов разных типов из-за накопления патоспецифических белков в различных компартментах этих клеток [6]. При болезни Альцгеймера, прогрессирующем надъядерном параличе, кортико-базальной дегенерации в нейронах головного мозга накапливаются tau-белки (таутопа-тии) [1, 2], при болезни Паркинсона, множественной системной атрофии, деменции с телами Леви — тельца Леви (синуклеопатии) [3], при дегенерации фронтотем-поральных долей — FUS белки (фузопатии) [3] и т. д. Последние десятилетия к нейродегенеративным заболеваниям стали относить боковой амиотрофический склероз (БАС) или болезнь Лу Герига [3, 4, 7]. Другое современное название БАС — болезнь моторного нейрона [8-11]. Общеизвестно, что при БАС, как и при всех НДБ, всегда выявляется определенный генетический и протеомный дефект моторных нейронов [5, 7, 9, 11-13]. В настоящее время при БАС определены генетические изменения в 106 генах, вовлеченных в патологический нейродегенеративный процесс, и показана особая роль мутаций SOD-1, FUS и TDP-43 [14] в формировании протеомных нарушений в цитоплазме и ядре мотонейронов при моделировании БАС на животных и у человека с БАС [10-13, 15-20]. В последней международной классификации болезней 10 пересмотра (МКБ-10) БАС официально отнесен к группе нейроде-генеративных заболеваний и обозначен исключительно как болезнь моторного нейрона. Неврологами всего мира БАС считается болезнью моторного нейрона [11, 14, 15]. Группа заболеваний БАС признана фатальным заболеванием центральной нервной системы, которое сопровождается массивной нейродегенерацией моторных нейронов, спастико-атрофическим синдромом с последующей гипотрофией и атрофией мышц [7, 21]. В мире не существует эффективного лечения и возможности предотвращения быстрого летального исхода при БАС [7-9, 22]. Время жизни большинства пациентов с установленным диагнозом БАС составляет 2-3 года, 10-15% больных живут от 5 до 10 лет [13, 23, 24] и лишь единицы — более 10 лет.
До настоящего времени диагностика этого фатального заболевания была и остается «приговором без права на помилование». У подавляющей части пациентов с БАС клинически болезнь манифестирует только тогда, когда заболевание уже зашло в самую последнюю финальную стадию необратимого патологического процесса и прошло «точку невозврата». Диагноз БАС устанавливают только клинически и по данным электро-нейромиографии (ЭНМГ), когда у пациента погибло более 80% мотонейронов в головном и спинном мозге и спасти больного с диагностированным БАС не возможно, так как у него остались не поврежденными лишь 10-15% мотонейронов нервной ткани [10, 25]. Ранней молекулярно-биологической диагностики и реального лечения при БАС нет [26, 27].
Роль иммунной системы в развитии почти всех форм БАС неоднозначна и во многом негативна [28, 29]. Очевидно, что во всех случаях этих смертельных заболеваний имеет место крайне избирательная (селективная) функциональная недостаточность иммунной системы, которая играет важную роль в патогенезе и патомор-фологии заболевания. Недостаточность иммунной системы при БАс исследователями отмечалась неоднократно [27]. Несмотря на то, что долгое время заболевание признавали аутоиммунным, существенных количественных изменений клеточного и гуморального иммунитета при БАс выявлено не было. Более того, в последние годы аутоиммунный генез БАс неврологи стали считать научно не обоснованным. Главный аргумент в пользу отрицания аутоиммунного генеза болезни заключался в том, что при БАс нет положительного результата от применения стандартной терапии, высоко эффективной при других аутоиммунных заболеваниях: 1) нет достижения ремиссии болезни при введении глюкокортикоидных гормонов; 2) нет эффекта от аутогенной трансплантации костного мозга (ТКМ), как при рассеянном склерозе и других аутоиммунных болезнях соединительной ткани; 3) нет эффекта от плазмафереза; 4) нет результата от применения блокаторов интерлейки-нов и других препаратов, направленных на уменьшение системного воспаления и деструкции ткани [4, 5, 12, 28].
Клинические и лабораторные критерии, на которых основано отрицание аутоиммунного генеза БАс, нам показались не убедительными, так как морфологические изменения в нервной ткани при БАС очевидно свидетельствуют в пользу системного асептического воспаления, приводящего к проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и возникновению механизмов первичных и вторичных аутоиммунных нарушений, связанных с повреждением нейронов и антигенной презентацией на дендритных клетках недоступных антигенов этих нейронов. Патологическая проницаемость ГЭБ приводит к дополнительной массивной лейкоцитарной инфильтрации нервной ткани, формированию локального воспаления, аутореактивности собственных лимфоцитов и цитотоксической дегенерации нервной ткани. Несмотря на то, что заболевание имеет в своей основе доказанный генетический дефект [30, 31] и статистически доказанные достоверные транскриптомные и протеомные нарушения в моторных нейронах, наши исследования этиопатогенеза и исходов БАС позволили нам предположить, что болезнь мотонейрона это не причина, а следствие «истинного» патологического мультисистемного аутоиммунного процесса, и в основе молекулярно-био-логического дефекта мотонейронов лежит изначально протеомное перерождение гемопоэтической стволовой клетки (ГСК), как родоначальницы всех клеток системы кроветворения и иммунитета [32]. Была выдвинута гипотеза, что БАС это «облигатное» или «истинное» аутоиммунное заболевание, связанное с системной аутореак-тивностью, обусловленной протеом-модифицированной ГСК и гемопоэтических прогениторов и, соответственно, всех их потомков, а рассеянный склероз и другие аутоиммунные заболевания могут быть как «факультативными» или «локальными» аутоиммунными заболеваниями, связанными с аллореактивностью только периферических иммунокомпетентных клеток крови (ИКК) при здоровой ГСК, так и иметь «облигатные» или фундаментальные причины формирования терапевтически не курабельного прогредиентно-рецидивирующего заболевания, также связанного с геномно-эпигеномным повреждением ГСК. Именно при таких формах рассеянного склероза с патологией ГСК абсолютно не эффективна аутогенная тКМ.
