CC BY
88
106
Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского)
федерального университета
Генетически модифицированные мононуклеары пуповинной крови — стимуляторы нейрорегенерации при дегенеративных заболеваниях центральной нервной системы
Д.С. Гусева 12, А.А. Ризванов 1, А.П. Киясов 1, Р.Р. Исламов 2 1Казанский (Приволжский) Федеральный Университет, Казань 2 Казанский государственный медицинский университет, Казань
Genetically modified human umbilical cord blood mononuclear cells as potential stimulators of neuroregeneration in degenerative disorders of central nervous system
D.S. Guseva 1-2, A.A. Rizvanov1, A.P. Kiyasov1, R.R. Islamov2
1 Kazan Federal University, Kazan
2 Kazan State Medical University, Kazan
Генно-клеточная терапия представляет собой новый этап в лечении пациентов с различными заболеваниями, связанными с патологией цетральной нервной системы. В данном обзоре мы рассматриваем последние достижения в области трансплантация мононуклеарных клеток пуповинной крови — наиболее доступного источника стволовых клеток — с целью повышения жизнеспособности нервных клеток и стимулирования нейрорегенерации. Как наиболее эффективная терапия для лечения нейродегенеративных заболеваний рассматривается генетическая модификация клеток пуповинной крови для оптимальной доставки нейропротекторных факторов и факторов роста в области нервной системы, подверженные дегенерации в процессе заболевания. Основным вопросом, которому посвящен данный обзор, является терапия бокового амиотрофического склероза — прогрессирующего нейродегенеративного заболевание ЦНС с выраженным поражением двигательных нейронов коры и ствола головного мозга, а также мотонейронов спинного мозга — с использованием генетически модифицированных клеток пуповинной крови. Исследования последних лет указывают на возможность дифференци-ровки трансплантированных модифицированных клеток пуповинной крови в макрофаги, эндотелиальные клетки или астроциты на модели бокового амиотрофического склероза у мышей, тем самым создавая мощную платформу для поддержки дегенерирующих нейронов, структурного и функционального восстановления мозга после нейротравм, ишемических инсультов и при различных нейродегенеративных заболеваниях.
Ключевые слова: генно-клеточная терапия, монону-клеарные клетки пуповинной крови, боковой амиотрофический склероз.
Введение
Регенерация и методы её стимулирования для практической медицины — одна из актуальнейших проблем, этим вопросам посвящены и фундаментальные исследования, и прикладные биомедицинские разработки, и наблюдения клиницистов. Поскольку регенеративные способности тканей, органов и организмов значительно различаются, получены разнообразные модельные системы, в которых изучают процессы регенерации и разрабатывают методы её стимуляции на молекулярном, клеточном и тканевом уровнях.
«Регенеративная медицина» направлена на воссоздание утраченных тканей и (или) органов и восстановление их функций. Один из основных методов
e-mail: rizvanov@gmail.com
Gene-cell therapy is a new step for the treatment of different human disorders including central nervous system degenerative diseases. In this review we focused on the last challenges in the field of human umbilical cord blood mononuclear cells transplantation — an attempt to support neuronal cells survival and to stimulate the neuroregeneration. As a potential therapy for the treatment of neurodegenerative diseases we reviewed the latest advances in gene modification of human umbilical cord blood mononuclear cells as a novel tool for the effective delivery of neuroprotective factors and growth factors in the injured or degenerative areas of the central nervous system under pathological conditions. The main topic of this review is the potential therapy of the amyotrophic lateral sclerosis — the progressive neurodegenerative disorder affecting primarily upper and lower motoneurons — by using genetically modified human umbilical cord blood mononuclear cells. The results from the up-to-date experiments indicated the opportunity to obtain differentiated macrophages, endothelial cells, or astrocytes from the genetically modified human umbilical cord blood mononuclear cells after their transplantation in the mouse model of the amyotrophic lateral sclerosis. Taken together, these data build the high-capacity platform for the supporting of degenerating neurons, structural and functional recovery of the brain and spinal cord after trauma, ischemia and other neurodegenerative disorders.
Key words: gene-cell therapy, umbilical cord blood, mononuclear cells, amyotrophic lateral sclerosis.
в регенеративной медицине — трансплантация различных видов стволовых клеток. Наиболее частое применение в сфере клеточной терапии получила аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) для лечения злокачественных и доброкачественных заболеваний кроветворной системы [1, 2]. ГСК получают из красного костного мозга, периферической крови и, всё чаще и чаще, из пуповинной крови [3]. Множество исследований, посвящённых поиску доступных источников стволовых клеток, доказали целесообразность применения мононуклеарных клеток пуповинной крови (МКПК) не только для коррекции гематологических нарушений, но и для стимуляции регенерации разных тканей и органов при ишемических и дегенеративных заболеваниях.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013
Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского)
федерального университета
107
Клетки пуповинной крови легко доступны, они наименее иммуногенны в сравнении со стволовыми клетками кроветворной системы взрослого организма [4—6]. Мононуклеарная фракция крови пуповины содержит популяции разных стволовых клеток, способных к дифференцировке во многие клеточные типы; иными словами, они могут рассматриваться как альтернатива эмбриональным стволовым клеткам [7], в т.ч. и при лечении постишемических, посттравматических и дегенеративных заболеваний [8, 9]. Что немаловажно, привлекает юридическая и этическая возможность применения МКПК в клинике.
На сегодняшний день в пуповинной крови выявлены гемопоэтические и негемопоэтические стволовые и прогениторные клетки [11, 12]. Последние представляют собой совокупность нескольких популяций: мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки [12], еще менее дифференцированные стволовые клетки с плюрипотентными свойствами, такие как неограниченно делящиеся соматические стволовые клетки (англ. unrestricted somatic stem cells, USSCs) [13] и «эмбриональные стволовые клетки» пуповинной крови [14, 15]. Кроме того, мо-нонуклеарная фракция пуповинной крови включает ранние предшественники эндотелиальных клеток, а также клетки SP (англ. side population), способные дифференцироваться в миогенном и кроветворном направлениях. Недавние исследования указывают также на возможность выделения из пуповинной крови предшественников олигодендроцитов [16].
