CC BY
114
УДК 579.22+577.15
И. В. Жерносекова, А. А. Тымчук, А. Г. Понизовцева,
Н. П. Черногор, А. И. Винников
Днепропетровский национальный университет
БИОСИНТЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МУТАНТНОГО ШТАММА STREPTOMYCES RECIFENSIS VAR. LYTICUS 2Р-15 В ПРИСУТСТВИИ ЭКЗОГЕННЫХ АМИНОКИСЛОТ
Досліджено дію екзогенних амінокислот на прояв біосинтетичної активності ри-фампіциностійкого штаму 2Р-15. Показано, що амінокислоти в оптимальних концентраціях (50, 100, 200 мкг/мл) викликають максимальне збільшення синтезу білка, накопичення біомаси, активності стафілолітичних ферментів і продуктивності стрептоміцету в умовах глибинної ферментації. Усі досліджені амінокислоти забезпечили підвищення стимулювальної активності штаму в 2,0-3,7 раза.
The effect of exogenous amino acids on the biosynthetical activity of rifampycin-resistant strain 2P-15 was studied. Added to the cultivation medium of mutant 2P-15 the optimal concentrations of amino acids (50, 100, 200 mcg/ml) inсreaced a synthesis of protein, biomass, activity of staphylococcus-lytic enzymes and productivity of the strain under conditions of the subsurface fermentation. All investigated amino acids increased the stimulating activity of mutant sfrain 2P-15 by 2.0-3.7 times.
Введение
Коммерческое производство продуктов, которые синтезируются микроорганизмами в результате их жизнедеятельности, является приоритетом традиционной биотехнологии. В последнее время существенно расширился список ценных биотехнологических продуктов, с помощью которых преодолеваются продовольственные, энергетические, сырьевые и экологические проблемы. Для создания высококачественного продукта необходимо наличие высокоактивных культур микроорганизмов -продуцентов биологически активных веществ, получение которых возможно как традиционными методами селекции, пропластированием, так и методами генетической инженерии [З; б; І4; І5]. Для реализации высокой активности штаммов продуцентов большое значение имеют физико-химические показатели среды, источники питания, экзогенные факторы роста: аминокислоты, пурины, пиримидины, требуемые в малых количествах [І5-І8]. У многих микроорганизмов потребности в питательных веществах изучены пока недостаточно и их удается культивировать лишь на средах, содержащих сложные природные компоненты, такие как сыворотка крови, жидкость рубца, дрожжевой автолизат или пептоны [4; І6].
Микроорганизмы способны изменять свой обмен в соответствии с изменениями окружающей среды, что открывает возможность для управления их ростом и ферментативной активностью [З; І7]. Применение различных стимуляторов вызывает изменение метаболических процессов у микроорганизмов в сторону увеличения выхода конечного продукта, повышения интенсивности окислительновосстановительных процессов, биосинтеза белка и проницаемости клеточных мембран [І7; 20]. Особого внимания заслуживают стимуляторы химической природы -ростовые факторы и предшественники синтеза макромолекул, а именно аминокислоты. Внесение гистидина и глутаминовой кислоты в среду культивирования грибов -продуцентов пектолитических ферментов вызывает усиление их роста и активизацию синтеза энзимов [І]. Экзогенный метионин усиливает синтез щелочных и нейтральных экзопротеаз у Acremonium chrysogenum [ІЗ], лизин - биосинтез цефалоспо-
© И. В. Жерносекова, А. А. Тымчук, А. Г. Понизовцева, Н. П. Черногор, А. И. Винников, 2007
ЗЗ
рина С у С. aeramonium [26], а также пенициллина у Р. chrysogenum [25], глутаминовая кислота повышает выход тилозина у S. fradiae [21]. Аланин и цистеин усиливают в 1,5-3,0 раза рост и накопление белка в мицелии гриба Fusarium [7]. Ауксинообра-зование у фото- и гетеротрофных бактерий [8; 10; 11] также усиливается под воздействием экзогенных аминокислот. Добавление триптофана в концентрациях 50200 мкг/мл в среды выращивания культур Sphingomonas sp. 18, Mycobacterium sp. 1, Rhizobium sp. 5 увеличивает образование ауксина (ИУК) в 28, 30, 34 раза, а к бактериям Rhodococcus sp. 37 и Pseudomonas sp. 24 - в 124 и 103 раза соответственно [19]. Эксперименты in vitro показали, что только некоторые бактериальные культуры могут синтезировать небольшое количество ИУК без добавления экзогенного триптофана, являющегося его метаболическим предшественником [9; 23].