Важно отметить, что ГСК или стволовые кроветворные клетки — очень малочисленная, но гетерогенная клеточная популяция, объединяющая в себе несколько типов (субпопуляций) клеток, отличающихся по уровню дифференцировки и способности к пролиферации [33, 34]. Среди них присутствуют как недифференцированные, практически не делящиеся стволовые клетки (СК), так и коммитированные (ограниченные в направлении дифференцировки) клетки-предшественницы [34]. Концентрация ГСК в периферической крови в состоянии стабильного кроветворения мала — менее 0,01%, что делает затруднительным их изучение даже самыми чувствительными методами [35]. Но именно ГСК имеют самый длительный клеточный цикл среди всех клеток организма человека (360 сут.), являются основной регуляторной и управляющей системой в существующей иерархии всех клеточных систем организма, первыми реагируют на мутации генов в клетках и появление асептического воспаления при патологии тканей, мигрируют в зоны воспаления из костного мозга, адгезируют к патологическим клеткам и «направляют их развитие» в сторону дифференцировки или апоптоза по принципу «эффекта свидетеля» (by Stander effect) [13, 36]. В нашей работе 2016 г. на примере злокачественных опухолей мы описали инструмент регуляции функций ГСК в зоне воспаления, который, по нашему мнению, представляет собой универсальный механизм горизонтального и вертикального микровезикулярного информационного обмена цитоплазматическими белками с патологическими клетками [37]. В зависимости от мутационного повреждения клеток-мишеней в тканях, содержащих мутантные клетки, в ГСК происходят геномно-протеом-ные перестройки и патологические модификации белков в цитоплазме, ядре и на поверхности мембран [37]. Мы предположили, что в результате межклеточного обмена при БАС появляются протеом-модифицирован-ные аутоГСК, получившие иммунизацию иммуноспеци-фическими патологическими белками, что ранее было нами показано в фундаментальных исследованиях по протеомике СК [38]. Была высказана гипотеза, что в случаях с БАС формируются мутантные протеом-моди-фицированные ГСК, производящие аутоагрессивных к собственной нервной ткани потомков — аутореактив-ные ИКК, что было подтверждено экспериментальными результатами протеомного картирования и профилирования молекулярной структуры ГСК при БАС [13, 27]. Под воздействием этиопатогенетических факторов заболевания формируется специфический протеомный профиль ГСК, меняющий нормальный фенотип ГСК на патологический.
Целью настоящего исследования стало прицельное сравнительное картирование, профилирование и изучение протеомных маркеров клеточной поверхности аутогенных ГСК при БАС и здоровых доноров для выявления уникальных молекулярных характеристик их фенотипа и особенностей иммуноспецифического протеомного ландшафта клеточной поверхности ГСК, которые могут стать фундаментальными молекулярно-биологическими маркерами формирования патоспецифической недостаточности иммунной системы и обеспечить надежные критерии для проведения ранней диагностики этого неизлечимого заболевания.
Материал и методы
Исследование субпопуляций ГСК было проведено на 147 образцах лейкоконцентрата периферической крови (ЛК ПК): 61 образец от 54 здоровых доноров костного мозга и 86 образцов от 62 пациентов с БАС после
подписания информированного согласия. До забора крови проводили мобилизацию ГСК в ПК с применением гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) (Нейпоген, Амджен Европа Б.В., Нидерланды), затем из образцов крови выделяли мобилизованные мононуклеары ПК (ЛК) по стандартной процедуре лейко-цитофереза на сепараторе крови (Baxter, Cobe Spectra, США). Для анализа брали 2-3 мл ЛК свежеполученной ПК или такое же количество ЛК после криоконсервации и длительного хранения в криобанке ФГБУ НМИНЦ онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России.
Все больные БАС наблюдались в отделениях клиники «НейроВита» в течение 2002-2018 гг.: 60 (96,7%) больных БАС получали клеточную терапию аутогенными ГСК и 2 пациента (3,2%) с БАС — аллогенными гаплоидентичными ГСК из ЛК. Анализ поверхностных антигенов ГСК проводили после 3-сут. стимуляции Г-КСФ и забора 10 мл ПК.
Среди здоровых доноров костного мозга было 35 (64,81%) мужчин и 19 (35,2%) женщин. Средний вес мужчин составил 86,2 кг, средний вес женщин — 61,6 кг; средний возраст доноров — 37,6 г. (диапазон 26-44 г.).
