БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ ШТАММА BACILLUS SUBTILIS НА ОСНОВЕ ДАННЫХ ПОЛНОГЕНОМНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 636.085.7

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ ШТАММА BACILLUS SUBTILIS НА ОСНОВЕ ДАННЫХ ПОЛНОГЕНОМНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ

Г.Ю. Лаптев1, д-р биол. наук, Д.Г. Тюрина2, канд. экон. наук,

1 2 Т.П. Дуняшев , Н.И. Новикова , канд. биол. наук,

1 2 Е.А. Йылдырым , д-р биол. наук, В.Х. Меликиди

Л.А. Ильина1, канд. биол. наук,

1 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Санкт-Петербургский государственный аграрный университет, Санкт-Петербург, Россия

2 ООО «БИОТРОФ», Санкт-Петербург, Россия

Целью исследований было секвенирование и функциональная аннотация генома штамма Bacillus subtilis для выявления генов, важных для выживания в условиях силоса и рубца, регуляции процессов ферментации кормов и микробиома пищеварительной системы. Нуклеотидные последовательности определяли с использованием прибора MiSeq («Illumina, Inc.», США) совместно с комплектом реактивов MiSeq Reagent Kit v3 (300-cycle) («Illumina, Inc.», США). Функциональную аннотацию генома проводили в программах PROKKA 1.12 (https://github.com/kbaseapps/ProkkaAnnotation http://vicbioinformatics.com/) и RAST 2.0 (https://rast.nmpdr.org). При проведении биоинформатической обработки данных полногеномного секвенирования штамма B. subtilis было идентифицировано несколько кластеров генов, связанных с повышенной устойчивостью к неблагоприятным факторам внешней среды. В том числе найдены гены, которые противодействуют пагубным эффектам увеличения осмолярности окружающей среды (гены глицин бетаин-связывающего белка OpuAc), гены, связанные с психротолерантностью (например, cspA) и синтезом молочной кислоты. В связи с этим, штамм является перспективным для его использования в качестве основы силосных заквасок в кормопроизводстве, а также как основы пробиотиков в животноводстве.

Ключевые слова: полногеномное секвенирование, Bacillus subtilis, осмопротектор, лактат

Для цитирования: Лаптев Г.Ю., Дуняшев Т.П., Йылдырым Е.А., Ильина Л.А., Тюрина Д.Г., Новикова Н.И., Меликиди В.Х. Биотехнологический потенциал штамма BACILLUS SUBTILIS на основе данных полногеномного секвенирования // АгроЭкоИнженерия. 2021. № 3 (108). С.111-117

BIOTECHNOLOGICAL POTENTIAL OF BACILLUS SUBTILIS STRAIN BASED ON WHOLE GENOME SEQUENCING DATA

G.Yu. Laptev1, DSc (Biology), E.A. Yildyrym1, DSc (Biology), L.A.

1 *1 • 2 T.P. Dunyashev , Ilyina , Cand. Sc. (Biology), D.G. Tiurina ,

Cand. Sc. (Economics), N.I. Novikova2, Cand. Sc. (Biology), V.Kh. Melikidi2

1Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education Saint Petersburg State

Agrarian University, Saint Petersburg, Russia

2

Biotrof Ltd., Saint Petersburg, Russia The aim of research was the sequencing and functional annotation of the genome of the Bacillus subtilis strain to identify genes important for survival in silage and rumen conditions, to control the feed fermentation and the microbiome of the digestive system. Nucleotide sequences were identified using a MiSeq instrument (Illumina, Inc., USA) together with a MiSeq Reagent Kit v3 (300-cycle) (Illumina, Inc., USA). Functional genome annotation was performed with PROKKA 1.12 (https://github.com/kbaseapps/ProkkaAnnotation http://vicbioinformatics.com/) and RAST 2.0 (https://rast.nmpdr.org) software tools. The bioinformatic analysis of the whole genome sequencing data of the B. subtilis strain identified several clusters of genes associated with increased resistance to unfavorable environmental factors, namely the genes that counteracted the pernicious effect of the increase in the osmolarity of the environment (genes of glycine betaine-binding protein OpuAc), genes associated with psychrotolerance (for example, cspA) and lactic acid synthesis. In this regard, the strain shows promise in its use as a basis for silage starter cultures in feed production, as well as the basis for probiotics in animal husbandry.