Учитывая то, что аминокислоты служат строительными блоками для образования основных компонентов микробных клеток - белков, а также ферментов, способствуя усилению биосинтетических процессов у многих микроорганизмов, авторы задались целью установить влияние экзогенных аминокислот на проявление биосинтетических свойств мутантного штамма стрептомицета 2Р-15.
Материал и методы исследований
Объект исследования - штамм стрептомицета, устойчивый к рифампицину -Streptomyces recifensis var. lyticus 2P-15, синтезирующий комплекс бактериолитиче-ских ферментов и стимулятор роста [6; 20]. Исследования литической активности продуцента проводили с использованием музейного штамма S. aureus 209 Р и стимулирующей активности промышленного штамма C. tropicalis 51. Биосинтетическую активность определяли при глубинном культивировании штамма-продуцента на ферментационной среде на протяжении 72 ч при +28°С, в рабочем объеме среды 50 мл и частоте вращения качалки 220 об./мин. [6]. Массу мицелия стрептомицета, отфильтрованного, отмытого 5 % раствором ТХУ и высушенного при +105°С до постоянного веса, определяли весовым методом и выражали в мг/мл. В работе использовали аминокислоты фирмы «Реахим», которые добавляли после стерилизации до конечной концентрации 50, 100, 200 мкг/мл. Стафилолитическую активность определяли турбидиметрическим методом Isono [4] и выражали в ед./мл или ед./мг белка. Белок в пробах определяли методом Bradford [28].
При исследовании ростстимулирующей активности продуцента фильтраты культуральной жидкости (КЖ) предварительно инактивировали автоклавированием. Исследуемые растворы, разведенные 1 : 10, вносили в стерильную синтетическую среду Ридера из расчета 1 % от объема. Инокулятом служила суточная агаризованная культура дрожжей, приготовленная по стандарту мутности 10. О ростстимулирую-щей активности штамма 2Р-15 судили по величине прироста биомассы дрожжей в сравнении с контролем. Накопление биомассы дрожжей оценивали оптическим методом на КФК 2МП при 590 нм в кювете шириной 0,5 см. Стимулирующую активность рассчитывали по формуле, предложенной Черногор [20], и выражали в ед./мл. Все эксперименты проводили в трех повторностях и обрабатывали статистически.
Результаты и их обсуждение
Синтез белка штаммом 2Р-15 в присутствии треонина увеличился при действии всех исследуемых концентраций, достигнув максимального показателя 156 % к контролю (табл. 1). Показатели синтеза белка при минимальной (50 мкг/мл) и максимальной (200 мкг/мл) концентрации кислоты также превысили контроль, но в меньшей степени, и составили 147 и 139 % соответственно. Очевидно, концентрация треонина
100 мкг/мл является оптимальной для стрептомицета, вызывающей самое большое увеличение биосинтеза белка. Из данных литературы известно, что треонин не формирует аминокислотного фонда в микробной клетке, а сразу после проникновения в клетку включается в белок [2]. В присутствии ароматической аминокислоты триптофана биосинтез белка у продуцента стал выше контрольного уровня на 27 % только при минимальной ее концентрации. Известно, что ароматические аминокислоты полностью в неизменном виде используются микробной клеткой на биосинтетические цели [2].