Среди пациентов с БАС доминировали мужчины (47 человек, 75,8%) над женщинами (15 человек, 24,2%). Средний вес пациентов с БАС составил 74,2 кг у мужчин и 56,3 кг у женщин; средний возраст пациентов с БАС равнялся 56 г. (медиана 54,3 г., диапазон 42-68 г.).
По этиопатогенетической классификации у 6 (9,7%) пациентов БАС был представлен семейным вариантом (у 2 пациентов была диагностирована аутосомно-доми-нантная форма БАС, ассоциированная с мутацией SOD-1, у 1 пациента — без мутации SOD-1, у 3 пациентов был выявлен аутосомно-рецессивный семейный БАС, ассоциированный с мутацией SOD-1), а у 56 (90,3%) — спорадическим. Исходя из классификации по клинической картине среди пациентов с семейным БАС в 3 случаях была диагностирована бульбарная форма БАС, в 1 — высокая (церебральная), в 1 — шейно-грудная и в 1 пояс-нично-крестцовая; среди пациентов со спорадическим БАС — 6 больных БАС имели высокую (церебральную) форму, 16 — бульбарную форму, 7 — шейно-грудную форму, 33 — пояснично-крестцовую форму.
Одна пациентка с семейным БАС за период наблюдения была переведена на аппарат ИВЛ, и, находясь на аппаратном дыхании, в течение 2 лет продолжила свое пребывание в исследовательской группе. Стимуляцию Г-КСФ все пациенты с БАС, несмотря на тяжесть состояния, перенесли удовлетворительно.
Мембранный иммунофенотип ГСК оценивали с использованием многопараметровой проточной цитометрии (FACScan, Becton Dickinson, США) по мембранным антигенам (белковым маркерам мембранной поверхности, БММП) CD38, CD71, CD90, CD56, CD19, CD61 ,CD 117, СD10 и др. во фракции CD34+-клеток (табл. 1 ), профилировали уровень экспрессии основных маркеров клеточной поверхности различных субпопуляций ГСК, анализировали специфические молекулярно-биологические изменения полученного профиля и трактовали выявленные нарушения БММП ГСК, как нейроспецифический профиль молекулярного ландшафта клеточной поверхности ГСК при БАС.
Статистический анализ полученных данных проведен в программе SPSS версия 17 для Windows. При обработке материала использованы: функция частот для описания последовательных рядов переменных, средних значений, медианы, стандартной ошибки средних значений и вариабельности значений переменных; функция бивариантных корреляций для определения
таблица 1. Характеристика антигенов и моноклональных антител для определения экспрессии маркеров мембранной поверхности ГСК
Антиген (кластер дифференцировки) Клон/класс Производитель
Gp105-120 (CD34) HPCA-2/8G12/IgG1, к Becton Dickinson, США
Leukocyte common antigen (CD45) Hl30/IgG1, к Becton Dickinson, США
ICAM-3 (CD50) TU41/IgG2b, к Immunotech, Coulter, Франция
HLA-DR L243IgG2a, к Coulter, Франция Becton Dickinson, США
CD38 HLT2, HB7/IgG1, к Becton Dickinson, США
Thy-1 (CD90) 5E10/IgG1, к Immunotech, Coulter, Франция
c-kit (CD117) YB5.B8/IgGr к Becton Dickinson, США
N-CAM (CD56) B159/IgG1, к Becton Dickinson, США
Transferrin receptor CD71 M-A712/IgG2a, к Coulter, Франция Becton Dickinson, США
CD13 L138/IgG1, к Becton Dickinson, США
CD33 P67.6/IgG1, к Becton Dickinson, США Coulter, Франция
Integrinß3 chain (CD61) RUU-PL7F12/IgG Becton Dickinson, США
CD19 4G7 Coulter, Франция
CD7 M-T701/IgG1, к Immunotech, Coulter, Франция
CD57 HNK-1/IgM Becton Dickinson, США
LFA-2 RPA-2.10/IgG1 Becton Dickinson, США
CD10 HI10a/IgG2a Becton Dickinson, США
Glycophorin A №236а) GA-R2 (HIR2)/IgG2b, к Immunotech, Coulter, Франция
СD28 CD28.2/IgG1, к Becton Dickinson, США
CD300 UP-D1/IgG1, к Becton Dickinson, США
CD11b ICRF44/IgG1, к Becton Dickinson, США
CD123 9F5/IgG1, к Becton Dickinson, США
CD185 RF8B2/IgG2b, к Becton Dickinson, США
CD2 RPA-2.10/IgG1, к Becton Dickinson, США
CD81 JS-81/IgG1, к Becton Dickinson, США
коэффициента корреляции двух независимых переменных (корреляция достоверна при р< 0,05); функции сравнения средних значений независимых и зависимых переменных (доверительный интервал — 95%); функция кодирования переменных в соответствии с интервалами значений выбранной переменной.
результаты
В 147 образцах мононуклеарной фракции стимулированной ПК определяли экспрессию мембранных антигенов, ассоциированных с ГсК различного уровня дифференцировки. Данные по среднему количеству изученных субпопуляций ГСК представлены в табл. 2. и в виде диаграммы (рис. 1 ), которые наглядно иллюстрируют статистическую достоверность изменения про-теомного состава мембранных белков ГсК пациентов с БАС относительно здоровых доноров. Установлены отличия в субпопуляционном составе мобилизованных ГСК здоровых доноров и больных БАС, за исключением Н_А-ОП+-ГСК, количество которых было приблизительно одинаковым как у больных, так и у доноров (табл. 2).
