CC BY
68
УДК 504.064.2: 631.4.
БИОТЕСТИРОВАНИЕ ПОЧВ ПРИ ЗАГРЯЗНЕНИИ КАДМИЕМ1
М.А. Тимофеев, В.А. Терехова, П.А. Кожевин
Комплексное биотестирование почвенных образцов в условиях модельного эксперимента с загрязнением кадмием позволило выявить дополнительные возможности подхода, позволяющие проводить биодиагностику с определением вероятного уровня загрязнения. Получены наиболее информативные показатели биотестов для модели на основе дискри-минантного анализа.
Ключевые слова: биодиагностика, биотестирование, загрязнение, почвы, кадмий.
Введение
В настоящее время в системе экологического контроля природной среды серьезное значение придается биотическим показателям. Они содержат уникальную информацию, которую нельзя получить с помощью только физических и химических исследований объектов. В частности, химический анализ указывает на наличие загрязнителей, но в силу понятных ограничений не может дать прямую характеристику состояния почвенной биоты и экосистемы в целом с прогнозом событий. Именно методы биодиагностики позволяют дать интегральную оценку уровня экологической опасности [17].
Основной принцип биотестирования заключается в испытании действия проб объектов среды на биологические объекты, что позволяет выявить интегральный биологический эффект комплекса неблагоприятных экологических факторов [13]. Для понимания возможностей и ограничений подхода необходимы специальные исследования, особенно в тех случаях, когда регистрируемая реакция объектов может отражать действие не только пол-лютантов, но и других факторов in situ. Именно такая ситуация обычно характерна при анализе почвы как сложной гетерогенной системы. Актуальной является также разработка системы биотестирования, позволяющей не только установить наличие загрязнения, но и получить качественные и количественные характеристики [13]. Для решения подобных задач необходим анализ с использованием методов многомерной математической статистики [1].
Особый интерес при получении качественных и количественных характеристик загрязнения представляют методы микробиологического тестирования, включая индуцированную загрязнением устойчивость (ИЗУ) микробных сообществ. Часто используется и другое название данного подхода — анализ PICT (pollution induced community tolerance) [14]. В данном случае тест-объектом служат не инди-
видуальные организмы и популяции, а сообщества непосредственно в почвенных образцах [4].
В данной работе определяли спектр биотест-систем, пригодных для эффективной экотоксикологи-ческой оценки почвенных образцов на примере химического загрязнения почв кадмием.
Объекты и методы исследования
Исследование проводили на образцах дерново-подзолистой почвы (Московская обл.) и чернозема типичного (Тульская обл.), отобранных из верхних (0—20 см) горизонтов, а также на образцах модельной почвенной смеси, имеющей следующий состав: верховой торф (10%), каолиновая глина (20%) и кварцевый песок (70%) (согласно ISO 11268-1).
На первом этапе в почвах и модельной смеси физическими и химическими методами определяли кислотно-основные свойства, количество органического вещества, подвижных соединений фосфора и калия, ила.
Основной эксперимент связан с внесением в образцы почвы и модельной смеси раствора хлорида кадмия на двух уровнях — 25 и 250 мг/кг почвы (10 и 100 ПДК соответственно) с последующим их увлажнением (—0,005 MPa). Для равномерного распределения токсиканта образцы тщательно перемешивали [16]. Инкубацию проводили в термостате при 25°. Для анализа использовали образцы, отобранные через 7 и 30 сут. после внесения кадмия. Предполагалось, что первая неделя эксперимента представляет период острой токсичности с вероятным угнетением микробных сообществ. Более продолжительная инкубация в течение месяца предусмотрена для проверки возможности формирования in situ микробных сообществ, устойчивых к данному загрязнению.
Для экологической оценки применяли одиннадцать биологических методов. Шесть из них относятся к биотест-системам, где в качестве тест-организмов использовали семена редиса Raphanus sativa (3-суточный тест по энергии прорастания,
1 Работа выполнена при поддержке Фонда содействия развитию малых предприятий в научно-технической сфере (№ 6057р8522), ФЦП «Научные и педагогические кадры России» (№ ГК 02.740.11.06993) и программы РАН «Биоразнообразие».