Таблица 1
Биосинтетические характеристики штамма Streptomyces геа/ёпш уаг. 1уйст 2Р-15
в присутствии аминокислот
Концентрация аминокислот, мкг/мл Белок Биомасса Литическая активность Удельная активность Продуктив- ность Удельная скорость роста, ц
мг/мл % от К мг/мл % от К ед./мл % от К ед./мг коэфф. разл. ед./мг % от К -1 ч коэфф. разл.
Контроль 0,33 - 11,5±0,06 - 2800±148 - 8485 - 243,5 - 0,16 -
Трипто- фан 50 100 200 0,421 127 11,6±0,08* 101 4000±224 143 9501 1,1 344,8 141 0,16 1,0
0,289 87 11,6±0,06* 101 3733±96 133 12916 1,5 321,8 132 0,16 1,0
0,296 90 10,0±0,10 87 2600±132* 93 8783 1,0 260,0 107 0,14 0,9
Трео- нин 50 100 200 0,484 147 10,2±0,10 89 3733±101 133 7713 0,9 366,0 150 0,14 0,9
0,515 156 15,0±0,08 130 3733±98 133 7248 0,8 248,9 102 0,21 1,3
0,460 139 16,6±0,12 144 3200±82* 114 6956 0,8 192,8 79 0,23 1,4
Глута- миновая кислота 50 100 200 0,242 73 13,2±0,05 115 3466±86 124 14322 1,7 262,6 108 0,18 1,1
0,234 71 12,4±0,08 108 3466±82 124 14812 2,1 279,5 115 0,17 1,1
0,265 80 24,4±0,14 212 3200±79* 114 12075 1,4 131,1 54 0,34 2,1
Арги- нин 50 100 200 0,234 71 14,2±0,13 123 4533±183 162 19371 2,3 319,2 131 0,20 1,2
0,289 87 22,6±0,10 196 3200±96* 114 11073 1,3 141,6 58 0,31 1,9
0,242 73 10,8±0,06 94 4000±160 143 16529 1,9 370,4 152 0,15 0,9
Примечание: * - р < 0,05.
Присутствие аминокислот (глутаминовой и аргинина) не вызвало увеличения синтеза белка у мутантного штамма 2Р-15 ни в одной из исследуемых концентраций. Их показатели были ниже контрольного уровня и колебались в пределах 71-87 %. Это объясняется тем, что глутаминовая кислота очень быстро образует внутриклеточный пул и только частично расходуется для биосинтеза, а аргинин образует относительно большой пул, который сохраняется в течение длительного промежутка времени без каких бы то ни было изменений [2].
Все исследуемые аминокислоты обеспечили увеличение биомассы штаммом на разных уровнях. Присутствие экзогенного треонина при соответствующих концентрациях (100-200 мкг/мл) способствовало повышению биомассы на 30-44 %. Это связано с повышением удельной скорости роста - ц в 1,3 и 1,4 раза по сравнению с контролем. Глутаминовая кислота и аргинин увеличили накопление биомассы штамма до максимального значения 212 и 196 % соответственно, где ц превысила контроль в 2,1 и 1,9 раза. Аминокислота триптофан не вызывала активного накопления биомассы, так как ц колебалась в пределах контрольного уровня.
Анализируя активность стафилолитических ферментов, синтезируемых продуцентом, следует отметить, что все исследуемые аминокислоты вызывают повышение активности стафилолизинов в пределах 114-162 %. Максимальный показатель активности выявлен в присутствии аргинина в концентрации 50 мкг/мл, что и обеспечило самый высокий показатель удельной активности на уровне 19371 ед./мг. Известно, что синтез ферментов усиливается в присутствии экзогенных аминокислот, вносимых в питательную среду для культивирования плесневых грибов, вслед-
ствие непосредственного включения их в молекулу активного белка. Авторы полагают, что «аминокислоты-стимуляторы» компенсируют недостающие свободные внутриклеточные аминокислоты, необходимые для синтеза фермента [17].