Анализ субпопуляционного состава мобилизованных ГСК доноров и больных БАС на диаграмме (рис. 1) выявил несколько критичных отличий субпопуляционного
рис. 1. Усредненный протеомный профиль маркеров клеточной поверхности гемопоэтических стволовых клеток у здоровых доноров (n=54, красный, норма) и больных БАС (n=62, синий)
состава ГСК здоровых доноров и больных БАС. У всех больных БАС на поверхности клеточных мембран ГСК была резко снижена экспрессия белковых маркеров CD38, СйЭЭ, CD117 и CD71; отмечена незначительная экспрессия маркеров СD56, CD28, CD300, CD185 и зарегистрировано повышение экспрессии маркеров CD61, CD2, и CD81.
Таблица 2. Субпопуляции С1334+-клеток (процент АГ+ клеток в пределах суммарного пула ГСК) у больных БАС и здоровых доноров
Антиген (АГ) Группа Среднее± ст. ошибка Медиана Разброс Кол-во больных (п) Р
С1345 БАС 89,20±1,40 87,5 80,3-100,0 62
Доноры 70,40±3,40 77,9 1,5-100,0 54 0,0500
Н1_А-йР БАС 95,10±0,31 95,0 85,7-98,0 62
Доноры 92,90±1,10 94,0 74,4-99,9 29 0,0010
С038 БАС 20,10±2,63 20,0 14,5-26,0 62
Доноры 65,00±4,60 71,5 22,2-97,6 32 0,0010
С033 БАС 24,30±3,05 25,0 13,6-44,8 62
Доноры 67,60±4,70 75,5 7,1-99,0 24 0,0001
С013 БАС 78,70±1,97 78,1 1,0-100,0 20
Доноры 90,30±1,90 92,4 50,0-99,5 28 0,0090
С1371 БАС 16,10±1,12 16,0 10,6-44,3 18
Доноры 78,70±4,90 88,9 9,8-98,4 25 0,0001
Сй117 БАС 69,00±3,35 24,1 13,1-97,5 20
Доноры 79,60±3,90 82,4 48,4-97,5 16 0,0030
С090 БАС 26,40±3,26 24,0 0,1-49,5 20
(ТИу-1) Доноры 41,90±6,80 28,4 0,4-92,4 26 0,0200
С1350 БАС 98,10±0,34 99,0 84,9-100,0 15
Доноры 98,10±0,60 96,9 92,4-100,0 18 0,0010
С1356 БАС 0,60±1,09 0,6 0,0-5,0 25
Доноры 28,70±12,80 5,4 0-92,6 9 0,0100
С019 БАС 3,01±0,56 2,5 0,4-6,2 16
Доноры 15,40±4,40 6,3 0,0-86,1 26 0,0100
С061 БАС 2,47±0,30 24,5 0,0-40,3 16
Доноры 10,60±2,30 6,4 2,7-28,0 13 0,0050
С137 БАС 1,50±0,40 2,3 0,0-4,0 25
Доноры 11,20±3,80 4,5 0-98,1 28 0,0500
При профилировании маркеров белков мембранной поверхности ГСК в случаях семейного БАС у всех больных были отмечены иммуноспецифические особенности антигенов поверхности ГСК, но отличия между больным БАС и здоровыми родственниками были, как правило, минимальными (рис. 2). Из рис. 2А видно, что, несмотря на расхождения по ряду антигенов, общая тенденция профиля БММП ГСК здоровой сестры больной БАС на ИВЛ по показателям Сй117+С033+С028+С0300+С011Ь +С13123+ напоминает профиль БММП ГСК больной БАС и отличается только количественными параметрами. Однако при семейном БАС различия в количестве С1338+ предшественников были существенными: экспрессия С038+у больной БАС была снижена в 3-4 раза по сравнению со здоровыми донорами, а у здорового родственника больной экспрессия данного антигена была близка к норме (рис. 2). Популяция ГСК, преобладающая у здоровых доноров, характеризует моноцитарную направленность дифференцировки клеток-предшественниц. На рис. 2Б видны протеомные изменения ГСК у здорового брата 45 лет больной С., аналогичные изменению профиля БММП ГСК больной БАС с небольшими расхождениями по антигенам ГСК. Профиль антигенов ГСК здоровых и больных членов семьи носителей БАС носит
схожий характер и у здоровых членов семьи носителей БАС очень напоминает общий иммунофенотипический профиль БММП ГСК всех больных БАС.
При анализе иммунофенотипического профиля ГСК больных спорадическим БАС с разными формами заболевания (высокой, бульбарной, пояснично-крест-цовой) были получены отчетливые иммуноспецифи-ческие изменения протеомного профиля антигенов клеточной поверхности ГСК, характерные для БАС в целом, но не специфичные для формы болезни (рис. 3). У больных со спорадическим БАС общая тенденция профиля БММП ГСК была близка к профилям больных с семейным вариантом и профилям их родственников по антигенам Сй117+С033+С028+С0300+С011Ь +С13123+ и отличалась от профилей здоровых доноров, не являющихся родственниками больных БАС (рис. 2, 3).
