CC BY
72
1. Кершанская О.И. Генетическая инженерия растений. Практический подход. - Алматы: Доива, 2007. - 152 с.
2. Кершанская О.И. Фотосинтетические основы продукционного процесса у пшеницы. -Алматы: Доива, 2007. - 252 с.
3. Новый способ генетической трансформации пшеницы посредством агробактериального пипетирования: A. с. 60040. Казахстан. 19.KZ13A4.11. 21165/ Кершанская О.И., Джангалина Э.Д. -№ 21165; Заявл. 05.05.2008; Бюл. № 9. - 4 с.
4. Hausler R.E., Hirsch H.-J., Kreuzaler F., Peterhansel C. Overexpression of C4-cycle enzymes in transgenic C3 plants: a biotechnological approach to improve C3-photosynthesis // J. Exp. Bot. - 2002. - V. 53. - P. 591-607.
5. Kershanskaya O.I., Ku M.S.B. Genetic modification of Photosynthesis as a first step to wheat transformation for increased yield // Biotechnology: Theory and Practice. - 2005. - N 4. - P. 10-22.
6. Ku M S B., Cho D., Ranade U., Hsu T.-P., Li X., Jiao D.-M., Ehleringer J., Miyao M., Matsuoka M. Photosynthetic performance of transgenic rice plants overexpressing maize C4 photosynthesis enzymes // Redesign Rice Photosynthesis / Ed. J. Sheehy. - Manilla: IRRI Press, 2000. - 236 p.
7. Leegood R.C. C4 photosynthesis: principles of CO2 concentration and prospects for its introduction into C3 plants // J. Exp. Bot. - 2002. - V. 53. - P. 581-590.
8. Matsuoka M., Furbank R.T., Fukayama H., Miyao M. Molecular engineering of C4 photosynthesis // Ann. Rev. of Plant Physiol. and Plant Mol. Biol. - 2001. - V. 52. - Р. 297-314.
9. Miyao M. Molecular evolution and genetic engineering of C4 photosynthetic enzymes // J. Exp. Bot. - 2003. - V. 54 (381), N 2. - Р. 179-189.
Рекомендовано к печати д.б.н. Митрофановой И.В.
Б1ОТЕХНОЛОГ1Я КЛОНАЛЬНОГО М1КРОРОЗМНОЖЕННЯ ЛАВАНДИ (LAVANDULA
ANGUSTIFOLIA MILL.)
Т.М. МАНУШК1НА, кандидат сыъсъкогосподарсъких наук Микола!вський державний аграрний ушверситет, Микола!в Л.О. БУГАСНКО, доктор б1олог1чних наук Кримський iнженерно-педагогiчний ушверситет, Омферополь
Вступ
Лаванда вузьколиста (Lavandula angustifolia Mill.) е одтею з основних ефiроолiйних рослин, що культивуються в свт. Ефiрна олiя та суцвггтя лаванди широко використовуються в парфумерно-косметичнш, фармацевтичнш i харчовiй промисловостях. Вирощування лаванди та одержання ефiрноi олii в нашiй краiнi зосереджене в Криму. В умовах ринкового виробництва плануеться до 2015 р. збшьшити площi, зайнятi пiд лавандою, до 10 тис. га, оскшьки вирощування uiei культури е рентабельним. Однак розширення насаджень лаванди стримуеться вiдсутнiстю садивного матерiалу. Шляхом виршення uiei проблеми може бути розробка бшьш iнтенсивних бiотехнологiчних методiв розмноження замiсть традицiйного живцювання.
У лiтературi виявлена досить обмежена кiлькiсть робгт, пов'язаних з бiотехнологiчними дослiдженнями роду Lavandula L. Анашз публiкацiй показуе, що бшьша частина лiтературних даних присвячена вивченню процесiв калусо- i морфогенезу [4, 8], а також накопичення вторинних метаболiтiв у кштинних культурах лаванди: монотерпеноiдiв [5], розмариновоi кислоти [7].
Першi дослiдження культури аткальних меристем лаванди розпочатi в 1нституп ефiроолiйних i лiкарських рослин Н.1. Мещеряковою i Г.А. Сарнецьким у 1985 роцi [3]. У подальшому проведенi нечисленнi дослiдження з клонального мiкророзмноження, присвяченi в основному вивченню гормональноi регуляцл розвитку аткальних меристем, що показують високу видову i сортову специфiчнiсть процесiв регенерацп рослин лаванди в умовах in vitro [1].