Отмечено, что клетки пуповинной крови в качестве источника стволовых клеток начинают широко применяться в клинической практике. Вероятно, это связано с тем, что, во-первых, в отличие от клеток костного мозга, количество МКПК и их способность к дифференцировке не зависят от возраста донора и, во-вторых, практически исключается опухолевая трансформация МКПК в организме реципиента [17]. Кроме того, благодаря незрелости иммунной системы новорождённых, МКПК не требуют соответствия генов тканевой совместимости человека HLA, что подтверждается отсутствием острой или хронической формы болезни «трансплантат против хозяина» [18, 19], нередко возникающей при трансплантации клеток костного мозга. В настоящее время банки клеток пуповинной крови организованы по всему миру. В таких банках персонализированные образцы могут храниться бесконечно долго, представляя собой незаменимый клеточный материал для будущих терапевтических мероприятий. Успехи доклинических и клинических исследований по трансплантации клеток пуповинной крови вселяют надежду на скорое внедрение их в клиническую практику не только для лечения гематологической патологии, но и для терапии пациентов с негематологическими заболеваниями. Таким образом, пуповинная кровь как наиболее доступный ресурс различных популяций стволовых клеток, заслуживает особого внимания для разработки протоколов клеточной терапии в практике регенеративной медицины.
Трансплантация МКПК для повышения
жизнеспособности нервных клеток
и стимулирования нейрорегенерации
Одним из важнейших направлений в регенеративной медицине является лечение пациентов с патологией центральной нервной системы (ЦНС).
Нарушение функций головного и спинного мозга после ишемического инсульта, нейротравмы или в результате нейродегенеративных заболеваний требует врачебных действий, направленных на предотвращение дальнейшей гибели нервных клеток и повышения их жизнеспособности. Нейротрофические факторы и клетки нейроглии выступают в роли главных «защитников» подверженных патологическому процессу нейронов. Тот факт, что МКПК включают стволовые клетки, способные продуцировать нейротрофические факторы, а также моноциты (клетки-предшественницы микроглии) и эндотелиальные прогенитор-ные клетки, прямо указывает на целесообразность трансплантации МКПК для стимулирования нейрогенерации. При этом внутривенное введение МКПК отвечает условию минимальных инвазивных манипуляций на ЦНС и является целесообразным благодаря способности МКПК к миграции через гематоэнцефалический барьер.
Первая успешная трансплантация клеток пуповинной крови была выполнена у пациента с анемией Фанкони [10]. В настоящее время получены убедительные данные об эффективности трансплантации МКПК для терапии различных нозологических форм, в т.ч. нейродегенеративных заболеваний [20]. В многочисленных работах было установлено, что клетки пуповинной крови при культивировании в среде с нейрональными ростовыми факторами, у-интерфероном [21, 22] или ретиноевой кислотой [23, 24] способны к дифференцировке в нейрогенном направлении [24—29]. При блокировании гемопоэтической популяции клеток пуповинной крови была получена клеточная линия со свойствами нейральных стволовых клеток, которые при стимуляции фактором роста эпидермиса (EGF) были способны к спонтанной агрегации и диф-ференцировке в клетки, по своим свойствам сходные с нейронами, астроцитами и олигодендроцитами [28]. При культивировании in vitro на биодеградируемом материале в течение трёх недель МКПК формировали клеточные комплексы, содержащие стволовые клетки и пролиферирующие нейробласты. Мультиэлектродные чипы, на которые были высажены полученные комплексы, выявили способность МКПК дифференцироваться в нейроны, образующие функциональные сети и генерирующие спонтанные потенциалы действия [30].
Эффективность трансплантации МКПК для стимулирования нейрорегенерации активно исследуют в экспериментах на животных [31]. Трансплантация МКПК оказывает выраженный положительный эффект на выживание нервных клеток ЦНС. На модели болезни Альцгеймера у трансгенных мышей со сверх-экспрессией предшественника р-амилоида трансплантация МКПК продлевала жизнь экспериментальных животных [32]. После многократного внутривенного введения МКПК таким мышам произошло уменьшение астроцитоза и образования Р-амилоидных бляшек [33]. Данное улучшение было ассоциировано с активацией фагоцитарной активности клеток микроглии по отношению к р-амилоиду и активацией астроцитов, экспрессирующих глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) [33]. При трансплантации мышам с моделью болезни Альцгеймера стволовых мезенхимных клеток, полученных из пуповинной крови, было продемонстрировано восстановление когнитивных функций (памяти и обучения) [34].
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013
108
Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского)
федерального университета
На модели ишемического инсульта у грызунов показано, что после внутривенного введения МКПК у животных уменьшался объём инфаркта головного мозга и улучшался неврологический статус. Внутрибрюшинное введение человеческих МКПК новорождённым крысятам с гипоксической ишемией головного мозга также приводило к облегчению симптомов центрального паралича [35]. В зоне ишемии МКПК активизируют неоангиогенез, вызывают анти-апоптозный и противовоспалительный эффект [36—39]. Сй34+-клетки, полученные из пуповинной крови человека, участвуют в образовании новых сосудов в зоне ишемии, обеспечивая тем самым благоприятные условия для нейрорегенерации [40].
Положительный эффект МКПК на восстановление двигательных функций установлен и при травме спинного мозга у мышей и крыс [41—43]. Введение клеток пуповинной крови человека в кровоток после травмы спинного мозга угнетает воспалительную реакцию, оказывает нейротрофическое влияние, стимулирует неоваскуляризацию, снижает экспрессию проапоптозных генов и поддерживает выживание нейронов [44, 45].
