CC BY
402
---------------------------------------- © М.А. Водянова, 2006
УДК 502/504 М.А. Водянова
БИОТЕСТИРОВАНИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В ОЦЕНКИ ЗАГРЯЗНЕНИЙ ПОЧВ
Семинар № 10
ЖЭ о все времена человек стремил-
-Я-9 ся создать самые комфортные условия для жизни и деятельности. Создавалось множество предприятий как лёгкой, так и тяжёлой промышленности; осваивались новые территории; из маленьких населённых пунктов вырастали крупные города; создавались автомагистрали - это приводило к неизбежному загрязнению окружающей среды.
В городах располагается огромное количество бензоколонок, по разным морским путям перевозят гигантские танкеры, наполненные нефтью, вследствие аварий и других внешних факторов происходят разливы. Соответственно, почва и вода в близлежащих регионах сильно загрязнены, изменяются физикохимические свойства, а, следовательно, живые организмы в такой среде ведут себя по-другому.
Поэтому темой данной работы является: «Использование биологических
методов для оценки токсичности объектов окружающей среды, содержащих различные примеси», которые включают:
1. Методы биотестирования;
2. Микробиологические методы.
Объектом нашей работы стала почва,
загрязнённая нефтью.
1. Характеристика почв и процессов их самоочищения
Почва - единый, живой организм, который реагирует на все внешние раздражения. Скопление загрязнителей различной природы в почвенном слое
земли могло бы сделать невозможным жизнь людей, если одновременно с загрязнением в почве не проходили бы процессы самоочищения.
Самоочищение почвы - это совокупность процессов, происходящих в почве и приводящих к ослаблению или полному освобождению от токсического действия загрязняющих веществ.
С ухудшением самоочищающей способности, возрастает эпидемическая опасность почвы. В загрязненной почве снижается уровень истинных представителей почвенных микробоценозов (антагонистов патогенной кишечной микрофлоры) и её биологическая активность, но возрастает количество положительных находок патогенных энтеробактерий и геогельминтов, которые более устойчивы к химическому загрязнению почвы.
Почвы, находящиеся в границах крупных городов, испытывают мощное воздействие антропогенного фактора, которое включает в себя как нарушения естественного сложения и состава почв, так и попадание в неё различных загрязнителей. В результате возникает совершенно особый «тип» почвы - городская почва_или урбанозём.
С целью сравнения эффекта воздействия загрязнителя, в частности, нефти, в эксперименте было решено использовать как урбанозём, так и почву, типичную для нашего региона, а именно, дерновоподзолистую почву.
Городская почва
Городские почвы определяются, как почвы, имеющие созданный человеком поверхностный слой мощностью более 50 см, полученный перемешиванием, насыпанием, погребением или загрязнением материалами урбаногенного происхождения (строи-тельно-бытовой мусор).
Следует сказать, что почва, пропитанная органическими масляно-бензиновыми жидкостями, называется интру-зёмом.
Для данного эксперимента была отобрана почва из центрального округа города Москвы (ЦАО) с улицы Погодинская (на поверхности не было бетона).
Дерново-подзолистая почва
Данная почва была отобрана на территории биостанции МГУ «Чашниково» Солнечногорского района Московской области на окраине леса без дёрна.
2. Характеристика нефти
С целью изучения воздействия нефти на почву был поставлен эксперимент, нефть в котором была взята из Тарасов-ского месторождения Пуровского района (Западная Сибирь).
Были исследованы следующие концентрации - 25; 50; 100; 200; 300 и 500 мл/кг почвы, которые соответствуют низким (25-50), средним (100, 200) и высоким (300-500) уровням загрязнений. Последние концентрации указывают на уровни разливов нефти в природе.
3. Биотестирование
Биотестирование - это интегральный
метод анализа качества объекта окружающей среды, в ходе которого используется лабораторные стандарти-
зированные объекты (тест-объекты1). В условиях эксперимента регистрируются
1 Объект изучения, исследования каким-либо способом, методом. По состоянию тест-объекта можно судить о свойствах его среды обитания (естественной или искусственной).
их ответные реакции на антропогенное воздействие.
Суммарной задачей и результатом применения биотестирования является: обеспечение экологического благополучия биологических объектов.
Для оценки токсичности2 применяются различные тест-объекты - микроорганизмы, аквариумные рыбки, водоросли, культуры клеток животных и человека и прочее.
Данное тестирование проводилось с использованием следующих тест-
организмов - представителей различных систематических групп: простейших -инфузорий ТеіїаЬушепа рігу£огтІ8, генно-инженерного штамма бактерий
«Эколюм» и клеточного тест-объекта (гранулированная сперма быка).