Виходячи з цього, метою наших дослщжень було вивчення впливу внутршшх i зовшшшх чинниюв на процеси морфогенезу в культурi iзольованих меристем лаванди i розроблення ефективних прийомiв клонального мiкророзмноження нових сортiв i перспективних зразкiв uiei цiнноi ефiроолiйноi рослини.
Об'екти та методи дослщження
Дослщження виконано в лаборатори бютехнологи 1нституту ефiроолiйних i лiкарських рослин УААН. Об'ектом дослщження служили рослини L. angustifolia сор^в Степова i Сiнeва та перспективних селекцiйних зразкiв 337-9 i 310-17.
Донорш рослини вирощували в умовах закритого грунту. Як експланти використовували ашкальш меристеми розмiром 0,2-1,0 мм, яю видiляли з верхiвкових та пазушних бруньок стебла однорiчних рослин. При проведенш експериментально. роботи застосовували загальноприйнятi в культурi iзольованих тканин рослин методи [2].
Для культивування iзольованих меристем та мшроживщв використовували базове живильне середовище Мурасше i Скуга (МС) [6]. На кожному з етатв клонального мшророзмноження модифiкували гормональний склад живильних середовищ вiдповiдно до необхiдного шляху морфогенезу, доповнюючи !х кiнетином, 6-бензиламiнопурином (БАП), пбереловою кислотою (ГК), а-нафтилоцтовою кислотою (НОК), iндолiлоцтовою кислотою (1ОцК), iндолiлолiйною кислотою (1ОлК), препаратами «Емютим С» (ВАТ «Високий врожай», Украша) i «Етамон» (Всеросiйськiй науково-дослiдний iнститут хiмiчних засобiв захисту рослин, Росiя).
Експланти культивували в культуральнш кiмнатi при температурi 25-26°С, освiтленостi 23 клк, вщноснш вологостi повiтря 60-70%.
Результати та обговорення
У процес вивчення особливостей морфогенезу iзольованих ашкальних меристем лаванди в культурi in vitro визначали вплив ендо- та екзогенних факторiв i добирали оптимальш умови для розвитку експлантiв на чотирьох етапах клонального мiкророзмноження: iзолювання експланту, введення i iнiцiацiя його розвитку в умовах in vitro; власне мшророзмноження; укоршення мiкропагонiв; адаптащя мiкророслин до умов in vivo.
1золювання експланту, введення i Шщащя його розвитку в умовах in vitro. Стерилiзацiю експланпв проводили послщовним витримуванням фрагментiв пагонiв у 70 % -ному етанолi впродовж 40 секунд, 50 %-ному розчинi препарату «Брадофен» (АТ "Флорш", Угорщина) -12 хвилин, i тричi промивали в стерильнш дистильованiй водi. Дослщження показали, що такий спосiб стерилiзацii забезпечував вихiд стерильних меристем на рiвнi 100%, приживлюванiсть меристем складала 96-100%. Добiр оптимальноi концентрацii регуляторiв росту проводили на основi живильного середовища МС, що мiстило 0,7% агару. В результат дослiджень встановлено, що iзольованi меристеми лаванди характеризуются високою регенерацiйною здатнiстю (частота регенераци пагонiв складала 85-100% на вшх варiантах живильного середовища). Оптимальним виявилося живильне середовище, доповнене кiнетином (1,0 мг/л) i ГК (1,0 мг/л) - МС5, на якому частота регенераци складала 100%, розвивався основний пагш висотою 19,33 -42,98 мм з 5-8 парами листюв i 3,03-7,81 додаткових пагонiв.
Слiд зазначити, що у лаванди на першому етат клонального мiкророзмноження множинне пагоноутворення вiдбувалося за рахунок формування адвентивних пагошв, тодi як кiлькiсть бiчних пагонiв, що розвивалися з пазушних бруньок, складала лише 9,1-17,7% вщ загально. кiлькостi додаткових пагонiв на один експлант. Поряд iз загальними особливостями морфогенезу меристем лаванди в культурi in vitro виявлено значш вiдмiнностi мiж дослiджуваними генотипами за кшьюсними показниками основних бiометричних параметрiв мiкророслин. Виявленi вiдмiнностi в рост основного та додаткових пагонiв на першому етат клонального мшророзмноження зумовлювали рiзнi коефiцieнти розмноження: у сорту Сшева - 1:12,42; у сорту Степова - 1:10,06; у зразка 337-9 - 1:8,55; у зразка 310-17 - 1:7,18.