Key words: whole genome sequencing, Bacillus subtilis, osmoprotector, lactate

For citation: Laptev G.Yu., Dunyashev T.P., Yildyrym E.A., Ilyina L.A., Tiurina D.G., Novikova N.I. Melikidi V.Kh. Biotechnological potential of Bacillus Subtilis strain based on whole genome sequencing data. AgroEkoInzheneriya 2021. No. 3(108): 111-117 (In Russian)

Введение

Генетические детерминанты штаммов бактерий Bacillus sp., определяющие возможность биосинтеза разнообразных биологически активных соединений, представляют особый научный интерес, поскольку благодаря им эти микроорганизмы нашли широкое применение в качестве биопестицидов в растениеводческой практике, как основа терапевтических агентов и пробиотиков в животноводстве, а также как основа силосных заквасок в

кормопроизводстве. Как было показано рядом ученых (Phillip, Fellner, 1992, Moran et aI., 1993), внесение специфических штаммов бактерий B. subtilis и B. licheniformis в силос способствовало ингибированию роста плесневых грибов в силосе из многолетних трав и увеличивало аэробную стабильность силоса с высокой влажностью. В результате

проведения серии экспериментов

исследователями Weinberg с соавт. (Weinberg et al., 2003) было показано, что штаммы бактерий, входящие в состав заквасок, способны выживать и увеличивать численность в рубце жвачных при попадании в организм животных с потребляемым силосом, способствуя стабилизации рубцовой микробиоты, а значит, могут обладать одновременно и пробиотической

активностью.

Для силосной экосистемы характерны очень сложные внутренние связи и специфические закономерности динамики. Прежде всего, это среда с высоким уровнем кислотности и осмотическим давлением, порой достигающих экстремальных величин (Мак-Дональд, 1985), выживать и размножаться в которой могут только высококонкурентные штаммы. Поэтому

эффективная селекция микроорганизмов для создания заквасок подразумевает получение штамма бактерий, который не только будет превосходить другие штаммы по таким целевым признакам, как скорость подкисления и антагонистическая активность, но и по способности эффективно конкурировать с эпифитными обитателями по приспособленности к среде обитания.

Целью исследований было

секвенирование и функциональная аннотация генома штамма Bacillus subtilis для выявления генов, важных для выживания в условиях силоса и рубца, регуляции процессов ферментации кормов и микробиома пищеварительной системы.

Материалы и методы

Материалом для исследования служил штамм B. subtilis из коллекции ООО «БИОТРОФ». Выделение ДНК проводили по стандартным методикам с использованием набора Genomic DNA Purification Kit («Fermentas, Inc.», Литва). Библиотеку ДНК для полногеномного секвенирования готовили с помощью набора Nextera XT («Illumina, Inc.», США). Нуклеотидные

последовательности определяли с

использованием прибора MiSeq («Illumina, Inc.», США) совместно с комплектом реактивов MiSeq Reagent Kit v3 (300-cycle) («Illumina, Inc.», США). Недостоверные последовательности и адаптеры удаляли в программе Trimmomatic-0.38

(https://www.osc.edu/book/ex-port/html/4385). Отфильтрованные по длине не менее чем от 50 до 150 п.н. парноконцевые последовательности собирали de novo с использованием геномного сборщика SPAdes-3.11.1 (http://cab.spbu.ru/software/spades/). Функциональную аннотацию генома проводили в программах PROKKA 1.12 (https://github.com/kbaseapps/ProkkaAnnotation http://vicbioinformatics.com/) и RAST 2.0 (https://rast.nmpdr.org).