Подготовка проб для биотестирования
Изначально было взято 14 образцов почвы: 7 образцов урбанозёма и 7 образцов дерново-подзолистой поч-вы с концентрациями нефти: 25, 50, 100, 200, 300, 500 мл/кг и контроль, то есть без загрязнения. Отдельно был взят образец дистиллированной воды. Через многоступенчатую филь-трацию были получены соответствующие экстракты.
Часть полученных фильтратов были представлены в ВНИИ Медтехники МЗ РФ для проведения эксперимента по определению токсичности с использованием спермы быка в качестве клеточного тест-объекта. Другая часть была использована для биотестирования и микробиологического метода.
Метод биотестирования для оценки качества воды в системах хозяйственно-питьевого водоснабжения на культуре инфузорий
2 Способность вещества, при попадании которого в определённых количествах в организм человека, животного или растения, вызывать их отравление или гибель.
Генеративная или ростовая функция инфузорий является важным показателем их жизнеспособности и заключается в наблюдении за размножением тетра-химен как в исследуемых вытяжках, так и в контроле (дехлорированная водопроводная вода). В пробы вытяжек объемом 5 мл помещали по 0,05 мл культуры тетрахимен с исходной концентрацией 100 - 200 кл/мл. Повторность опыта трехкратная; время экспозиции 6 и 48 часов. В течение первых 6 часов наблюдают, в основном, за выживаемостью инфузорий (острый опыт), в течение остального времени за приростом количества инфузорий. Инфузории очень чувствительны к незначительным концентрациям загрязнений, попадающих в водные экосистемы. Их короткий жизненный цикл развития даёт возможность быстро выявить характер действия токсикантов.
Простота культивирования, доступность проведения исследований позволяют использовать этот тест-объект не только в лабораторных, но и полевых условиях.
Показатели токсичности испытуемой пробы является подавление скорости прироста клеток инфузорий (в хроническом опыте3 - в течение 96 часов) и их гибель (в остром опыте4 - 15 мин, 1 час).
Для экспресс-оценки токсичности пробы экстрактов численность живых клеток контролируется через 15 минут и через 1 час. В хроническом опыте, как и в нашем случае, - через 24, 48 часов в одно и то же время.
3 Этот опыт может длиться около 30 суток для более тщательного и глубокого исследования токсических свойств у данного объекта.
4 Это опыт может длиться около 96 - 120 часов
и позволяет определить наличие и отсутствие
острого токсического воздействия испытуемого вещества.
Критерием токсичности — (К) служит показатель размножения, за который принимается относительный прирост численности клеток в 1 мл исследуемого фильтрата. Пробы следует считать токсичными при значении К < 50 %.
Биотестирование с использованием клеточного тест-объекта - гранулированная сперма быка
В основе метода лежит анализ изменения зависимости сперматозоидов от времени. За меру токсичности исследуемого раствора принимают величину индекса токсичности II Чем меньше значение Й, тем сильнее оказывает испытуемый раствор угнетающее действие на суспензию сперматозоидов.
Испытуемый результат считается нетоксичным для целостного организма млекопитающих, то есть не оказывающим общетоксического действия при однократном введении, если значение И находится в интервале от 70 до 120 %. В случае получения значений индекса токсичности меньше 70 % и больше 120 % образец признаётся токсичным, то есть оказывающим общетоксическое действие на целостный организм млекопитающего при однократном введении.
Таким образом, у потребителя данной методики появляется возможность после проведения испытания по оценке цито-токсичности6 на сперме быка прогнозировать общетоксическое действие испытуемого раствора на целостный организм млекопитающих.
Методика экспрессного определения токсичности фильтратов почв с помощью люминисцентного бактериального
5 Достоверное количественное значение тест-параметров, наиболее часто используются выживаемость, плодовитость, подавление ферментативной и метаболической активности организмов.
6 Действие яда на уровне клетки.
группы Значение Т Вывод о степени токсичности анализируемой пробы
1 Меньше 20 Допустимая степень токсичности
2 От 20 до 50 Образец токсичен
3 Равно или больше 50 Образец сильно токсичен
теста “Эколюм" (светящиеся бактерии)
Биосенсор «Эколюм», используемый в тестировании, представляет собой бактерии, в которых метаболические процессы сопровождаются свечением в видимой части спектра. При действии токсических соединений различной природы в бактериях изменяются биохимические реакции, что отражается на изменении их свечения.
Интенсивность биолюминесценции регистрируется прибором «Биотокс-6». Критерием оценки является индекс токсичности (Т), который в норме не превышает величины 20%-го отличия от контроля. Стимуляция свечения не является показателем токсического действия образцов на функцию свечения бактерий. Методика основана на определении изменения интенсивности биолю-минисценции7 генно-инженерных бактерий при воздействии токсических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем.