Проведене дослщження не виявило суттево. рiзницi в регенерацшнш здатностi апiкальних меристем лаванди, видшених з верхiвкових i пазушних бруньок пагону. У всiх генотишв лаванди при культивуваннi меристем спостершалася висока частота регенераци (90-100%), i частота формування множинних пагонiв (68,8-100%).
Ашкальш меристеми лаванди вводили в культуру in vitro в чотири строки, яю вщповщали окремим фенофазам: у кв^ш - у фазу весняного вщростання; в третш декадi червня - першiй декадi липня - у фазу бутонiзацii-початку цвтння; в жовтнi - у фазу осшнього вiдростання; в сiчнi - у перюд спокою. У вш строки введення в культуру in vitro меристеми виявилися здатними регенерувати рослини з високою частотою (90-100%) i утворювати адвентивш пагони з частотою 85-100%. Поряд з цим установлено, що оптимальним строком для введення меристем е фази весняного i осшнього вщростання пагошв (квтонь i жовтень), коли регенерували рослини з
нормальними морфолопчними ознаками, формувалися найвищi основш пагони i найбiльша кiлькiсть додаткових пагонiв.
Власне мiкророзмноження. На даному еташ як експланти використовували мiкроживцi, якi одержували при роздшенш основного пагона меристемних рослин на фрагменти довжиною 48 мм з однieю парою листюв та вiдокремленнi додаткових пагошв довжиною 4-8 мм з одшею парою розгорнутих листкiв. Найбiльш оптимальний розвиток мшропагошв вiдбувався на живильному середовищi МС5. Для одержання максимально!' кшькосп мериклонiв при подальшому субкультивуванш поеднували мiкроживцювання основних пагонiв та вщокремлення додаткових пагонiв. Генотипiчнi особливосп сортiв та зразкiв обумовлювали рiзну iнтенсивнiсть ростових процесiв i, як наслщок, рiзнi коефiцiенти розмноження: у сорту Сшева - 1:11,12; у сорту Степова - 1:10,42; у зразка 337-9 - 1:11,83; у зразка 310-17 - 1:6,72.
Вивчення особливостей розвитку меристемних рослин лаванди протягом десяти пасажв показало, що вони характеризуются високою регенерацшною здатнютю протягом усього термiну культивування in vitro. Частота регенерацп у сор^в Сшева, Степова i зразка 337-9 залишалася стабшьно високою до 10-го пасажу i складала 80,0-100,0%. Найнижчою регенерацiйною здатнiстю вiдрiзнявся зразок 310-17, у якого, починаючи з 5-го пасажу, частота регенерацп пагошв знижувалася до 72,5-47,5%. При цьому у дослщжуваних генотишв не спостершалося рiзких коливань коефiцiенту розмноження в рiзних пасажах, i цей показник збершався на стабiльному рiвнi у сорту Сшева i зразка 337-9 до 8-го пасажу (1:7,77-12,45 i 1:7,60-11,85 вщповщно), у сорту Степова - до 7-го пасажу (1:6,19-11,81), у зразка 310-17 - до 6-го пасажу (1:6,14-8,37). Таким чином, при клональному мшророзмноженш лаванди доцшьно проводити 6-8 пасажв залежно вщ генотипу.
Укоршення мшропаготв в умовах in vitro. Найбшьш ефективним для шдукцп коренеутворення у мiкропагонiв лаванди виявилося живильне середовище 'ЛМС, доповнене 1ОлК та 1ОцК в концентрацiï по 0,5 мг/л - МС18, на якому частота укоршення становила 100% у сор^в Сшева, Степова i у зразка 337-9, та 85% у зразка 310-17. В наших дослщженнях випробовували також ефектившсть рютрегулюючих препарапв «Емютим С» та «Етамон» для стимулювання коренеутворення у мшропагошв лаванди в умовах in vitro. Показано, що при включенш до складу живильних середовищ «Емiстим С» в розведенш 10-6 та «Етамон» в концентраци 0,001% частота укоршення мшропагошв складала 90-100%.