таким образом, имеются реальные предпосылки для возможности молекулярно-биологической диагностики БАС до появления первых клинических признаков: по диаграмме иммунофенотипического профиля ГСК можно диагностировать заболевание задолго до того, как появится клиническая и нейрофизиологическая манифестация болезни у больного семейным и спорадическим БАС.
рис. 2. Иммунофенотический профиль белковых мембранных маркеров гемопоэтических стволовых клеток при семейном БАС: А — больная БАС на ИВЛ (красный), здоровая старшая сестра больной БАС на ИВЛ (синий), здоровые доноры (n=54, зеленый, норма); Б — больная С. с бульбарной формой БАС (сиреневый), здоровый брат больной С. (синий), усредненные показатели пациентов с БАС (n=62, красный), здоровые доноры (n=54, зеленый)
обсуждение
Нами были проведены многолетние исследования поверхностных антигенов ГСК и гемопоэтических про-гениторов у небольшого количества больных с БАС, которые, однако, позволяют исключить ошибку малых чисел, сделать верные и статистические обоснованные выводы. Ранее мы показали в эксперименте, что изменения в геноме ГСК приводят к изменениям про-теомной структуры клетки на уровне белков клеточной мембраны, цитоплазматических и ядерных белков [37, 38]. Протеомное картирование ГСК и профилирование их белков мы осуществляли классической масс-спектрометрией ГСК. такой анализ для выявления всего спектра патоспецифических изменений в клетках является дорогостоящим и длительным, используется только в поисковых научно-исследовательских работах, практически не может широко применяться в клинике и быть рабочим инструментом ранней диагностики БАС, поэтому нужна простая и достаточно надежная система молеку-лярно-биологических маркеров ранней диагностики.
Предложенная нами ранняя диагностика БАС основана на патоспецифических протеомных изменениях (модификации) профиля экспрессии БММП ГСК у больных с БАС, как самого раннего объективного признака возникновения несостоятельности (недостаточности) иммунной системы, которые и могут стать основными маркерами раннего диагностирования болезни. Доказательством этого научного факта стали статистически достоверные данные настоящего исследования о нейроспецифической модификации протеомного иммунофенотипического профиля мембранной поверхности ГСК у пациентов, которые позволили провести сравнительный анализ результатов исследования экспрессии мембранных белков ГСК у больных с нейроде-генеративными заболеваниями и здоровых доноров. На основании полученных данных были определены фундаментальные различия между экспрессией маркеров клеточной поверхности ГСК больных БАС и здоровых людей (доноров), не имеющих клинических и лабораторных признаков заболевания.
В наших предыдущих работах мы описали механизм межклеточного обмена между мутантными опухолевыми клетками и ГСК [37-39]. Полагаем, что на опухолях нами был выявлен уникальный системный информационно-коммутационный молекулярно-биологический механизм межклеточного взаимодействия ГСК с тканеспецифич-ными системами мутировавших клеток, который является универсальным инструментом информационного межклеточного обмена и в полной мере может отражать
рис. 3. Иммунофенотический профиль при спорадическом БАС: больная З. с высокой (центральной) формой (синий), больной С. с пояснично-крестцовой формой (красный), больная С. с бульбарной формой (сиреневый), брат больной С. без клинических проявлений (голубой), усредненный иммунофенотипический профиль при БАС (оранжевый) и в норме (зеленый)
процесс информационных межклеточных взаимодействий при БАС, где ГСК с мутацией БОО-1 встречается с клетками нервной ткани в зоне повреждения ГЭБ, и все процессы происходящего межклеточного обмена идентичны процессам при онкологическом заболевании [37-39]. Но, любая мутация в геноме ГСК приводит к появлению иммуноспецифичных транскриптомных и протеомных нарушений в картированном белковом профиле клетки и будет обязательно отражена на протеомном ландшафте мембраны ГСК и при БАС. Действительно, мы обнаружили на мембранной поверхности ГСК у больных с БАС очень специфичный иммунофенотипический профиль молекулярных белков мембранной поверхности ГСК, отличающийся по маркерам мембранной поверхности ГСК от здоровых доноров и названный нами как нейроспецифический, а недостаточность иммунной системы при БАС мы обозначили как нейродегенеративную недостаточность иммунной системы. Принципиальным в отношении изучения субпопуляций ГСК при БАС с клинической точки зрения является вопрос, насколько вклад каждой из субпопуляций ГСК определяет эффект нейроспецифической модификации ГСК в целом и участвует в формировании аутореактивности ГСК и ее потомков. Преобладание той или иной субпопуляции может оказаться существенным в отношении ранней диагностики различных форм БАС, и это надо изучать дополнительно.
Не вызывает сомнения, что представленные нами экспериментальные данные о возможной ранней диагностике БАС на основе изучения ландшафта маркеров клеточной поверхности требуют дальнейшего уточнения и глубокого фундаментального анализа. Но уже сегодня эти исследования демонстрируют реальную возможность ранней диагностики БАС и позволяют прогнозировать возможность развития болезни у членов семьи больных, несущих в своих ГСК протеомные изменения молекулярной клеточной структуры, без проведения дорогостоящих генетических исследований типа геноти-пирования. Очевидно, что накопление в ГСК у пациентов с семейным вариантом заболевания патологических белков, обусловленных SOD-1 или Fus мутациями мотонейронов, приводит к углублению протеомных отличий маркеров клеточной поверхности ГСК, и цитофлюори-метрический анализ маркеров этих клеток позволит на самых ранних этапах болезни диагностировать начавшийся процесс дегенерации в моторных нейронах еще до начала манифестации болезни специфическими клиническими нарушениями и станет верифицироваться, как повреждение мотонейронов в спинном или головном мозге человека-носителя этой патологической мутации. Нам представляется, что после углубленного изучения данного феномена и его достаточного статистического подтверждения этот диагностический тест станет краеугольным камнем в ранней диагностике БАС и позволит по-новому посмотреть на это заболевание, мониториро-вать возможность развития дегенерации в ЦНС на самых ранних этапах и остановить болезнь на ранних подступах.