Поскольку в большинстве опытов стабильные биосинтетические характеристики штамма 2Р-15 получены с использованием экзогенного треонина, представляло интерес выяснить возможность замены в среде культивирования продуцента источника азотного питания, а именно соли на треонин в концентрации 100 мкг/мл.
Из литературы известно, что аминокислоты служат вторыми по значению питательными субстратами после сахаров и являются для бактерий источниками углерода, азота и энергии [5; 16]. Замена источника азота на треонин привела к снижению всех исследуемых биосинтетических характеристик мутантного штамма 2Р-15 (табл. 2, 3).
Таблица 2
Биосинтетические характеристики штамма ЗЬгврЬотусвя гесї/етїя уаг. Ьуйсж 2Р-15 при замене источника азотного питания
Вариант опыта Белок Биомасса Литическая активность Удельная активность Продуктив- ность
мг/мл % от К мг/мг % от К ед./мл % от К ед./мг коэфф. разл. ед./мг % от К ч-1 % от К
Контроль G,46 1GG 9,6G±G,G4 1GG 2G89±7G,81 1GG 4541 1,G 217,б 1GG G,13 1GG
Опыт д G,1G4 22 8,58±G,G3* 89 Ю44±34,бб* 5G 1GG38 2,2 122,G 5б G,12 92
Примечание: Л - среда с заменой источника азота; * -р > 0,05.
Таблица З
Стимулирующая активность штамма Streptomyces recifensis var. lyticus 2Р-15 на клетках Candida tropicalis
Вариант опыта Конц. КЖ, % Оптическая плотность, ОД 59G нм Стимули- рующая активность Белок Удельная стимулирующая активность
X±m % от К д% контр. КЖ, % ед./мл % от К мг/мл ед./мг коэфф. различия
Контроль без КЖ G G,i7±G,G3 iGG G - G - - - -
КЖ без аминокислот І G,3G±G,G8* І7б 7б iGG 253G 1GG G,33 7ббб i,G
КЖ + триптофан 50 І G,43±G,iG* 253 І53 І43 51GG 2G1 G,42 І2І43 І,б
КЖ + треонин 100 І G,46±G,G5 27G 17G І53 567G 224 G,52 1G9G4 1,4
КЖ + глутаминовая кислота 100 І G,39±G,G5 229 І29 13G 43GG 17G G,23 І8б9б 2,4
КЖ + агринин 100 І G,65±G,G3 382 282 2І7 94GG 37І G,29 324І4 4,2
Примечание: * - р < G,G5.
Уровень белка был снижен на 78 %, накопление биомассы стрептомицетом не превышало контрольного уровня и достигло лишь 89 %, активность стафилолитиче-ских ферментов, лизирующих клетки стафилококка, уменьшилась в два раза. Наблюдалось также снижение продуктивности штамма на 44 % на фоне уменьшения удельной скорости роста клеток стрептомицета на 8 %.
Таким образом, замена источника азотного питания (ІЧИ^Оз) аминокислотой треонином нецелесообразна, так как среда оказалась несбалансированной по азотному питанию. Подобное изменение Дебабов [3] объясняет задержкой роста при переносе клеток из полноценной среды на минимальную, когда одновременно с замедлением скорости роста наблюдается резкое уменьшение синтеза стабильных типов РНК (рРНК и тРНК), при этом не возрастает активность ряда ферментов (триптофан-синтетазы, гомосериндегидрогеназы, треаниндезаминазы) и биосинтеза аминокислот.
3б
При исследовании стимулирующей активности штамма 2Р-15 на клетках Candida tropicalis, получено увеличение оптической плотности (ОД) клеток дрожжей при внесении КЖ в концентрации 1 %. Максимальный прирост биомассы дрожжей в присутствии аргинина составил 282 % (табл. 3).
Уровень стимулирующей активности продуцента в контроле (КЖ без аминокислоты) достиг 2530 ед./мл, в присутствии экзогенного триптофана - 5100, треонина - 5670, глутаминовой кислоты - 4300, аргинина - 9400 ед./мл. В 1,4-4,2 раза по сравнению с контролем увеличилась также удельная стимулирующая активность.