7-суточный тест по всхожести, удельной длине и биомассе ростков) [11]; ракообразных Ceriodaphnia affinis (тест на иммобилизацию в течение 48 ч) [8]; микроводоросли Scenedesmus quadricauda (72-часовой тест по угнетению прироста численности популяции клеток) [6]; культуру клеток теплокровных животных in vitro (3-часовой экспресс-тест по изменению подвижности половых клеток быка) [5]; простейших Paramecium caudatum (24-часовой тест на иммобилизацию) [9]; люминесцентный биосенсор «Эколюм» (30-минутный тест по подавлению свечения люминесцентных бактерий) [10]. Остальные пять методов относятся к биоиндикационным, или микробиологическому тестированию: анализ интенсивности почвенного дыхания (по эмиссии CO) [10]; анализ структурно-функционального разнообразия сообществ микроорганизмов методом посева на питательные среды [10]; прямой учет численности и биомассы грибов и бактерий методом люминесцентной микроскопии [10]; интегральная оценка микробных сообществ по гидролизу диацетата флуоресцеина (ФДА) [2]; мульти-респираторометрическое тестирование (МРТ) (выполнен в «монореспираторной» модификации, т.е. микробиологическую активность оценивали по дыханию грибов и бактерий при добавлении только глюкозы) [4].
На заключительном этапе исследований (проверочном) анализировали загрязненные кадмием (10 ПДК) образцы (чернозем, дерново-подзолистая почва и модельная смесь) из ризосферы пшеницы. В ходе данного эксперимента проводили проверку адекватности модели, полученной с помощью дискриминантного анализа для наиболее информативных показателей биотестирования (семена редиса, ракообразные, микроводоросли S. quadricauda, культура половых клеток млекопитающих in vitro и люминесцентный биосенсор «Эколюм»).
Оценку значимости факторов, влияющих на биологические показатели, проводили при помощи дисперсионного анализа данных. Для оценки принципиальной возможности построения модели диагностики загрязнения почв использовали метод многомерной математической статистики — дискрими-нантный анализ (STATGRAPHICS Plus 5.1).
Результаты анализов и их обсуждение
Дисперсионный анализ данных показал, что результаты практически всех используемых методов в основном определяются факторами времени и типа почвы (вне зависимости от того, тестируется почва или водная вытяжка). Исключением является биотест на ракообразных: выживаемость особей определяется уровнем загрязнения. Таким образом, в первом приближении только биотест с ракообразными представляет интерес как самостоятельный метод экотоксикологической оценки почв.
Полученные в ходе эксперимента данные всех методов использовали для диагностики загрязнения кадмием разных почв (дерново-подзолистая, чернозем, модельная смесь) вне зависимости от срока загрязнения (в диапазоне до 30 сут.) с помощью ди-скриминантного аналиа. В качестве обучающей выборки были взяты показатели для трех классов объектов: класс 0 — нет загрязнения, класс 1 — загрязнение на уровне 10 ПДК, класс 2 — загрязнение на уровне 100 ПДК. Независимыми переменными являлись значения показателей по следующим анализам: биотестирование на ракообразных C. affinis (выживаемость особей, %); биотестирование на водорослях S. quadricauda (прирост численности клеток относительно контроля, %); фитоте-стирование на семенах высших растений R sativa (всхожесть, %; энергия прорастания, %; удельная длина побегов, мм; удельная масса побегов, мг); бактериальное тестирование на биолюминесцентном реагенте «Эколюм» (индекс токсичности Т, %); определение цитотоксичности на культуре половых клеток млекопитающих in vitro (индексы токсичности It и Is, %); анализ почвенного дыхания по эмиссии CO (мкМ/г почвы • ч).
В результате анализа установлено, что диагностическая задача имеет решение, 88,9% исследуемых образцов были распознаны правильно, что отображено на графике дискриминантных функций (рисунок). Контрольные образцы (без загрязнения кадмием) образуют самостоятельную, четко выраженную группировку, не пересекающуюся с другими классами.
Таким образом, получено правило, позволяющее в заданных условиях отнести почвенный образец к тому или иному классу объектов, т.е. определить уровень загрязнения или отсутствие такового. Для этого достаточно провести фитотестирование, биотест с ракообразными, биотест с водорослями, определение цитотоксичности (in vitro) и токсичности по люминесценции бактерий. Затем полученные по-
F2
1 В
А L 1 А А В 0 =
М+2 : 1 2 1 ; 1 +2 2 2 2 ■ 0 0 + в 0 0:
-3,3 -1,3 0,7 2,7 ^ 4,7
Расположение объектов биотестирования на плоскости первых двух дискриминантных функций: 0, 1 и 2 — образцы обучающего множества для контроля, низкого и высокого уровня загрязнения соответственно; А и В — образцы для проверки модели из ризосферы с загрязнением и без загрязнения кадмием соответственно
казатели биотест-систем используются для расчета значений двух дискриминантных функций:
F1 = —0,271*FitoE + 0,267*FitoC +
+ 0,162*FitoL + 0,040*Crust - 0,062*Algae - (1)
- 0,130*It - 0,043*T + 11,280;
F2 = -0,183*FitoE + 0,190*FitoC + 0,073*FitoL - 0,005*Crust + 0,002*Algae - (2)
- 0,005*It + 0,052*T - 5,678,
где F1 и F2 — значения дискриминантных функций; FitoE — энергия прорастания, %; FitoC — всхожесть, %; FitoL — удельная длина побегов, мм; Crust — доля выживших особей С. affinis; Algae — прирост численности клеток S. quadricauda, %; It — индекс токсичности при определении цитотоксич-ности in vitro, %; Т — индекс токсичности люминесцентного бактериального теста, %.