Очевидно, что установленные нами научные факты про-теомных нарушений в ГСК у пациентов с семейным БАС позволяют утверждать, что первичными являются геномно-протеомные изменения в ГСК, которые мы диагностируем у родственников больных БАС, не имеющих клинической манифестации, а только потом наступают нейродегенера-тивные изменения в мотонейронах. Геномно-протеомные нарушения ГСК так же первичны и при спорадическом БАС и возникают в результате воздействия этиологических факторов болезни на костный мозг пациента и ГСК, циркулирующие в периферической крови.
Если принять нашу гипотезу, что БАС — это не болезнь моторного нейрона, а геномно-протеомная болезнь ГСК, то становятся понятными механизмы неэффективности терапии БАС стандартными способами, применяемыми для лечения аутоиммунных заболеваний. При большинстве аутоиммунных заболеваний (рассеянный склероз и рассеянный энцефаломиелит, системная красная волчанка, ревматоидный артрит и т. д.) ГСК здорова, а аутоиммунная реактивность собственных лимфоцитов к ней-роспецифическим белкам нервной ткани формируется локально в периферических лимфоцитах. Следовательно, подавление их глюкокортикоидами и(или) иммуносупрес-сией, а также блокирование моноклональными антителами их секретомов в виде токсических цитокинов приводит к уменьшению их циркулирования в периферической крови и понижению уровня эксайтотоксичности, уменьшению аутореактивности и замещению их здоровыми потомками здоровой ГСК. Именно поэтому и работает аутогенная ТКМ и наступает полная длительная ремиссия болезни. В основе БАС и ряда похожих заболеваний лежит
патологическая мутантная ГСК с измененным протеомом, которая постоянно производит аутореактивных к нервной ткани ИКК, потомков геномно-эпигеномно поврежденной ГСК. АутотКМ в этих случаях не эффективна, как не эффективна иммуносупрессия иммунодепрессантами и глюкокортикоидными гормонами. Если принять, что БАС это генетически и эпигенетически наследственно детерминированное или приобретенное протеомное аутоиммунное заболевание ГСК, то этот научный факт объяснит неэффективность стандартной аутоиммунной терапии БАС и трансплантации собственных ГСК.
заключение
Новая методология ранней диагностики БАС позволяет структурировать инновационные подходы к геномным и постгеномным технологиям в диагностике и терапии БАС и определить молекулярно-биологические цели и мишени в лечении этих заболеваний. Наиболее вероятно, БАС может быть потенциально остановлен путем стандартной аллогенной гаплоидентичной (близкородственной) ТКМ. При терапии БАС аллоТКМ способна остановить прогрессирование смертельной болезни и предотвратить неизбежный летальный исход пациента, а последующее нейровосстановление поврежденных мотонейронов может быть проведено с применением всего арсенала биомедицинских клеточных продуктов (БМКП), предназначенных для нейрорегенерации. Использовать аутогенные и аллогенные БМКП, содержащие ГСК, мезенхимальные стромальные СК и ней-ральные СК при БАС без остановки прогрессирования болезни малоэффективно и методологически ошибочно. Будущее терапии БАС мы видим в редактировании генома аутогенной ГСК и ее последующей трансплантации по протоколам ТКМ, а также в создании аутогенных генетически однородных клеточно-инженерных ГСК с гомотопной субституцией (равнозначной заменой) генома на геном здоровых соматических клеток и региональных СК негемопоэтического ряда. Возможно, что при БАС блокирование белков SOD-1 и FUS в аутоГСК позволит реализовать стратегию аутоТКМ с сайт-редактированными аутогенными ГСК. Эти биотехнологии в недалеком будущем при БАС могут стать биотехнологической платформой полного излечения от БАС и, возможно, еще целого класса инвалидизирующих ней-родегенеративных заболеваний человека. Однако дальнейшие исследования требуют значительно больших выборок пациентов и расширенной экспериментальной проверки установленных научных фактов. Важно отметить, что возможно и большинство других нейродегене-ративных заболеваний (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, системные корковые атрофии и т. д.) имеют аналогичный аутоиммунный этиопатогенез, основанный на геномно-протемных изменениях в ГСК этих больных.
Благодарности
Работа выполнена в инициативном порядке в рамках научных исследований по отраслевой программе Российской академии наук «Новые клеточные технологии — медицине» при финансовой и административной поддержке ЗАО Клиника «НейроВита» (Россия, Москва). Конфликта интересов в рамках проводимой работы нет.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Васенина Е.Е., Трусова Н.А., Ганькина О.А. и соавт. Комбинированная терапия болезни Альцгеймера. Современная терапия в психиатрии и неврологии 2013; 2: 10-4. (Vasenina E.E., Trusova N.A., Gankina O.A. et al. Combined therapy of the Alzheimer's disease. Contemporary Therapy in Psychiatry and Neurology 2013; 2: 10-14.