Заключение
Внесение экзогенных аминокислот в среду выращивания штамма Streptomyces recifensis var. lyticus 2Р-15 положительно повлияло на биосинтетическую активность продуцента. При внесении треонина активно увеличился синтез белка (на 56 %), в присутствии глутаминовой кислоты - выход биомассы стрептомицета (на 112 %), при добавлении аргинина - активность стафилолизинов (на 62 %), в присутствии треонина и аргинина - продуктивность штамма (на 50-52 %). Внесение триптофана повысило стимулирующую активность продуцента в два раза, треонина - в 2,2 раза, глутаминовой кислоты - в 1,7 раза, аргинина - в 3,7 раза.
Библиографические ссылки
1. Астапович Н. И. Нуклеотидный фонд и метаболизм микробной клетки. - Минск, 1979. - 150 с.
2. Гершанович В. Н. Транспорт аминокислот, полипептидов и органических кислот у бактерий. - М.: Медицина, 1977. - 184 с.
3. Дебабов В. Г. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов / В. Г. Дебабов, В. А. Лившиц // Биотехнология. - М.: Высшая школа, 1988. - Т. 2. - 208 с.
4. Джавец Э. Руководство по медицинской микробиологии / Э. Джавец, Д. А. Мельник, Э. А. Эйдельберг. - М.: Медицина, 1982. - Т. 1. - 368 с.
5. Елинов Н. П. Химическая микробиология. - М.: Высшая школа, 1989. - 448 с.
6. Жерносекова И. В. Изменчивость продуцента литических ферментов Streptomyces recifensis var. lyticus и его селекция. Дис. ... канд. биол. наук. - К., 2002. - 150 с.
7. Закордонец Л. А. Влияние аланина и цистеина на образование биологически активных веществ Fusarium sp. / Л. А. Закордонец, С. М. Супрун // Микробиол. журн. - 1983. -Т. 45, № 1. - С. 39-43.
8. Иванова Е. Г. Аэробные метилобактерии синтезируют ауксины / Е. Г. Иванова, Н. В. Доронина, Ю. А. Троценко // Микробиология. - 2001. - Т. 70, № 4. - С. 452-458.
9. Кравченко Л. В. Роль корневых экзометаболитов в интеграции макроорганизма с растениями. Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. - М., 2000. - 51 с.
10. Мишке И. В. Микробные фитогормоны в растениеводстве. - Рига: Зинатне, 1988. - 151 с.
11. Синтез фитогормона индол-3-уксусной кислоты ризосферными бактериями рода Pseudomonas / Е. А. Мордухова, Н. П. Скворцова, В. В. Кочетков и др. // Микробиология. -1991. - Т. 60, № 3. - С. 494-500.
12. Синтез индолилуксусной кислоты сапрофитной ассоциативной бактерией Agrobacterium radiobacter / Е. М. Муронец, Н. В. Белавина, Т. Н. Митронова, С. В. Каменева // Микробиология. - 1997. - Т. 66, № 4. - С. 506-513.
13. Новак М. И. Регуляция биосинтеза цефалоспорина С у штаммов Acremonium chrysoge-num // Проблемы изыскания и биотехнологии новых антибиотиков. - Пущино, 1982. - С. 23.
14. Прист Ф. Внеклеточные ферменты микроорганизмов. - М.: Мир, 1987. - 117 с.
15. Промышленная микробиология / Под ред. Н. С. Егорова. - М.: Высшая школа, 1989. - 688 с.
16. Современная микробиология. Прокариоты / Под ред. Й. Ленгелера. - М.: Мир, 2005. -Т. 1. - 656 с.
17. Стимуляция жизнедеятельности микроорганизмов и вирусов / Под ред. М. Х. Шигае-вой. - Алма-Ата, Наука, 1986. - 184 с.