Другим возможным механизмом положительного эффекта МКПК на нейрорегенерацию может служить их способность дифференцироваться в нейроны, астроциты и олигодендроциты [46]. Так, в условиях культивирования в среде, содержащей фактор роста фибробластов-8 (FGF-8), МКПК могут дифференцироваться в дофаминергические нейроны [47]. При трансплантации таких клеток в полосатое тело мозга крыс (с моделью болезни Паркинсона) установлено частичное восстановление симптоматического поведения, вызванного амфетамином [47, 48].
Биологически активные молекулы, секретиру-емые МКПК, также участвуют в стимулировании нейрорегенерации [49], так как МКПК продуцируют антиоксидантные, ангиогенные и нейротрофические факторы [38, 50-54]. В экспериментах in vitro при ко-культивировании МКПК и нейронов гиппокампа было показано, что МКПК экспрессировали молекулы адгезии (V-CAM-1, I-CAM-1, L-selectin, E-selectin) и факторы роста (G-CSF, GM-CSF, сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), мозговой нейротрофический фактор (BDNF), происходящий из нейроглии нейротрофический фактор (GDNF)) [55]. В связи с этими наблюдениями значительное количество исследователей сфокусировали внимание на способах доставки клетками пуповинной крови ростовых и нейротрофических факторов, таких как VEGF, BDNF и GDNF. Так, при трансплантации МКПК после травмы спинного мозга восстановление функциональных нарушений связывают с усилением экспрессии VEGF [53], а на модели ишемического инсульта — с нейропротекторным действием BDNF [56, 57]. Уровень экспрессии GDNF возрастает после трансплантации МКПК крысам с моделью ишемического инсульта [57, 58]. Противовоспалительное действие МКПК может быть обусловлено лимфоцитами, которые вырабатывают значительное количество интерлейкина-10 (IL-10) [59].
Генетическая модификация клеток
пуповинной крови для нейрорегенерации
Клеточная терапия — один из главных «инструментов» регенеративной медицины — в последнее
время активно разрабатывается. Трансплантация стволовых клеток может быть направлена как на замещение погибших клеток, так и на предотвращение дальнейшей гибели выживших клеток за счёт секретируемых биологически активных молекул. Усиление же цитопротекторного действия трансплантируемых клеток при помощи генетической модификации является сравнительно новым подходом в клеточной терапии [60—62], так как, во-первых, становится возможной адресная доставка нейропротекторных факторов (миграция трансплантированных клеток в места дегенерации) и, во-вторых, появляется возможность регулировать уровень секреции терапевтических молекул. Исходя из вышеизложенного, становится очевидным, что исследования, направленные на генетическую модификацию МКПК с целью доставки нейротрофических факторов в повреждённую область мозга, представляют собой обоснованный подход в клеточной терапии нейродегенеративных заболеваний.
Для генетической модификации трансплантируемых клеток в настоящее время существует два подхода: вирусный и невирусный. Невирусный (доставка в клетку плазмидной ДНК) наименее безопасен, но не достигает, как правило, высокой эффективности трансфекции и длительности экспрессии трансгена. Повышение эффективности трансфекции клеток in vitro проводят физическими (путём электропорации) или химическими методами (с помощью катионоактивных липидов) [63, 64]. Наиболее распространенным видом трансфекции in vivo является введение очищенной «голой» плазмидной ДНК с помощью инъекции [65]. К общепринятым вирусным векторам в исследованиях по генной терапии относятся вирус лейкемии мышей Молони (MoMLV), аденовирус серотипа-5 (Ad5) [63], адено-ассоциированный вирус (AAV) [66-68] и лентивирусы (HIV-1 и др.) [64]. По своей эффективности вирусные векторы превосходят плазмидные, но для некоторых из них обнаружены проблемы безопасности применения, связанные, во-первых, с риском инсерционного мутагенеза, вызываемого итеграцией ретровирусного генома в геном реципиента и, во-вторых, индуцированием потенциального иммунного ответа к векторным вирусным антигенам [69].
В терапии ишемических заболеваний генетически модифицированные МКПК применяют преимущественно для стимулирования ангиогенеза. Так, положительный терапевтический эффект был достигнут на модели хронической ишемии задней конечности у крыс после трансплантации МКПК, сверх-экспрессирующих человеческий ген vegf [60]. На модели инфаркта миокарда у крыс были испытаны полученные из МКПК гемопоэтические клетки (CD133+/CD34+), сверх-экспрессирующие два рекомбинантных гена — vegf и pdgf (ген фактора роста, полученного из тромбоцитов) [70], а также CD34+-клетки, сверх-экспрессирующие VEGF и ангиопоэтин-1 (Ang1) [61, 71]. Терапия инфаркта миокарда с помощью генетически модифицированных стволовых клеток уменьшала объём некроза сердечной мышцы, сдерживала развитие сердечной недостаточности и увеличивала плотность капилляров в миокарде.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013
Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского)
федерального университета
109
Терапия бокового амиотрофического склероза
при помощи генетически модифицированных
клеток пуповинной крови
Боковой амиотрофический склероз (БАС) — прогрессирующее нейродегенеративное заболевание ЦНС, обусловленное поражением двигательных нейронов коры и ствола головного мозга, а также мотонейронов спинного мозга. В результате паралича и последующей атрофии скелетных мышц смерть наступает от инфекций дыхательных путей или отказа дыхательной мускулатуры [72]. Гибель двигательных нейронов происходит вследствие патологического влияния нейромедиатора глутамата на постсинаптические нервные клетки и последующих процессов в виде оксидативного стресса, нарушений кальциевого гомеостаза, функций митохондрий и аксонного транспорта, а также в виде формирования белковых агрегатов в цитозоле [73—75]. Несмотря на то, что причины многих форм спорадического БАС остаются неясными, показано, что до 10% случаев БАС наследственны, и 20% из них — результат доминантной наследуемой мутации гена суперок-сиддисмутазы-1 (SOD-1) [76]. Существует линия трансгенных мышей со сверх-экспрессией мутантной формы SOD1 (мутация G93A), несущей замену в позиции 93 глицина на аланин. В результате прогрессирующей гибели мотонейронов спинного мозга у мышей развивается заболевание, имитирующее БАС человека [77].