Критерием токсического действия является изменение интенсивности биолю-минисценции тест-объекта в исследуемой пробе с таковой для пробы с раствором, не содержащим токсических веществ. Уменьшение интенсивности биолюми-нисценции пропорционально токсическому эффекту.
4. Микробиологический метод
Почва - естественная среда обитания для самых различных микроорганизмов. Исследования проводились на основных группах почвенных микроорганизмов:
7 Интенсивное свечение в видимой области спектра, отражающее специфическую метаболическую активность организмов.
сапрофитные бактерии, почвенные мик-ромицеты и актиномицеты. В каждом грамме верхнего слоя обитают миллионы, даже миллиарды таких организмов. Эта биомасса с очень большой активной поверхностью оказывает значительное влияние на процессы, происходящие в почве, и на её плодородие. Микроорганизмы разрушают попадающие в почву органические вещества и переводят их органогенные элементы в формы, усваиваемые растениями.
Определение микроорганизмов в почве
Данные по изучению загрязнения почвы указывает на большую чувствительность к действию отдельных химических веществ почвенных актиномицетов и грибов по сравнению с почвенными споровыми и неспоровыми бактериями. Несомненно, что такая разбалансировка равновесия в почвенном микробиоценозе, должна рассматриваться как отрицательное явление. Актиномицетам и грибам принадлежит большая роль в превращении широкого круга органических и минеральных веществ и, благодаря чрезвычайно выраженным антагонистическим и токсическим свойствам, они оказывают большое влияние на формирование микробных почвенных ценозов, являются продуцентами многих физиологически активных веществ - аминокислот, ферментов и витаминов.
Как правило, для учета почвенных грибов используют разведения почвенной суспензии 1:100 (102), при учете ак-тиномицетов - 1:1000 (103), а при учёте сапрофитных бактерий - 1:10000 (104). Посев производят поверхностным способом, нанося на агаризованные среды
0,1 - 0,05 мл суспензий. Для учета акти-номицетов используется среда Гаузе 1, для учёта грибов - среда Чапека, а для учёта сапрофитных бактерий - среда МПА. При учёте грибов используют добавление в среду веществ, ингибирующих рост бактерий - например, антибиотик стрептомицин, который добавляется непосредственно перед посевом в расплавленную среду.
Согласно положениям Методических рекомендаций по гигиеническому обоснованию ПДК химических веществ в почве, результаты опыта оцениваются путем сопоставления числа колоний, выросших из почвы опытных и контрольных сосудов. Действующей концентрацией химического вещества считают ту, которая оказывает выраженное угнетающее действие не менее чем на 50 % по отношению к контролю.
Количество грибов и актиномицетов рассчитывается на 7 - 10 день инкубации, а сапрофитные бактерии - на 3 день.
5. Результаты исследований
Методы биотестирования
Вывод 1: Для урбанозёма минимально действующей концентрацией (в дальнейшем - МНД) нефти является 50 мл/кг почвы. Воздействие данной концентрации проявилось на функцию свечения бактерий «Эколюм». Влияние на генеративную функцию инфузорий обнаруживалось, начиная с концентрации 300 мл/кг почвы. Не было выявлено токсического влияния изученных образцов почвы на поведенческую функцию сперматозоидов быка.
Вывод 2: Для дерново-подзолистой почвы величина МНД составила 25
мл/кг почвы по генеративной функции инфузорий. Тесты на свечение бактерий «Эколюм» и поведенческую функцию сперматозоидов не дали закономерных результатов.
Заключение: Таким образом, использование предложенных биотестов позволяет оценить качество загрязнённых нефтью почв и установить величины МНД нефти.
Методы биотестирования используют не только для оценки токсичности загрязнённых объектов окружающей среды, но и для оценки различных технологических процессов, например, методов обработки вод различного назначения: методы очистки, корреляции и так далее.
Микробиологические методы По полученным результатам микробиологических исследований было обнаружено:
Вывод 1: Угнетение роста микромице-тов и актиномицетов во всех экспериментальных почвенных образцах;
Вывод 2: Активная стимуляция роста сапрофитных бактерий уже с первых суток инкубации;
Вывод 3: Обнаружено уменьшение разнообразия бактерий и микромицетов во всех экспериментальных образцах по сравнению с контролем, начиная с 3-их суток исследований;
Вывод 4: Установлено МНД нефти для урбанозема по влиянию на почвенные актиномицеты, угнетение роста которых (более 50 % от контроля) наблюдалось с концентрации нефти 25 мл/кг почвы.
— Коротко об авторах ---------------------------------------
Водянова М.А. - Московский государственный горный университет.
