CC BY
121
ISSN 0131-5226. Сборник научных трудов.
ГНУ СЗНИИМЭСХРоссельхозакадемии. 2008. Вып. 80.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Агафонов Н.В. Научные основы размещения и формирования деревьев / Н.В. Агафонов. - М.: Колос, 1983.
2. Кудрявец В.П. Продуктивность яблони /В.П. Кудрявец. - М.: Агропромиздат, 1987.
3. Девятов А.С. Повышение качества плодовых деревьев и урожайности садов /А.С. Девятов. - Минск: Ураджай, 1985.
Получено 31.03.2008.
УДК 634.75.631.53.
Г.П. АТРОЩЕНКО, д-р с.-х. наук ЛПООС
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ОЗДОРОВЛЕНИЯ И РАЗМНОЖЕНИЯ ЗЕМЛЯНИКИ СОРТОВ СЕЛЕКЦИИ ЛПООС
Методически обоснованы и технологично разработаны основные этапы оздоровления и клонального микроразмножения различных сортов земляники селекции ЛПООС.
Оздоровление растений методом верхушечных меристем. Метод культуры изолированных тканей в последние годы широко используется для решения многих вопросов селекции, вирусологии и питомниководства. Одним из аспектов применения метода культуры верхушечных меристем в сельскохозяйственной практике является использование его для оздоровления растений от вирусной, микоплазменной, нематодной и грибной инфекции.
Метод получения здоровых растений из верхушечных меристем основан на том, что в зоне анимальной меристематической ткани побегов наблюдается очень низкая концентрация вирусов и микоплазм или их полной отсутствие. Кроме этого, меристематическая верхушка растений всегда свободна от нематод и грибных патогенов [1].
Процесс получения свободных от инфекций растений включает: 1) отбор подходящих эксплантов, их стерилизацию и перенос на питательную среду; 2) пролиферацию побегов на среде для размноже-
85
Технологии и технические средства механизированного производства продукции растениеводства и животноводства.
ния (собственное микроразмножение); 3) укоренение размножаемых побегов и высадку в грунт [2].
При введении эксплантов земляники в стерильную культуру большое значение имеет стерилизация растительного материала, от которой зависит инфицированность эксплантов, их состояние и степень развития.
В качестве источников эксплантов при культивировании в стерильных условиях в опытах нами были использованы верхушечные почки или вновь сформированные рожки. Выявлено, что наиболее подходящий срок для введения в культуру - активная фаза вегетации.
Почки или рожки очищали от верхних листьев и помещали под проточную воду на 1 час, после чего споласкивали дистиллированной водой. Для освобождения исходного материала от сапрофитной микрофлоры проводили его стерилизацию. Многие исследователи в качестве стерилизаторов используют различные химические вещества, в том числе и ртутьсодержащие сулему и диацид.
Мы применили малотоксичный способ стерилизации - обработку растительного материала 13%-ным раствором перекиси водорода при экспозиции 1 мин. После стерилизации материал промывали 3 раза стерильной дистиллированной водой и переносили на стерильные увлажненные фильтры в чашки Петры.
Операцию изоляции эксплантов проводили в стерильных условиях рабочей зоны ламир-боксов. Вычленение меристематической верхушки осуществляли под бинокуляром при 30-40-кратном увеличении. После вычленения меристематические верхушки помещали на поверхность стерильной питательной среды. Для регенерации экс-плантов земляники применяли среду на основе рецепта Мурасиге-Скуга. В питательную среду вводили добавки, мг на 1 л: аскорбиновую кислоту 1,0; диамин, пиридоксин, никотиновую кислоту - по 0,5; инозит - 100; сахарозу 30000; 6 БАП - 0,5; агар - 7000. Экспланты культивировали при 16-часовом световом дне, освещенности 3-3,5 тыс. лк, температура 22-24 0С и относительной влажности в помещении 70-75%.
Обычно для эффективного освобождения от инфекции используются экспланты меристем размером 0,1-0,3 мм. Однако, чем меньше размер экспланта, тем труднее он приживается и регенерирует в целое растение. Низкая регенерационная способность эксплантов таких размеров часто связана с ингибированием ростовых процессов эксплан-
86
ISSN 0131-5226. Сборник научных трудов.
ГНУ СЗНИИМЭСХРоссельхозакадемии. 2008. Вып. 80.
тов токсическими веществами (продуктами фенольного окисления), выделяемыми ими в питательную среду. Особенно это наблюдается в жаркую погоду, когда у растений земляники происходит наиболее интенсивный обмен фенополов.