Многие исследования последнего времени направлены на лечение БАС путём трансплантации стволовых клеток красного костного мозга и пуповинной крови. Так, на модели БАС у трансгенных мышей G93A при внутривенном введении МКПК развитие болезни замедляется на 2—3 нед., увеличивается продолжительность жизни животных [78]. Более того, определены оптимальные дозы клеток пуповинной крови, позволяющие как увеличить выживаемость мышей, так и максимально уменьшить содержание провоспалительных цитокинов в спинном и головном мозге [79]. Интраспинальное введение клеток пуповинной крови трансгенным мышам G93A с имитацией БАС до появления симптомов болезни сдерживает нарушения двигательной активности и продлевает сроки выживания экспериментальных животных [80]. Позитивный эффект связан с уменьшением гибели мотонейронов, снижением астроцитоза и увеличенной экспрессией белка теплового шока Hsp70 [81], что расценивают как проявление противовоспалительного эффекта клеток пуповинной крови [80]. В настоящее время проводится 2 фаза клинического исследования клеточной терапии БАС путём трансплантации больным ММСК, полученных из пуповинной крови (NCT01494480).
Стратегия генной терапии БАС направлена на поддержание жизнеспособности мотонейронов с помощью нейропротекторных факторов. Одним из путей доставки нейротрофических факторов к мотонейронам является применение вирусных векторов, несущих рекомбинантные терапевтические гены. Внутримышечное или интраневральное введение вирусов показало положительный эффект у мышей, но было недостаточным для доставки вектора в ЦНС более крупных видов лабораторных животных [82]. В связи с этим была испытана интратекальная инъекция, как наиболее прямой путь доставки гена в спинной мозг. Однако, несмотря на частично положительные
результаты, внутримышечная, интраневральная или интратекальная инъекции не позволяют осуществить доставку вектора во все отделы спинного мозга. В настоящее время внимание исследователей направлено на адено-ассоциированный вирусный вектор AAV9, который способен проникать через гематоэнцефалический барьер после внутривенного или ин-тратекального введения [83—85]. Так, при инъекции вектора AAV9 трансдукция мотонейронов отмечена и у крупных лабораторных животных [83, 86—89].
Более контролируемым процессом по сравнению с прямой генной терапией является доставка терапевтических генов на клеточных «носителях». Метод доставки терапевтических молекул с помощью клеточных носителей основан на трансплантации генетически модифицированных клеток, сверх-экспрессирующих рекомбинантные терапевтические гены [90]. Данный подход позволяет проследить конечный пункт миграции трансплантированных клеток и (при необходимости или нежелательных последствиях) остановить дальнейшую терапию генно-клеточным препаратом [91, 92].
К настоящему времени, однако, известно лишь небольшое количество работ, в которых на модели БАС у трансгенных мышей трансплантировали генетически модифицированные стволовые или прогениторные клетки различного происхождения [90]: миобласты, экспрессирующие GDNF [93], нейрональные клетки-предшественницы из коры головного мозга человека, генно-модифицированные для сверх-экспрессии GDNF [94, 95]; клетки почки новорождённого хомяка, содержащие вектор с геном цилиарного нейротрофического фактора человека [96, 97].
В наших исследованиях мы впервые показали, что мононуклеарная фракция МКПК, трансфеци-рованная геном vegf человека и геном мышиной молекулы адгезии L1 (L1CAM), введённая ретроорбитально 22-25-недельным трансгенным мышам с мутацией G93A, т.е. ещё до развития признаков заболевания, успешно мигрировали в паренхиму спинного мозга мышей, выживали более 3 мес. и дифференцировались в эндотелиальные клетки и клетки микроглии [98]. В следующей своей работе мы показали, что МКПК, трансфицированные двухкассетными плазмидными векторами pBud-VEGF-L1CAM были обнаружены в спинном мозге мышей G93A и, как было показано при помощи иммуфлуоресцент-ного анализа, также экспрессировали маркёры эндотелиальных клеток и клеток микроглии [99]. Ещё более поздние эксперименты, проведённые в нашей лаборатории, указывают на возможную дифферен-цировку генетически модифицированных МКПК, трансфицированных двухкассетными плазмидными векторами pBud-VEGF-FGF2, в S100 + -клетки [100]. Полученные нами результаты по трансплантации генетически модифицированных монононуклеарных клеток из пуповинной крови мышам SOD1-G93A свидетельствуют о том, что трансплантированные клетки (в зависимости от типа экспрессионного вектора в спинном мозге мышей) могут дифференцироваться в макрофаги, эндотелиальные клетки или астроциты. Недавно было установлено, что генетически модифицированные ММСК человека, одновременно сверх-экспрессирующие гены gdnf и vegf, при внутримышечной инъекции крысам с моделью БАС поддерживают структуру нервно-мышечного синапса и продлевают жизнь животных [101].
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013
110
Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского)
федерального университета
Заключение
Генно-клеточная терапия открывает новый этап терапии различных заболеваний человека. Экспериментальные исследования показывают, что генетически модифицированные клетки имеют огромный потенциал для доставки терапевтических генов в ЦНС с целью структурного и функционального восстановления мозга после нейротравм, ишемических инсультов и при различных нейродегенеративных заболеваниях. Клетки пуповинной крови человека представляют собой один из наиболее доступных ресурсов стволовых клеток с минимальной иммуногенной реакцией реципиента. МКПК легко поддаются культивированию, трансфекции плазмидными и вирусными векторами и способны экспрессировать рекомбинантные гены с высокой эффективностью [98—100]. Генетическая модификация МКПК для доставки терапевтических генов, бесспорно, открывает новые возможности для стимулирования нейрорегенерации. Полученные на сегодняшний день результаты по трансплантации генетически
ЛИТЕРАТУРА:
1. Eapen M., Rocha V., Sanz G. et al. Effect of graft source on unrelated donor haemopoietic stem-cell transplantation in adults with acute leukaemia: a retrospective analysis. Lancet Oncol. 2010; 11(7): 653-60.