2. Centers for Disease Control and Prevention. Alzheimer's Disease and Healthy Aging, https://www.cdc.gov/aging/aginginfo/alzheimers.htm.
3. Huang H., Raisman G., Sanberg P.R. et al., editors. Neurorestoratol-ogy. Volume 2: Clinical Progress of Neurorestoratology. New York: Nova Science Publishers; 2015.
4. Завалашин И.А., ред. Боковой амиотрофический склероз. Москва: ГЭОТАРМЕДИА; 2009. (Zavalishina I.A., editor. Amyotrophic lateral sclerosis. Moscow: Gheotarmedia; 2009).
5. Штульман Д.Р. Боковой амиотрофический склероз. В: Яхно Н.Н., ред. Болезни нервной системы. Москва: Медицина; 2005. т. 1, с. 649-58. (Shtulman D.R. Amiotrophic lateral sclerosis. In: Yakhno N.N., editor. The diseases of nervous system. Moscow: Meditsina; 2005. v. 1, p. 649-58).
6. Висурханова С.А., Жуанышева Э.М., Мустафина Р.М. и др. Клинический случай шейной формы бокового амиотрофического склероза. В: Сборник статей по материалам XII международной научно-практической конференции «Научный форум: Медицина, биология и химия». Москва: МЦНО; 2018; 4(12): 43-50. (Visurkhanova S.A., Zhuanysheva E.M., Mustafina R.M. et al. A clinical case of the amyotrophic lateral sclerosis. In: Proceedings of the 12th International Conference "Scientific Forum: Medicine, Biology and Chemistry". Moscow: MTsNO; 2018; 4(12): 43-50).
7. Хондкариан О.А. Боковой амиотрофический склероз. Москва: Медгиз; 1957. (Khondkarian O.A. Amyotrophic lateral sclerosis. Moscow: Medgiz; 1957).
8. Bourke S.C., Bullock R.E., Williams T.L. et al. Noninvasive ventilation in ALS: indications and effect on quality of life. Neurology 2003; 61(2): 171-7.
9. Bourke S.C., Tomlinson M., Williams T.L. et al. Effects of non-invasive ventilation on survival and quality of life in patients with amyotrophic lateral sclerosis: a randomised controlled trial. Lancet Neurol. 2006; 5(2): 140-7.
10. Ng L., Talman P., Khan F. Motor neuron disease: disability profile and service needs in an Australian cohort. Int. J. Rehabil. Res. 2011; 34(2): 151-9.
11. Dion P.A., Daoud H., Rouleau G.A. Genetics of motor neuron disorders: new insights into pathogenic mechanisms. Nature Reviews Genetics 2009; 10(11): 769-82.
12. Егоркина О.В., Гапонов И.К. Клинический подход к лечению нейродегенеративных заболеваний с деменцией. Междунар. неврол. журн. 2007; 1: 111-7. (Yeghorkina O.V., Gaponov I.K. Clinical approach to the therapy of the neurodegenerative disease with dementia. International Neurological Journal 2007; 1: 111-7).
13. Брюховецкий А.С., Хотимченко fO.C. Стволовые клетки и регенеративная медицина в лечении нервных болезней. Том I. Теоретические, фундаментальные и общие аспекты применения стволовых клеток и технологий регенеративной медицины в лечении нервных болезней: руководство для врачей. Владивосток: Дальнаука; 2018. (Bryukhovetskiy A.S., Khotimchenko Y.S. Stem cells and regenerative medicine in the therapy of the neural diseases. V.1. Theoretic, fundamental and general aspects of cell therapy and technologies of regenerative medicine in the therapy of the neural diseases. Vladivostok: Dalnauka; 2018).
14. Chew J., Gendron T.F., Prudencio M. et al. Neurodegeneration. C9ORF72 repeat expansions in mice cause TDP-43 pathology, neuronal loss, and behavioral deficits. Science 2015; 348(6239): 1151-4.
15. Haramati S., Chapnik E., Sztainberg Y. et al. miRNA malfunction causes spinal motor neuron disease. PNAS USA 2010; 107: 1311-6.
16. Rosen D.R., Siddique T., Patterson D. et al. Mutations in Cu/ Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature 1993; 362(6415): 59-62.
17. Deng J., Yang M., Chen Y. et al. FUS interacts with HSP60 to promote mitochondrial damage. PLoS Genet. 2015; 11(9): e1005357.
18. Yu Y., Chi B., Xia W. et al. U1 snRNP is mislocalized in ALS patient fibroblasts bearing NLS mutations in FUS and is required for motor neuron outgrowth in zebrafish. Nucleic Acids Res. 2015; 43(6): 3208-18.
19. Highley J.R., Kirby J., Jansweijer J. A. et al. Loss of nuclear TDP-43 in amyotrophic lateral sclerosis (ALS) causes altered expression of splicing machinery and widespread dysregulation of RNA splicing in motorneu-rones. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2014; 40(6): 670-85.
20. Aulas A., Vande Velde C. Alterations in stress granule dynamics driven by TDP-43 and FUS: a link to pathological inclusions in ALS? Front Cell Neurosci. 2015; 9: 423.