Для снижения фенольного окисления используются химические вещества - антиоксиданты. Так, для эксплантов ряда культур полезной является обработка их аскорбиновой или лимонной кислотой [3].Рост и регенерацию иногда можно улучшить добавлением в питательную среду некоторых антиоксидантов: аскорбиновой кислоты -1 мг/л, глюконата - 4-5 мг/л, дитиотриэтола - 1-3 мг/л, диэтилдитио-карбоната 2-5 мг/л [4].
Изложенные сведения обусловили необходимость начать поиск химических веществ для снижения фенольного окисления экс-плантов при введении их в культуру. Использовали антиоксиданты в питательных средах, как в раздельном их применении, так и в смесях: аскорбиновая кислота - 1 мг/л, лимонная кислота - 1 мг/л, ДИЕКА (диэтилдиокарбонат натрия) - 2,0 мг/л. Для улучшения роста эксплантов в смесь антиоксидантов включали глицин - 3 мг/л.
Как показали наши опыты, раздельное применение антиоксидантов не дало желаемого результата в связи с тем, что каждый из препаратов действует только на определенный фермент, блокируя его и не реагируя на другие ферменты, которые окисляют фенолы растений.
Наибольший антиоксидантный эффект отмечен после применения смеси препаратов. При этом регенерационная способность эксплантов земляники повысилась в 1,5-2 раза (табл. 1).
Из всех антиоксидантов наиболее сильным действием обладает ДИЕКА (диэтилдитиокарбонат натрия), т. к. он реагирует на фермент полифенолоксидазу, посредством которой окисляется большинство фенольных соединений у земляники. Кармамятные вещества этого препарата блокируют ион меди, от которого зависит деятельность фермента [5].
87
Технологии и технические средства механизированного производства продукции растениеводства и животноводства.
Таблица 1
Влияние антиоксидантов на регенерационную способность эксплантов земляники
Антиоксидант Доза вещества, мг/л Количество прижившихся эксплантов земляники по сортам, %
Сударушка Царскосельская Отличница Находка
Аскорбиновая кислота 1,0 38,1 35,4 42,0 40,0
Лимонная кислота 1,0 44,2 35,0 43,8 42,5
ДИЕКА 2,0 56,4 42,1 52,8 46,5
Аскорбиновая кислота + лимонная кислота + ДИЕКА К> н-» нО О о 75,0 59,0 77,6 62,8
Контроль без обработки _ 37,8 34,2 38,3 35,0
Особенности клонального микроразмножения различных сортов земляники селекции Ленинградской плодоовощной опытной станции. При ускорении производства посадочного материала оздоровленных клонов сортообразцов земляники селекции ЛПООС значительная роль принадлежит способам ускоренного интенсивного размножения. Одним из таких способов является клональное микроразмножение на искусственных питательных средах в стерильных условиях.
Клональное микроразмножение растений - это массовое бесполое размножение в культуре клеток и тканей in vitro, при котором полученные новые формы генетически идентичны исходному экземпляру. Главное преимущество микроразмножения перед обычными способами вегетативного размножения заключается в чрезвычайно высоком потенциале размножения, что обеспечивает возможность получения огромного количества однородного посадочного материала [6]. Учитывая высокий биологический потенциал земляники сортообразцов селекции ЛПООС, возникла необходимость изучить особенно-
88
ISSN 0131-5226. Сборник научных трудов.
ГНУ СЗНИИМЭСХРоссельхозакадемии. 2008. Вып. 80.
сти их клонального микроразмножения. В связи с этим и были проведены исследования на разных этапах культивирования эксплантов.
Успех выращивания изолированных меристематических верхушек в значительной степени зависит от правильно подобранной питательной среды. В настоящее время наиболее широкое распространение получила среда Мурасиге-Скуга, отличительной чертой которой является высокое содержание азота, калия и аммония по сравнению с другими средами. Эта среда используется многими исследователями и для клонального микроразмножения земляники, при этом коэффициент размножения за один пассаж достигает величины 15-20 при концентрации 6-БАП всего1 мг/л.
Однако для более полной реализации биологического потенциала различных сортов земляники селекции ЛПООС потребовалось проведение исследования по оптимизации питательной среды. В частности, в модифицированной питательной среде вместо хлорида кальция использовали нитрат кальция - 500 мг/л. Это позволило устранить отрицательное воздействие хлорид-ионов на развитие эксплантов. Также был введен в питательную среду гидролизат казеина 200 мг/л, который способствовал росту и развитию эксплантов. Содержание ипозита увеличили в 2 раза, что составило 200 мг/л. Набор витаминов по содержанию и количеству был таким же, как на этапе введения в культуру в процессе оздоровления.