2. Шаманская Т.В., Астрелина Т.А., Подколзина З.А. и др. Использование пуповинной крови при проведении аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у детей (опыт работы московского банка стволовых клеток). Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2010; 5(2): 29-35.
3. Stanevsky A., Goldstein G., Nagler A. Umbilical cord blood transplantation: pros, cons and beyond. Blood Rev. 2009; 23: 199-204.
4. Gluckman E. Current status of umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation. Exp. Hematol. 2000; 28(11): 1197-205.
5. Ballen K., Broxmeyer H.E., McCullough J. et al. Current status of cord blood banking and transplantation in the United States and Europe. Biol. Blood Marrow Transplant. 2001; 7(12): 635-45.
6. Космачева С.М., Северин И.Н., Гончарова Н.В. и др. Рост мезенхимальных стволовых клеток пуповинной крови человека in vitro и их дифференцировка в хондроциты и остеобласты. Клеточные технологии в биологии и медицине 2008; 1: 34-8.
7. Harris D.T., Rogers I. Umbilical cord blood: a unique source of pluripotent stem cells for regenerative medicine. Curr. Stem Cell Res. Ther. 2007; 2: 301-9.
8. Arien-Zakay H., Lazarovici P., Nagler A. Tissue regeneration potential in human umbilical cord blood. Best Pract. Res. Clin. Haematol. 2010; 23(2): 291-303.
9. Arien-Zakay H., Lecht S., Nagler A. et al. Human umbilical cord blood stem cells: rational for use as a neuroprotectant in ischemic brain disease. Int. J. Mol. Sci. 2010; 11(9): 3513-28.
10. Gluckman E., Broxmeyer H.A., Auerbach A.D. et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. N. Engl. J. Med. 1989; 321(17): 1174-8.
11. Gluckman E. Ten years of cord blood transplantation: from bench to bedside. Br. J. Haematol. 2009; 147(2): 192-9.
12. Erices A., Conget P., Minguell J.J. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. Br. J. Haematol. 2000; 109(1): 235-42.
13. Kogler G., Sensken S., Airey J.A. et al. A new human somatic stem cell from placental cord blood with intrinsic pluripotent differentiation potential. J. Exp. Med. 2004; 200: 123-35.
14. Zhao Y., Wang H., Mazzone T. Identification of stem cells from human umbilical cord blood with embryonic and hematopoietic characteristics. Exp. Cell Res. 2006; 312(13): 2454-64.
15. McGuckin C., Jurga M., Ali H. et al. Culture of embryonic-like stem cells from human umbilical cord blood and onward differentiation to neural cells in vitro. Nat. Protoc. 2008; 3: 1046-55.
16. Tracy E.T., Zhang C.Y., Gentry T. et al. Isolation and expansion of oligodendrocyte progenitor cells from cryopreserved human umbilical cord blood. Cytotherapy 2011; 13: 722-9.
17. Aktas M., Buchheiser A., Houben A. et al. Good manufacturing practice-grade production of unrestricted somatic stem cell from fresh cord blood. Cytotherapy 2010; 12: 338-48.
модифицированных мононуклеаров пуповинной крови экспериментальным животным указывают на целесообразность их применения не только как носителей терапевтических генов, но и как источника различных факторов роста и камбиальный резерв эндотелиальных и глиальных клеток на период восстановления.
Благодарности
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов Российского Фонда Фундаментальных Исследований 13-04-12035 и 11-04-00902, а также грантом Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых докторов наук МД-433.2013.4. Работа частично выполнена на оборудовании Федерального центра коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов (ФЦКП ФХИ) и Научно образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета.
18. Rocha V., Labopin M., Sanz G. et al. Transplants of umbilical-cord blood or bone marrow from unrelated donors in adults with acute leukemia. N. Engl. J. Med. 2004; 351: 2276-85.
19. Goldstein G., Toren A., Nagler A. Transplantation and other uses of human umbilical cord blood and stem cells. Curr. Pharm. Des. 2007; 13: 1363-73.
20. Yang W.Z., Zhang Y., Wu F. et al. Safety evaluation of allogeneic umbilical cord blood mononuclear cell therapy for degenerative conditions. J. Transl. Med. 2010; 8: 75.
21. Arien-Zakay H., Lecht S., Bercu M.M. et al. Interferon-gamma-induced neuronal differentiation of human umbilical cord blood-derived progenitors. Leukemia 2009; 23: 1790-800.
22. Arien-Zakay H., Nagler A., Galski H. et al. Neuronal conditioning medium and nerve growth factor induce neuronal differentiation of collagen-adherent progenitors derived from human umbilical cord blood. J. Mol. Neurosci. 2007; 32: 179-91.
23. Jang Y.K., Park J.J., Lee M.C. et al. Retinoic acid mediated induction of neurons and glial cells from human umbilical cord derived hematopoietic stem cells. J. Neurosci. Res. 2004; 75: 573-84.
24. Li X., Li H., Bi J. et al. Human cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) treated with alltrans-retinoic acid (ATRA) give rise to dopamine neurons. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2012; 419(1): 110-6.
25. McGuckin C.P., Forraz N., Allouard Q. et al. Umbilical cord blood stem cells can expand hematopoietic and neuroglial progenitors in vitro. Exp. Cell Res. 2004; 295: 350-9.
26. Sun W., Buzanska L., Domanska-Janik K. et al. Voltage-sensitive and ligand-gated channels in differentiating neural stem-like cells derived from the nonhematopoietic fraction of human umbilical cord blood. Stem Cells. 2005; 23: 931-45.