18. Тимаков В. Д. Микробиология. - М.: Медицина, 1983. - 512 с.
19. Цавкелова Е. А. Образование ауксинов бактериями, ассоциированными с корнями орхидей / Е. А. Цавкелова, Т. А. Чердынцева, А. И. Иетрусов // Микробиология. - 2GG5. -
Т. 74, № 1. - С. 55-б2.
2G. Чорногор Н. П. Дослідження рістстимулюючих властивостей лізоензимного препарату Streptomyces recifensis variant lyticus. Автореф. дис. ... канд. біол. наук. - К., 1998. - 2G с.
21. Влияние некоторых аминокислот и других соединений на биосинтез тирозина / Б. Р. Штейман, Е. А. Середенко, А. М. Макухина и др. // Проблемы изыскания и биотехнологии новых антибиотиков. - Пущино, 1982. - С. 3б-37.
22. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the guantitation of microgram guantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding // Anal. Biochem. - 197б. - Vol. 721. -P. 1117-1123.
23. Fallik E. Morphology and physiology of plant roots associated with Azospirillum / E. Fallik, Y. Okon. - London: CRC, 1994. - P. 77-8б.
24. Isono M. Bacteriolytic enzyme and process for the production there of. Pat. 3б49454 USA, C 12 K 1/G6 / M. Isono, T. Takahashi, Y. Yamadzaki. - Pat. 1GG4.72.
25. Luengo J. M. Lisine regulation of penicillin biosinthesis in low producing and industrial strains of Penicillium chrisogenum / J. M. Luengo, G. Revilla // J. Gen. Microbiol. - 1979. -Vol. 115. - P. 2G7-211.
26. Menta R. Lysine stimulation of cephalosporin C. synthesis in C. aeramonium / R. Mehta, J. L. Speth, C. H. Nach // Eur. J. Appl. Microb. and Biotech. - 1979. - Vol. 8. - P. 177-18G.
Надійшла до редколегії 10.11.2006
УДК 597.551.2 : 691.111.1/4 : 574.64
А. А. Жиденко
Черниговский государственный педагогический университет им. Т. Г. Шевченко
ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ДВУХЛЕТОК КАРПА В УСЛОВИЯХ ГЕРБИЦИДНОЙ НАГРУЗКИ
Проаналізовано вплив гербіцидів різного хімічного складу в кількості 2 ГДК (гранично допустимі концентрації) на зміни головних гематологічних показників і формування адаптації у дволіток коропа. Терміновий етап адаптаційних реакцій формується швидше і більше виражений у риб під дією зенкору; поступовий розвиток довготривалої адаптації спостерігається за умов дії раун-дапу. Наслідком впливу похідних 2,4-Д є зниження наступних показників крові: вмісту гемоглобіну, кольорового показника, ВГЕ (вмісту гемоглобіну в еритроциті), ШОЕ (швидкості осідання еритроцитів), що свідчить про уповільнення формування адаптаційних реакцій у дволіток коропа.
Influence of different chemical herbicides in a concentration of 2 MAC (maximum allowable concentration) on changes of the basic haematological parameters and formation of adaptive reactions of two-years-old carp is presented. Mostly rapid and pronounced urgent stage of the adaptive response is formed under the influence of Zencor. The gradual development of the long-term adaptation was launched by Roundup. 2, 4-D reduced the following blood parameters: the haemoglobin level, colour index, erythrocytes’ haemoglobin content, erythrocyte sedimentation rate (ESR). That is the evidence of non-formation of adaptation.
Введение
Ежегодно в производство внедряются десятки новых гербицидов для увеличения урожайности сельхозкультур и борьбы с сорной растительностью. Их применение приводит к загрязнению водоемов, созданию стрессовой ситуации для гидробио-нтов и, в первую очередь, рыб. Возможность выживания и создания потомства зависит от адаптационных реакций, которые возникают в ответ на действие стресс-
© А. А. Жиденко, 2GG7 38