Как показали исследования, наибольший коэффициент размножения за один пассаж у эксплантов земляники получен на модифицированной питательной среде. При этом выход микропобегов и хорошо развитых почек увеличился в зависимости от сорта на 20-30% (табл. 2).
Укоренение побегов. На этом этапе необходимо обеспечить развитие нормальной корневой системы, после чего растения переносят в нестерильные условия.
Как показали наши опыты, из испытанных индукторов ризоге-неза наиболее эффективной оказалась индолилуксусная кислота (ИУК), которую вводили в питательную среду в концентрации 1 мг/л. В качестве минеральной основы применяли разбавленную вдвое среду Мурасиге-Скуга, полный набор витаминов (как и в среде микроразмножения), 15-20 г/л сахарозы и исключали инозит.
По нашим наблюдениям первые корешки появились через 8-10 дней, и спустя месяц процент укоренения достиг 85-95%. Через
89
Технологии и технические средства механизированного производства продукции растениеводства и животноводства.
1,5-2 месяца после посадки побегов на питательную среду пробирочные растения земляники образовали достаточно хорошо развитую мочковатую корневую систему.
Таблица 2
Влияние питательной среды на коэффициент размножения эксплантов земляники сортов селекции ЛПООС
Сорт Коэффициент размножения эксплантов на питательных средах
Мурасиге-Скуга Модифицированный
Сударушка 28,2 40,0
Царскосельская 25,6 30,4
Отличница 27,0 36,2
Находка 23,0 29,0
Перенесение растений в нестерильные условия. Один из важных этапов в технологии производства оздоровленного посадочного материала in vitro - адаптация микроразмноженных растений в нестерильных условиях. Для высадки в почвенные субстраты используют только те растения, которые полностью сформировали хорошо развитый стебель и корневую систему из 2-34 корней длиной 5-7 см.
Как показали наши опыты, наиболее благоприятные сроки для пересадки пробирочных растений в нестерильные условия - мартиюль. В эти сроки наблюдается высокий процент приживаемости (90-95%).При выведении микроразмноженных растений в нестерильные условия в марте-апреле и высадке их в полевые условия в конце мая, к концу вегетации развиваются мощные кусты, дающие уже в этот год плети усов.
Посадку пробирочных растений осуществляли в торфяные горшки с субстратом, состоящим из смеси низового торфа и песка в соотношении 1:1. Для поддержания высокой влажности растения закрывали стеклянными банками в течение двух недель. Освещенность при таком содержании поддерживали около 2000 лк. Для ускорения роста и развития растений в течение 2-3 недель поливая их, разбавляли воду на % раствором минеральной основы среды Мурасите-Скуга.
Отклонений морфологических признаков у растений-регенератов от родительских экземпляров не отмечалось. Сформиро-
90
ISSN 0131-5226. Сборник научных трудов.
ГНУ СЗНИИМЭСХРоссельхозакадемии. 2008. Вып. 80.
вавшиеся в нестерильных условиях растения отличались хорошим ростом и при использовании их в качестве маточных не уступали по продуктивности растениям, полученным обычным путем вегетативного размножения.
Резюмируя результаты, следует подчеркнуть, что в итоге исследований нами были научно обоснованы биотехнологические аспекты оздоровления и размножения различных сортов земляники селекции ЛПООС. Это позволило выращивать оздоровленный посадочный материал, пригодный для закладки маточников высших категорий, а именно на ЛПООС супер-суперэлитной рассадой был заложен маточник на площади 2400 м2, и передан пробирочный материал в другие питомники.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Walker D.C. In vitro methods for viruses elimination. In: Frontirs of plant Tissue Culture, ed. T.A.Thorpe. Calgary University, 1978, 245-254.
2. Атрощенко Г.П., Соколова Н.Г., Михайлова Е.В. Оздоровление посадочного материала земляники. В ст. ЛГАУ «Защита сельскохозяйственных культур от вредителей, болезней и сорняков», Л. 1991, 75-78.
3. Mantell S.H., Smith H. Plant Biotechnology. Cambridge University Press, London, 1985, 160-181.
4. Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихоненко Т.И. Основы сельскохозяйственной биотехнологии/ Г.С. Муромцев, Р.Г. Бутенко, Т.И. Тихоненко. - М.: Во Агропромиздат, 1990.
5. Hampton R.E., Fulton F.W. Strawberry virus dissemination in Arkansas. Phytopatology. 1961. № 50, 477-479.
6. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений/ Н.В. Катаева,Р.Г. Бутенко. - М.: Наука, 1983.
Получено 23.03.2008.
УДК 634.75.631.521(470.23)
91