27. Habich A., Jurga M., Markiewicz I. et al. Early appearance of stem/progenitor cells with neural-like characteristics in human cord blood mononuclear fraction cultured in vitro. Exp. Hematol. 2006; 34: 914-25.
28. Buzanska L., Jurga M., Stachowiak E.K. et al. Neural stem-like cell line derived from a nonhematopoietic population of human umbilical cord blood. Stem Cells Develop. 2006; 15: 391-406.
29. Rogers I., Yamanaka N., Bielecki R. et al. Identification and analysis of in vitro cultured CD45-positive cells capable of multilineage differentiation. Exp. Cell Res. 2007; 313: 1839-52.
30. Jurga M., Lipkowski A.W., Lukomska B. et al. Generation of functional neural artificial tissue from human umbilical cord blood stem cells. Tissue Eng., Part C Methods. 2009; 15: 365-72.
31. Harris D.T. Cord blood stem cells: a review of potential neurological applications. Stem Cell Rev. 2008; 4: 269-74.
32. Ende N., Chen R., Ende-Harris D. Human umbilical cord blood cells ameliorate Alzheimer's disease in transgenic mice. J. Med. 2001; 32(3-4): 241-7.
33. Nikolic W.V., Hou H., Town T. et al. Peripherally administered human umbilical cord blood cells reduce parenchymal and vascular beta-amyloid deposits in Alzheimer mice. Stem Cells Develop. 2008; 17: 1-17.
34. Lee H.J., Lee J.K., Lee H. et al. The therapeutic potential of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in Alzheimer's disease. Neurosci. Lett. 2010; 481(1): 30-5.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013
Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского)
федерального университета
111
35. Meier C., Middelanis J., Wasielewski B. et al. Spastic paresis after perinatal brain damage in rats is reduced by human cord blood mononuclear cells. Pediatr. Res. 2006; 59: 244—9.
36. Chen J., Sanberg P.R., Li Y. et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats. Stroke 2001; 32: 2682—8.
37. Vendrame M., Cassady J., Newcomb J. et al. Infusion of human umbilical cord blood cells in a rat model of stroke dose dependently rescues behavioral deficits and reduces infarct volume. Stroke 2004; 35: 2390-5.
38. Xiao J., Nan Z., Motooka Y. et al. Transplantation of a novel cell line population of umbilical cord blood stem cells ameliorates neurological deficits associated with ischemic brain injury. Stem Cells Dev. 2005; 14: 722-33.
39. Newcomb J.D., Ajrno C.T., Sanberg C.D. et al. Timing of cord blood treatment after experimental stroke determines therapeutic efficacy. Cell Transplant. 2006; 15: 213-23.
40. Taguchi A., Soma T., Tanaka H. et al. Administration of CD34 cells after stroke enhances neurogenesis via angiogenesis in a mouse model. J. Clin. Invest. 2004; 114: 330-8.
41. Saporta S., Kim J.J., Willing A.E. et al. Human umbilical cord blood stem cells infusion in spinal cord injury: engraftment and beneficial influence on behavior. J. Hematother. Stem Cell Res. 2003; 12: 271-8.
42. Nishio Y., Koda M., Kamada T. et al. The use of hemopoietic stem cells derived from human umbilical cord blood to promote restoration of spinal cord tissue and recovery of hindlimb function in adult rats. J. Neurosurg. Spine. 2006; 5: 424-33.
43. Sun T., Ma Q.H. Repairing neural injuries using human umbilical cord blood. Mol. Neurobiol. 2013; 47(3): 938-45.
44. Chen C.T., Foo N.H., Liu W.S. et al. Infusion of human umbilical
cord blood cells ameliorates hind limb dysfunction in experimental spinal cord injury through anti-inflammatory, vasculogenic and neurotrophic mechanisms. Pediatr. Neonatol. 2008; 49(3):
77-83.
45. Dasari V.R., Veeravalli K.K., Tsung A.J. et al. Neuronal apoptosis is inhibited by cord blood stem cells after spinal cord injury. Neurotrauma 2009; 26(11): 2057-69.
46. Park D.H., Lee J.H., Borlongan C.V. et al. Transplantation of umbilical cord blood stem cells for treating spinal cord injury. Stem Cell Rev. 2011; 7(1): 181-94.
47. Fu Y.S., Cheng Y.C., Lin M.Y. et al. Conversion of human umbilical cord mesenchymal stem cells in Wharton's jelly to dopaminergic neurons in vitro: potential therapeutic application for Parkinsonism. Stem Cells 2006; 24: 115-24.
48. Weiss M.L., Medicetty S., Bledsoe A.R. et al. Human umbilical cord matrix stem cells: preliminary characterization and effect of transplantation in a rodent model of Parkinson's disease. Stem Cells 2006; 24: 781-92.
49. Newman M.B., Willing A.E., Manressa J.J. et al. Cytokines produced by cultured human umbilical cord blood (HUCB) cells: implications for brain repair. Exp. Neurol. 2006; 199: 201-8.
50. Bachstetter A.D., Pabon M.M., Cole M.J. et al. Peripheral injection of human umbilical cord blood stimulates neurogenesis in the aged rat brain. BMC Neurosci. 2008; 9: 22.
51. Arien-Zakay H., Lecht S., Bercu M.M. et al. Neuroprotection by cord blood neural progenitors involves antioxidants, neurotrophic and angiogenic factors. Exp. Neurol. 2009; 216: 83-94.
52. Schira J., Gasis M., Estrada V. et al. Significant clinical, neuropathological and behavioural recovery from acute spinal cord trauma by transplantation of a well-defined somatic stem cell from human umbilical cord blood. Brain 2012; 135(Pt 2): 431-46.
53. Dasari V.R., Spomar D.G., Li L. et al. Umbilical cord blood stem cell mediated downregulation of fas improves functional recovery of rats after spinal cord injury. Neurochem. Res. 2008; 33(1): 134-49.