Результаты и обсуждение

При проведении биоинформатической обработки данных полногеномного секвенирования штамма B. subtilis было идентифицировано несколько кластеров генов, связанных с повышенной устойчивостью к неблагоприятных факторам внешней среды (табл. 1).

Таблица 1

Гены B. subtШs, связанные с адаптацией к неблагоприятных факторам внешней среды

№ Неблагоприятные внешние воздействия Количество генов в геном отвечающих за адаптацию

1 Высокое осмотическое давление 14

2 Окислительный стресс 44

3 Токсический стресс 11

4 Холодовой шок 3

5 Тепловой шок 17

6 Углеродное голодание 3

7 Прочие стрессы 14

Расшифровка генома с использованиемслеткам адаптироваться к низким температурам базы данных RAST предсказала активацию 106и выживать при подмораживании силосной генов отвечающих за адаптацию ктраншеи в течение зимнего сезона, что очень неблагоприятным внешним воздействиямважно для большинства регионов на территории включающим повышенное осмотическошашей страны. Одним из путей адаптации у давление, окислительный и токсический стрессш, тамма B. subtilis к повышенному холодовой шок, снижение питательных веществосмотическому давлению является механизм в среде. Например, присутствие в геноме ^синтеза глицин бетаин-связывающего белка subtilis группы генов семейства cspA, которы^OpuAc), являющегося очень эффективным активируются в ответ на понижениеосмопротектором (Smits et al., 2008) (рис. 1). температуры (Beno et al., 2014), позволяет

холин

холин дегидрогеназа (Ее): Ec-betA

холин дегидрогеназа (Cs): Cs-betA 1.1.99.1

бетаин альдегид

бетаин альдегид дегидрогеназа (Ее): Ec-betB 1.2.1.8

глицин бетаин

Рис. 1. Путь биосинтеза осмопротектора глицин бетаин-связывающего белка (ОриАс) у В.

subtilis

Кроме того, показано что штамм бактерии B. subtilis обладает уникальным потенциалом синтеза ферментов L-лактатдегидрогеназ, приводящих к

образованию L-молочной кислоты. Это важный вывод, поскольку молочная кислота известна своей антимикробной активностью в отношении многих патогенных

микроорганизмов (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica и др.) (Alakomi et al., 2000). Ранее (Ortiz A., Sansinenea, 2020) было показано, что штамм Bacillus megaterium ELI 24, выделенный из

почвы в Мексике, секретировал значительные количества янтарной кислоты, которая была идентифицирована спектроскопическими методами.

Выводы

При проведении биоинформатической обработки данных полногеномного секвенирования штамма B. suЫШs было идентифицировано несколько кластеров генов, связанных с повышенной устойчивостью к неблагоприятных факторам внешней среды. В том числе, найдены гены, которые противодействуют пагубным

эффектам увеличения осмолярности окружающей среды, гены, связанные с психротолерантностью и синтезом молочной кислоты. В связи с этим, штамм является

перспективным для его использования в качестве основы силосных заквасок в кормопроизводстве, а также, как основы пробиотиков в животноводстве.

Исследование выполнено при поддержке гранта РФФИ№19-316-90041«Полногеномное секвенирование штаммов бацилл, выделенных изрубцового содержимого различных жвачных животных»

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Мак-Дональд П. Биохимия силоса. М.: Агропромиздат, 1985. 271 С.

Weinberg Z.G., Muck R.E., Weimer P.J. The survival of silage inoculant lactic acid bacteria in rumen fluid // Journal of Applied Microbiology. 2003. Vol. 94, pp. 1066-1071.

2. Phillip L.E., Fellner Y. Effects of bacterial inoculation of high-moisture ear com on its aerobic stability, digestion, and utilization for growth by beef steers // J. Anim. Sci. 1992. Vol. 70, pp. 3178-3187.

3. Moran J.P., Pullar D., Owen T.R. The development of a novel bacterial inoculant to reduce mould spoilage and improve the silage fermentation in big bale silage. In: P. O'Kiely et al. (ed.) Silage Research 1993. Proc. 10th Int. Conf. Silage Res., Dublin, Ireland (6-8 Sept. 1993). Dublin: Dublin City University. 1993, pp. 85-86.