Расчетные значения функций являются координатами объектов на диаграмме рассеивания (рисунок), что позволяет составить диагностическое правило для отнесения анализируемого образца к тому или иному классу. Оно будет заключаться в определении расстояния от диагностируемого образца до центроидов классов, которые показаны на диаграмме.
Для проверки полученного решения были дополнительно проанализированы загрязненные кадмием (10 ПДК) образцы трех типов почв (чернозем, дерново-подзолистая почва и модельная смесь) из ризосферы пшеницы, что более соответствует реальным условиям в природных местообитаниях. Регистрируемые значения показателей биотестов подставлялись в уравнения для расчета значений диск-риминантных функций. Координаты указанных новых объектов отмечены особо на плоскости двух дискриминантных функций (рисунок). По минимальному расстоянию оценивается приближенность новых объектов к центроиду определенного класса как условному эталону. Из шести тестируемых образцов почв пять были определены точно. В одном случае — для дерново-подзолистой почвы — прогнозируемый уровень загрязнения был завышен, но в рамках шкалы «загрязненные/чистые» все исследуемые образцы были определены верно.
Таким образом, на примере загрязнения кадмием показана принципиальная возможность качественного определения и количественной характеристики содержащегося в почве токсиканта с помощью биотестирования с последующим дискриминантным анализом информации.
В природоохранных целях согласно нормативным документам рекомендуется использовать минимум две тест-системы при условии, что они отражают реакцию разных таксономических групп и трофических уровней [3]. С введением каждого дополнительного объекта надежность испытаний повышается, однако бесконечное расширение ассорти-
мента обязательных объектов невозможно [13]. Отсюда следует, что спектр используемых биотест-систем должен быть достаточным для обеспечения экотоксикологического контроля. Эффективность использования биологических методов анализа возрастает, если, как показано в данном эксперименте, имеется принципиальная возможность выявления причины токсикологического эффекта.
В ходе выполнения работы выявлена дополнительная возможность определения поллютанта по функциональной реакции естественного почвенного микробного сообщества. Дыхание почвенных микробных сообществ (МРТ) в загрязненных кадмием образцах зависит от экспозиции. В первую неделю инкубации наблюдается выраженное угнетение дыхания микробных сообществ в образцах, загрязненных кадмием. Однако через 30 сут. показатели функциональной активности в них практически не отличались от таковых в контрольных образцах почв. Можно предположить, что это связано с эффектом ИЗУ (PICT), т.е. формированием устойчивых к конкретному загрязнению микробных сообществ [14]. Подобный эффект повышения устойчивости бактериальных сообществ в почвах при длительной экспозиции описан также для никеля и меди [15].
Проверить наличие ИЗУ (PICT) можно весьма просто: достаточно внести в исследуемую пробу почвы кадмий (25—250 мг/кг) и провести функциональное тестирование исходного и искусственно загрязненного образцов. Если через два часа инкубации функциональные показатели микробных сообществ практически не различаются, можно предположить, что исходная почва уже была загрязнена кадмием (до 100 ПДК) по меньшей мере в течение 1 мес. Вопрос о специфичности функциональной реакции микробных сообществ в зависимости от вида загрязнения требует отдельного изучения. Отмечено, например, что при загрязнении почв цинком повышается устойчивость и к кадмию, но в случае с исходным загрязнением кадмием устойчивость к цинку снижается [15].
В целом результаты МРТ хорошо коррелируют с содержанием кадмия в водной вытяжке (r = -0,70), а также с данными по биотестированию на ракообразных С. affinis (r = 0,78). Среди достоинств данного варианта функционального анализа (простота, экспрессность, учет активности как бактерий, так и грибов) отметим, что в данном случае анализируется не почвенная суспензия, а непосредственно почвенный образец. Это обстоятельство представляется принципиальным при анализе сложных природных систем с преобладанием твердой фазы [12].
Таким образом, полученные на примере с кадмием результаты позволили выявить новые принципиальные возможности биотестирования для характеристики загрязнения почвы.