54. Завалишин И.А., Бочков Н.П., Суетна З.А. и др. Генная терапия бокового амиотрофического склероза: двухлетнее рандомизированное плацебо-контролируемое исследование. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2008; 145(4): 467-70.
55. Chen N., Newcomb J., Garbuzova-Davis S. et al. Human umbilical cord blood cells have trophic effects on young and aging hippocampal neurons in vitro. Aging Dis. 2010; 1: 173-90.
56. Koh S.H., Kim K.S., Choi M.R., et al. Implantation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells as a neuroprotective therapy for ischemic stroke in rats. Brain Res. 2008; 1229: 233-48.
57. Yasuhara T., Hara K., Maki M. et al. Mannitol facilitates neurotrophic factor up-regulation and behavioural recovery in neonatal hypoxic-ischaemic rats with human umbilical cord blood grafts. J. Cell Mol. Med. 2010; 14(4): 914-21.
58. Borlongan C.V., Hadman M., Sanberg C.D. et al. Central nervous system entry of peripherally injected umbilical cord blood cells is not required for neuroprotection in stroke. Stroke 2004; 35(10): 2385-9.
59. Zola H., Fusco M., Macardle P.J. et al. Expression of cytokine receptors by human cord blood lymphocytes: comparison with adult blood lymphocytes. Pediatr. Res. 1995; 38: 397-403.
60. Ikeda Y., Fukuda N., Wada M. et al. Development of angiogenic cell and gene therapy by transplantation of umbilical cord blood with vascular endothelial growth factor gene. Hypertens. Res. 2004; 27(2): 119-28.
61. Chen H.K., Hung H.F., Shyu K.G. et al. Combined cord blood stem cells and gene therapy enhances angiogenesis and improves cardiac performance in mouse after acute myocardial infarction. Eur. J. Clin. Invest. 2005; 35: 677-86.
62. Шевченко Е.К., Макаревич П.И., Цоколаева З.И. и др. Эффективная трансдукция стромальных клеток жировой ткани человека с помощью рекомбинантного аденоассоциированного вируса. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2010; 5(1): 60-4.
63. Cotrim A.P., Baum B.J. Gene therapy: some history, applications, problems, and prospects. Toxicol. Pathol. 2008; 36(1): 97-103.
64. Zubbler R.H. Ex vivo expansion of haematopoietic stem cells and gene therapy development. Swiss Med. Wkly. 2006; 136: 795-9.
65. Herweijer H., Wolff J.A. Progress and prospects: naked DNA gene transfer and therapy. Gene Therapy 2003; 10: 453-8.
66. Conlon T.J., Flotte T.R. Recombinant adeno-associated virus vectors for gene therapy. Expert. Opin. Biol. Ther. 2004; 4(7): 1093101.
67. Lowenstein P.R., Castro M.G. Inflammation and adaptive immune responses to adenoviral vectors injected into the brain: peculiarities, mechanisms, and consequences. Gene Therapy 2003; 10(11): 946-54.
68. Baum B.J., Zheng C., Cotrim A.P. et al. Transfer of the AQP1 cDNA for the correction of radiation-induced salivary hypofunction. Biochim. Biophys. Acta. 2006; 1758(8): 1071-7.
69. Ипатов С.Е., Румянцев С.А. Вопросы безопасности генной терапии. Онкогематология 2010; 1: 57-63.
70. Das H., George J.C., Joseph M. et al. Stem cell therapy with overexpressed VEGF and PDGF genes improves cardiac function in a rat infarct model. PLoS One 2009; 4(10): e7325.
71. Макаревич П.И., Шевелев А.Я., Рыбалкин И.Н. и др. Новые плазмидные конструкции, предназначенные для терапевтического ангиогенеза и несущие гены ангиогенных факторов роста - VEGF, HGF и ангиопоэтина-1. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2010; 5(1): 47-52.
72. Vincent A.M., Sakowski S.A., Schuyler A. et al. Strategic approaches to developing drug treatments for ALS. Drug Discov. Today. 2008; 13: 67-72.
73. Julien J.P. Amyotrophic lateral sclerosis: unfolding the toxicity of the misfolded. Cell 2001; 104: 581-91.
74. Bruijn L., Miller T., Cleveland D. Unraveling the mechanisms involved in motor neuron degeneration in ALS. Annu. Rev. Neurosci. 2004; 27: 723-49.
75. Rothstein J.D. Current hypotheses for the underlying biology of amyotrophic lateral sclerosis. Ann Neurol. 2009; 65(Suppl 1): S3-9.
76. Rosen D.R., Siddique T., Patterson D. et al: Mutations in Cu/ Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature 1993; 362: 59-62.
77. Gurney M.E., Pu H., Chiu A.Y. et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science 1994; 264(5166): 1772-5.
78. Garbuzova-Davis S., Willing A.E., Zigova T. et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood cells in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis: distribution, migration, and differentiation. J. Hematother. Stem Cell Res. 2003; 12: 255-70.
79. Garbuzova-Davis S., Sanberg C.D., Kuzmin-Nichols N. et al. Human umbilical cord blood treatment in a mouse model of ALS: optimization of cell dose. PLoS One 2008; 3: e2494.
80. Knippenberg S., Thau N., Schwabe K. et al. Intraspinal injection of human umbilical cord blood-derived cells is neuroprotective in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurodegener. Dis. 2012; 9(3): 107-20.
81. Nishikawa M., Takemoto S., Takakura Y. Heat shock protein derivatives for delivery of antigens to antigen presenting cells. Int. J. Pharm. 2008; 354(1-2): 23-7.
82. Kaspar B.K., Llado J., Sherkat N. et al. Retrograde viral delivery of IGF-1 prolongs survival in a mouse ALS model. Science 2003; 301: 839-42.
83. Duque S., Joussemet B., Riviere C. et al. Intravenous administration of selfcomplementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 2009; 17: 1187-96.