21. Riley J., Glass J., Feldman E.L. et al. Intraspinal stem cell transplantation in amyotrophic lateral sclerosis: a phase I trial, cervical microinjection, and final surgical safety outcomes. Neurosurgery 2014; 74(1): 77-87.
22. Gordon P.H. Amyotrophic lateral sclerosis: an update for 2013 clinical features, pathophysiology, management and therapeutic trials. Aging Dis. 2013; 4(5): 295-310.
23. Haverkamp L.J., Appel V., Appel S.H. Natural history of amyotrophic lateral sclerosis in a database population. Validation of a scoring system and a model for survival prediction. Brain 1995; 118(Pt 3): 707-19.
24. Guegan C., Przedborski S. Programmed cell death in amyotrophic lateral sclerosis. J. Clin. Invest. 2003; 111(2): 153-61.
25. Radunovic A., Mitsumoto H., Leigh P.N. Clinical care of patients with amyotrophic lateral sclerosis. Lancet Neurology 2007; 6(10): 913-25.
26. Pasinelli P., Houseweart M.K., Brown R.H. Jr. et al. Caspase-1 and -3 are sequentially activated in motor neuron death in Cu, Zn superoxide dismutase-mediated familial amyotrophic lateral sclerosis. PNAS USA 2000; 97(25): 1390-6.
27. Брюховецкий А.С., Хотимченко Ю.С., Хунюнь Хуанг и др. Стволовые клетки и регенеративная медицина в лечении нервных болезней Том II. Клинические аспекты применения стволовых клеток и технологий регенеративной медицины при некоторых заболеваниях и повреждениях центральной нервной системы. Владивосток: Дальнаука; 2018. (Bryukhovetskiy A.S., Khotimchenko Y.S., Huang H. et al. Stem cells and regenerative medicine in the therapy of the neural diseases. V. 2. Clinical aspects of the use of the stem cells and regenerative medicine technologies in some of the diseases and damages of the central nervous system. Vladivostok: Dalnauka; 2018).
28. Rosenberg S.A. Cell transfer immunotherapy for metastatic solid cancer — what clinicians need to know. Nature Rev. Clin. Oncol. 2011; 8(10): 577-85.
29. Qi H., Liu S., Guo C. et al. Role of annexin A6 in cancer. Oncol. Lett. 2015; 10(4): 1947-52.
30. Pasinelli P., Brown R.H. Molecular biology of amyotrophic lateral sclerosis: insights from genetics. Nat. Rev. Neurosci. 2006; 7(9): 710-23.
31. Buratti E., Baralle F.E. The molecular links between TDP-43 dysfunction and neurodegeneration. Advances in Genetics 2009; 66: 1-34.
32. Bryukhovetskiy A.S., Bryukhovetskiy I.S. Сytoregulatory therapy of brain glial tumors. In: Proceedings of the XXth World Congress of Neurology; 2011 Nov 12-17; Marrakesh, Morocco; 2011. p. 49.
33. Rose J.A., Erzuram S., Asosingh K. Biology and flow cytometry of pro-angiogenic hematopoietic progenitor cells. Cytometry A 2015; 87(1): 5-19.
34. Morita Y., Ema H., Nakauchi H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. J. Exp. Med. 2010; 207: 1173-82.
35. Гривцова Л.Ю., Тупицын Н.Н. Мобилизованные стволовые кроветворные клетки: аутологичная и аллогенная трансплантация в онкологической практике. Иммунология гемопоэза 2017; 1: 3-63. (Grivtsova L.Y., Tupitsyn N.N. Mobilized hemopoietic stem cells: autologous and allogeneic transplantation in oncology practice. Haematopoiesis Immunology 2017; 1: 3-63).
36. Frolov A.A., Bryukhovetskiy A.S. Effect of hematopoietic autologous stem cell transplantation to the chronically injured human spinal cord evaluated by motor and somatosensory evoked potentials methods. Cell Transplantation 2012; 21 Suppl 1: 49-55.
37. Милькина Е.В., Мищенко П.В., Зайцев С.В. и др. Особенности взаимодействия между гемопоэтическими стволовыми и опухолевыми клетками различных линий in vitro. Гены и клетки 2016; 11(3): 63-71. (Milkina E.V., Miscshenko P.V., Zaytsev S.V. et al. Features of interaction between hematopoietic stem and tumor cells of different lines in vitro. Genes and Cells 2016; 11(3): 63-71).
38. Брюховецкий А.С. Клиническая онкопротеомика: протеом-основанная персонифицированная противоопухолевая клеточная терапия. Москва: Полиграф Плюс; 2013. (Bryukhovetskiy A.S. Clinical oncoproteomics: proteome-based personalized anti-tumor cell therapy. Moscow: Polygraph Plus; 2013).
39. Брюховецкий И.С., Мищенко П.В., Брюховецкий А.С. и др. Взаимодействие гемопоэтических стволовых и опухолевых клеток in vitro. Тихоокеанский медицинский журнал 2014; 4: 31-7. (Bryukhovetskiy I.S., Mishchenko P.V., Bryukhovetskiy A.S. et al. Interaction of the hematopoietic stem cells and tumor cells in vitro. The Pacific Medical Journal 2014; 4: 31-7).
Поступила: 18.12.18