Авторы выражают благодарность Э.Г. Набеевой и М.В. Бирюкову за помощь в работе.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Булгаков Н.Т., Максимов В.Н., Левич А.П. Региональный экологический контроль на основе биотических и абиотических данных мониторинга // Экологический мониторинг. Ч. 5 / Под ред. Д.Б. Гелашвили. Ниж. Новгород, 2003.
2. Кожевина Л.С., Кожевин П.А., Кофф Т.Л. О возможностях микробиологической характеристики почв и грунтов сейсмоопасных территорий для геодинамической и санитарно-эпидемиологической оценки и прогноза // Прикладная геоэкология, чрезвычайные ситуации, земельный кадастр и мониторинг. Вып. 1. М., 1995.
3. Критерии отнесения опасных отходов к классу опасности для окружающей природной среды. (Утверждено приказом Министерства природных ресурсов России 15 июня 2001 г. № 511.)
4. Марченко С.А., Панкратов Т.А., Горленко М.В., Кожевин П.А. Мультисубстратное тестирование природных микробных сообществ в почве // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 17. Почвоведение. 2005. № 2.
5. Методика выполнения измерений индекса токсичности почв, почвогрунтов, вод и отходов по изменению подвижности половых клеток млекопитающих in vitro (ФР 1.31.2009.06301). М., 2009.
6. Методика определения токсичности вод, водных вытяжек из почв, осадков сточных вод и отходов по изменению уровня флуоресценции хлорофилла и численности клеток водорослей (ФР 1.39.2007.03223).
7. Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод и отходов по изменению интенсивности бактериальной биолюминесценции тест-системой «Эколюм» на приборе «Биотокс-10» (ПНД ФТ 14.1:2:3:4.11-04 / ПНД ФТ 16.1:2.3:3.8-04).
8. Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению плодовитости цериодафний (ФР 1.39.2007.03221).
9. Методика определения токсичности отходов, почв, осадков сточных, поверхностных и грунтовых вод методом биотестирования с использованием равноресничных инфузорий Paramecium caudatum Ehr. (ФР 1.39.2006.02506).
10. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д.Г. Звягинцева. М., 1991.
11. Минеев В.Г., Ремпе Е.Х., Воронина Л.П. Биотест для определения экологических последствий применения химических средств защиты растений // Докл. ВАСХНИЛ. 1991. № 7.
12. Тимофеев М.А, Терехова В.А., Каниськин М.А., Федосеева Е.В. Сравнение чувствительности микроми-цетного и стандартных биотестов // Мат-лы III Всерос. конф. по водной токсикологии, гидроэкологии и школы-семинара. Ч. 3. Борок, 2008.
13. Филенко О.Ф. Биологические методы в контроле качества окружающей среды // Экол. системы и приборы. 2007. № 6.
14. Boivin MEY Diversity of microbial communities in metal-polluted heterogeneous environments: Doct. thesis. Neterlands, 2005.
15. Diaz-Ravina M, Baath E. Development of Metal Tolerance in Soil Bacterial Communities Exposed to Experimentally Increased Metal Levels // Applied and Environ. Microbiol. 1996. August. Vol. 62, N 8.
16. Min L., Yun-kuo L., Xiao-min Z, Chang-yong H. Toxicity of cadmium to soil microbial biomass and its activity: effect of incubation time on Cd ecological dose in a paddy soil // J. Zhejiang University. 2005. P. 324—330.
17. Terekhova V., Poputnikova T.., Rakhleeva A. Bio-tic control of Humic Substances Ecotoxicity and their Remediation Effect in Contaminated Environment // Proc. of the 14th of Intern. Humic Substances Soc. "From molecular understanding to innovative applications of humic substances". Vol. 2. Moscow; Saint Petersburg, 2008. P. 687—690.
Поступила в редакцию 11.05.2010
BIOTESTING OF CD POLLUTION IN SOILS M.A. Timofeev, V.A. Terechova, P.A. Kozhevin
The potential of biotests to detect and analyze of Cd pollution in soils was studied. This paper identifies a number of approaches, such as PICT and discriminant analysis, which may open new perspectives for ecotoxicology.
Key words: cadmium, soil pollution, biotesting, ecotoxicology.
Сведения об авторах. Тимофеев Михаил Александрович, аспирант каф. земельных ресурсов ф-та почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. Терехова Вера Александровна, докт. биол. наук, вед. науч. сотр. Ин-та проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН, зав. лаб. экотоксикологического анализа почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. Тел. 939-28-63; e-mail: vterekhova@gmail.com. Кожевин Петр Александрович, докт. биол. наук, вед. науч. сотр. каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. Тел. 939-35-98; e-mail: kozhevinpa@mail.ru