84. Foust K.D., Nurre E., Montgomery C.L. et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 2009; 27: 59-65.
85. Snyder B.R., Gray S.J., Quach E.T. et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Hum. Gene Ther. 2011; 22(9): 1129-35.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013
112
Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского)
федерального университета
86. Federici T., Taub J.S., Baum G.R. et al. Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs. Gene Therapy 2012; 19(8): 852-9.
87. Foust K.D., Bevan A.K., Braun L. et al. Biodistribution of IV injected AAV9 in young cynomologus macaques. ASGCT 14th Annual Meeting; 2011 May 18—2l; Seattle: Nature Publishing Group; 2011. p. S152.
88. Gray S.J., Matagne V., Bachaboina L. et al. Preclinical differences of intravascular AAV9 delivery to neurons and glia: a comparative study of adult mice and nonhuman primates. Mol. Ther. 2011; 19(6): 1058—69.
89. Federici T., Boulis N.M. Gene therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol. Dis. 2012; 48(2): 236—42.
90. Tafia M.F. Cell based-gene delivery approaches for the treatment of spinal cord injury and neurodegenerative disorders. Curr. Stem Cell Res. Ther. 2010; 5(1): 23—36.
91. Lehrman S. Virus treatment questioned after gene therapy death. Nature 1999; 401(6753): 517—8.
92. Hacein-Bey-Abina S., von Kalle C., Schmidt M. et al. A serious adverse event after successful gene therapy for X-linked severe combined immuno-deficiency. N. Engl. J. Med. 2003; 348(3): 255—56.
93. Mohajeri M.H., Figlewicz D.A., Bohn M.C. Intramuscular grafts of myoblasts genetically modified to secrete glial cell line-derived neurotrophic factor prevent motoneuron loss and disease progression in a mouse model of familial amyotrophic lateral sclerosis. Hum. Gene Ther. 1999; 10(11): 1853—66.
94. Klein S.M., Behrstock S., McHugh J. et al. GDNF delivery using human neural progenitor cells in a rat model of ALS. Hum. Gene Ther. 2005; 16(4): 509—21.
95. Behrstock S., Ebert A., McHugh J. et al. Human neural progenitors deliver glial cell line-derived neurotrophic factor to parkinsonian rodents and aged primates. Gene Therapy 2006; 13(5): 379—88.
96. Aebischer P., Pochon N.A., Heyd B. et al. Gene therapy for amyotrophic lateral sclerosis (ALS) using a polymer encapsulated xenogenic cell line engineered to secrete hCNTF. Hum. Gene Ther. 1996; 7(7): 851—60.
97. Aebischer P., Schluep M., Deglon N. et al. Intrathecal delivery of CNTF using encapsulated genetically modified xenogeneic cells in amyotrophic lateral sclerosis patients. Nat. Med. 1996; 2(6): 696—9.
98. Rizvanov A.A., Kiyasov A.P., Gaziziov I.M. et al. Human umbilical cord blood cells transfected with VEGF and L(1)CAM do not differentiate into neurons but transform into vascular endothelial cells and secrete neuro—trophic factors to support neuro-genesis-a novel approach in stem cell therapy. Neurochem. Int. 2008; 53(6—8): 389—94.
99. Ризванов А.А., Гусева Д.С., Салафутдинов И.И. и др. Генноклеточная терапия бокового амиотрофического склероза монону-клеарными клетками пуповинной крови человека, сверхэкспресси-рующими гены нейронной молекулы адгезии L1cam и сосудистого эндотелиального фактора роста vegf. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2010; V(4): 56—63.
100. Rizvanov A.A., Guseva D.S., Salafutdinov I.I. et al. Genetically modified human umbilical cord blood cells expressing vascular endothelial growth factor and fibroblast growth factor 2 differentiate into glial cells after transplantation into amyotrophic lateral sclerosis transgenic mice. Exp. Biol. Med. 2011; 236: 91—8.
101. Krakora D., Mulcrone P., Meyer M. et al. Synergistic Effects of GDNF and VEGF on lifespan and disease progression in a familial ALS rat model. Mol. Ther. 2013; 21(8): 1602—10.
Поступила 2908.2013
ООО Агентство «Химэксперт»
125009 г., Москва, Страстной б-р, д. 4, офис 101 info@khimexpert.ru Тел.: + 7 (495) 629 28 69, 650 36 66 www.khimexpert.ru
HLA-ТИПИРОВАНИЕ С НАБОРАМИ INVITROGEN™
SBT — sequence-basedtyping. В основе типирования лежит технология секвенирования методом Сэнгера с использованием капиллярного электрофореза. Это позволяет безошибочно получать последовательность нужных локусов без потери информации.
Наборы SeCore® HLASequence-BasedTyping — «золотой стандарт» идентификации аллелей.
S Максимально высокое разрешение, идентификация 8000 известных аллелей + ежеквартальное обновление базы данных
S Возможность обнаружения новых аллелей
S Возможность типирования различных популяций с одинаковой эффективностью вне зависимости от частоты аллелей
uTYPE® DxSequencingAnalysisSoftware — пакет программ для эффективного анализа данных и интерпретации результатов.
SSP — sequence-specificprimer. В основе метода лежит ПЦР с использованием аллель-специфичных праймеров с последующей детекцией посредством гель-электрофореза.
Наборы AllSet+™ GoldHLATypingKits — полностью готовое решение. Все необходимые компоненты для анализа включены в набор. Самая быстрая система на рынке — готовый результат через 2,5 часа после выделения ДНК.
Наборы SSPUniTray® HLATypingKits — более 50 наборов для типирования с низким и высоким разрешением.
S Типирование с низким и высоким разрешением
S Возможность выбрать набор под конкретную задачу
S Более точный и надежный метод по сравнению с серологическими методами
S Доступность оборудования для электрофореза
S Простая методика и интерпретация результатов, требует минимального количества оборудования
S Быстрое получение результатов.
UniMatch® PLUSv6.0 Software — программное обеспечение для простого и быстрого анализа результатов.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013