Адаптаця мшророслин до умов in vivo. Для адаптаци вщбирали мiкророслини лаванди з добре розвиненою кореневою системою i висаджували в горщечки об'емом 200 мл зi стерильним субстратом рiзного складу. Горщечки з рослинами розмщували пiд плiвковим укриттям i культивували при температурi 18-20°С i постшному зволоженнi. Найвища приживлюванiсть мiкророслин вшх генотипiв - 95-100% була забезпечена на субстрат торф: перлiт: грунт: шсок у спiввiдношеннi 2:1:1:1. Визначено, що для адаптаци меристемних рослин лаванди до умов in vivo достатньо перюду 14 дiб, за яю формуеться 2-3 пари листюв. Пiсля перiоду адаптацiï плiвкове укриття знiмали i рослини культивували в звичайних умовах ще 46 дiб. Меристемнi рослини лаванди мали типовi для сортiв та зразкiв морфолопчш ознаки: форму куща, листкiв, суцвотя, забарвлення квiток. У жодному випадку у мериклошв не було вiдмiчено морфологiчних вiдхилень вiд норми.
У результат дослiджень вивчено особливостi морфогенезу iзольованих меристем лаванди (рис.) та розроблено вш етапи технологiï клонального мшророзмноження цiеï культури. За розробленою бютехнолопею в середньому за рш можна провести шiсть пасажiв. За розрахунками, проведеними на основi експериментальних даних, кiлькiсть мiкроживцiв з одше1' iзольованоï меристеми за цей перюд може складати: у сорту Сшева - 23,1 млн. шт., у сорту Степова - 6,0 млн. шт., у зразка 337-9 - 9,3 млн. шт., у зразка 310-17 - 1,1 млн. шт. При одержанш саджанщв за рш можна провести етап введення, чотири пасаж на еташ власне мшророзмноження, етапи укоршення мшропагошв i адаптаци до умов in vivo. Сумарний вихщ саджанщв з одше1' меристеми за рш складав: у сорту Сшева - 208 тис. шт., у сорту Степова - 119 тис. шт., у зразку 337-9 - 149 тис. шт., у зразку 310-17 - 23 тис. шт.
I
"V4
у!
а
Рис. Морфогенез iзольованих меристем лаванди на чотирьох етапах клонального мжророзмноження: а - iзолювання експланта, введення i 1н1ц1ац1я його розвитку в умовах in vitro; б - власне мжророзмноження; в - укоршення мжропагошв; г - адаптащя мiкророслин
до умов in vivo
Висновки
1. Вивчено особливосп морфогенезу в KynbTypi iзольованих аткальних меристем L. angustifolia сортiв Сшева, Степова та перспективних селекцiйних зразюв 337-9 i 310-17.
2. На основi резyльтатiв дослiджень розроблено бютехнологда клонального мiкророзмноження лаванди.
Список л^ератури
1. Егорова Н.А. Микроразмножение лаванды in vitro // Вюник Харювського нацiонального аграрного yнiверситетy. Сер. Бюлопя. - 2002. - № 9 (1). - С. 65-71.
2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии культурных растений. - К.: Наук. думка, 1980. - 488 с.
3. Разработка технологии и средств механизации для выращивания посадочного материала лаванды, обеспечивающих выход черенков не менее 2 млн. с 1 га и 250 саженцев с 1 кв. м: Отчет о НИР / Институт эфиромасличных и лекарственных растений. № ГР 01850071679. - Симферополь, 1990. - 126 с.
4. Calvo M.C., Segura J. In vitro morphogenesis from explants of Lavandula latifolia and Lavandula stoechas seedlings // Scientia Hort. - 1988. - N 36. - P. 131-137.
5. Lappin G.J., Stride J.D., Tampion J. Biotransformation of monoterpenoids by suspension cultures of Lavandula angustifolia // Phytochemistry. - 1987. - V. 26, N 4. - P. 995-997.
6. Murashige T., Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. plant. - 1962. - V. 15, N 13. - P. 473-497.
7. Pavlov A.I., Ilieva M.P., Panchev I.N. Nutrient medium optimization for rosmarinic acid production by Lavandula vera MM cell suspension // Biotechnol. Progr. - 2000. - V. 16, N 4. - P. 668670.
8. Quazi M.H. In vitro multiplication of Lavandula spp. // Ann Bot. - 1980. - V. 45, N 3. - P. 361362.
Рекомендовано к печати д.б.н, проф. Митрофановой О.В.
ОСОБЛИВОСТ1 РОЗМНОЖЕННЯ В КУЛЬТУР1 IN VITRO GASTERIA VERRUCOSA (MILL.)
DUV.
Л.Г. МАРГ1ТАЙ, кандидат б1олог1чних наук Ужгородський нащональний ушверситет
Вступ
Гастерiя бородавчаста (Gasteria verrucosa) - рослина, яка належить до багаторiчних листкових сукулентв з родини Asphodelaceae. Батьювщиною i'i е Капська провшщя (ПАР). В Укра!ш
б
в
г