4. Alakomi H.L., Skytta E., Saarela M., Mattila-Sandholm T., Latva-Kala K., Helander I.M. Lactic acid permeabilizes gram-negative

bacteria by disrupting the outer membrane. Applied and Environmental Microbiology, 2000, No. 66(5): 2001- 2005 DOI:

10.1128/aem.66.5.2001-2005.2000

5. Ortiz A., Sansinenea E. Succinic Acid Production as Secondary Metabolite from Bacillus megaterium ELI24. The Natural Products Journal, 2020, Vol.10, Issue 2: 154-157. DOI: 10.2174/2210315509666190410153811

6. Smits, S. H., Höing, M., Lecher, J., Jebbar, M., Schmitt, L., Bremer, E. The compatible-solute-binding protein OpuAC from Bacillus subtilis: ligand binding, site-directed mutagenesis, and crystallographic studies. Journal of Bacteriology, 2008. Vol. 190 Issue 16, pp. 5663-5671. DOI: 10.1128/JB.00346-08

7. Beno, S. M., Orsi, R. H., Cheng, R. A., Kent, D. J., Kovac, J., Duncan, D. R., Martin, N. H., Wiedmann, M. Genes Associated with Psychrotolerant Bacillus cereus Group Isolates. Frontiers in Microbiology, 2019. Vol.10, p. 662. DOI: 10.3389/fmicb.2019.00662

REFERENCES

McDonald P. The Biochemistry of Silage. Chichester, England: John Wiley. 1981, 200 p. (Russ. McDonald P. Biokhimiya silosa. Moscow: Agropromizdat, 1985. 271 p.)

Weinberg Z.G., Muck R.E., Weimer P.J. The survival of silage inoculant lactic acid bacteria in rumen fluid // Journal of Applied Microbiology. 2003. Vol. 94: 1066-1071.

Phillip L.E., Fellner Y. Effects of bacterial inoculation of high-moisture ear com on its aerobic stability, digestion, and utilization for growth by beef steers // J. Anim. Sci. 1992. Vol. 70: 3178-3187.

3. Moran J.P., Pullar D., Owen T.R. The development of a novel bacterial inoculant to reduce mould spoilage and improve the silage fermentation in big bale silage. In: P. O'Kiely et

al. (ed.) Silage Research 1993. Proc. 10th Int. Conf. Silage Res., Dublin, Ireland (6-8 Sept. 1993). Dublin: Dublin City University. 1993: 8586.

4. Alakomi H.L., Skyttä E., Saarela M., Mattila-Sandholm T., Latva-Kala K., Helander I.M. Lactic acid permeabilizes gram-negative bacteria by disrupting the outer membrane. Applied and Environmental Microbiology, 2000, No. 66(5): 2001- 2005 DOI: 10.1128/aem.66.5.2001-2005.2000

5. Ortiz A., Sansinenea E. Succinic Acid Production as Secondary Metabolite from Bacillus megaterium ELI24. The Natural

Products Journal, 2020, Vol.10, Issue 2: 154-157. DOI: 10.2174/2210315509666190410153811

6. Smits, S. H., Höing, M., Lecher, J., Jebbar, M., Schmitt, L., Bremer, E. The compatible-solute-binding protein OpuAC from Bacillus subtilis: ligand binding, site-directed mutagenesis, and crystallographic studies. Journal of Bacteriology, 2008. Vol. 190 Issue 16: 56635671. DOI: 10.1128/JB.00346-08

7. Beno, S. M., Orsi, R. H., Cheng, R. A., Kent, D. J., Kovac, J., Duncan, D. R., Martin, N. H., Wiedmann, M. Genes associated with psychrotolerant Bacillus Cereus group isolates. Frontiers in Microbiology, 2019. Vol.10: 662. DOI: 10.3389/fmicb.2019.00662