CC BY
32Биомониторинг водной среды с помощью органа обоняния рыб
Бянкин А. Г. [email protected] )
Хабаровский государственный технический университет
В современную эпоху резкого развития индустриального и сельскохозяйственного производства прогрессирует загрязнение водоемов различными химическими соединениями, ежегодно увеличивается спектр попадающих в водоемы ксенобиотиков (Исидов, 1999). Многие из них приводят к нарушению функции сенсорных систем и высшей нервной деятельности, на основе которых формируется важнейшие поведенческие реакции рыб. Последнее время уделяется много внимания изучению действия детергентов бытовых стоков и тяжелых металлов на морфологию хемочувствительных органов рыб (Пащенко, Касумян, 1984; Пяткина, Дмитриева, 1990; Рябова и др. 1991; Касумян и др. 1991; Julliard at el., 1995, 1996; Olvera Ribeiro at el., 1995; Касумян, 2001).
Обонятельный эпителий рыб имеет прямую связь с внешней средой, а ее загрязнения отражаются на изменении морфологии эпителия. Установлено, что многие из загрязняющих веществ приводят к быстрой деструкции периферических хемосенсорных образований, особенно после воздействия тяжелых металлов, и как следствие, к нарушению биоценотических и иных поведенческих реакций рыб (Hara et al., 1983; Baartrup et al., 1990; Saucier et al., 1991a, 1991b; Klaprat et al., 1992; Касумян, Морси, 1998). Многочисленные исследования действия токсикантов на хеморецепторы рыб в нашей стране касаются в основном ихтиофауны западной части России (Рябова и др., 1991; Касумян и др., 1991), а за рубежом аквариумных рыб (Woo, 1993; Michel, Lubomudov, 1995; Циппель и др., 1995), и лишь единичные работы посвящены рыбам Дальнего Востока (Бирюкова и др., 1998; Дорошенко, 2002).
Особенности поведения рыб, обитающих в загрязняемых водоемах, состояние сенсорных систем, их способность воспринимать и реагировать на различные воздействия недостаточно исследованы, несмотря на очевидную научную и практическую важность получаемых при этом результатов. Такие исследования позволяют более глубоко и детально понять биологические процессы в водных экосистемах, подвергаемых загрязнению, служат основой для составления более точных прогнозных оценок последствий загрязнения водоемов. На основании результатов исследований могут быть сформулированы или разработаны новые подходы, критерии и методы диагностики негативного влияния токсикантов и проведения мониторинга природных водоемов (Касумян, 2001).
Целью настоящей работы состоит в обосновании использования органа обоняния рыб в биомониторинге водной среды, на примере экспериментальных исследований воздействия солей тяжелых металлов (медь, цинк, кадмий) и бытовых детергентов (Ariel и Кристалл-2) на орган обоняния половозрелых особей и сеголеток красноперки крупночешуйчатой Tribolodon hakonensis.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Эксперименты проводились на половозрелых особях красноперки крупночешуйной Tribolodon hakonensis (3-4 года) длиной 20-40 см и массой 180-420 г и на сеголетках длиной 3-6 см и массой 0,3-1 г. Рыб отлавливали в лимане реки Тумнин (бассейн Японского моря, северное Приморье). Больных и раненных во время лова рыб выбраковывали. Пойманную красноперку держали в садке у берега для контроля и пополнения опытных экземпляров. Перед экспериментом рыб помещали в ванны на сутки с водой из лимана реки Тумнин емкостью 60 - 100 л для адаптации к новым условиям.
Для оценки воздействия тяжелых металлов подопытных рыб выдерживали в растворах солей тяжелых металлов - сульфата меди (Реахим
х.ч.), сульфата кадмия (Реахим х.ч.), сульфата цинка (Реахим х.ч.). Предварительно готовили маточные растворы солей и хранили их при 4-5Со не более 10 суток. Для оценки воздействия бытовых детергентов использовали растворы стиральных порошков Ariel (ГОСТ 25644-88) и Кристаллл-2 (ТУ 6-39-42-91). Для приготовления маточных растворов детергенты растворяли в теплой воде (40-60 Со) в небольшой емкости (1 л) непосредственно перед опытом. Маточные растворы вносили в ванны в центральной части при постоянном, слабом помешивании, как показали предварительные эксперименты с красителями, это дает быстрое и равномерное распределение вносимого раствора по всей ванне. Аэрация воды производилась механическим способом, путем перемешивания 0,5 л воды и воздуха в закрытой емкости и последующего смешивания в ванне. Температура воды была около 18Со и соответствовала температуре воды в реке в период исследований.
Токсикологические эксперименты проводились по стандартной схеме проведения таких работ (Лукьяненко, 1983). Выбранные концентрации тяжелых металлов соответствуют ранее проведенным острым экспериментам для карповых рыб (Метелев и др., 1971; Pickering, Henderson 1966; Pickering, Gast, 1972; Кадмий: экологические аспекты 1994).
В экспериментах использовали концентрации солей металлов 40, 20, 10 мг/л, а для меди дополнительно 1 мг/л. Для детергентов употребляли растворы с концентрацией 40 и 100 мг/л. В экспериментах с сеголетками использовали концентрации: 10 мг/л для тяжелых металлов и 40 мг/л для детергентов. На каждую точку токсиканта брали по 12 - 15 особей, на гистологические исследования 3-5 экз. Всего исследовано 378 особей красноперки, из них гистологическому обследованию подверглось 92.
Для получения гистологических препаратов обонятельные розетки фиксировали в 10% нейтральном формалине и затем заливали в парафин, делали срезы толщиной 5-7 мкм, окрашивали гематоксилином, эозином или толуидиновым синим по стандартной методике (Меркулов, 1969). Плотность
клеток измерялась с помощью окуляр микрометра на 50 мкм препарата. Профильное поле клеток измерялось как произведение длины клетки на диаметр в ядросодержащей части. Готовые препараты изучали и фотографировали в световом микроскопе "Olympus" model BHT с использованием Olympus Potomicrographic System Model PM-10AD.
Статистическая обработка полученных в результате исследований данных, проведена на компьютере с помощью программы Microsoft Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Одним из массовых видов рыб Приморья является крупночешуйная красноперка. Особенность биологии дальневосточных красноперок- это способность жить в пресной морской воде (Вдовин, Гавренков, 1995; Гавренков, 1998), поэтому это перспективные объекты для мониторинга водной среды с различной соленостью. Красноперок легко добывать круглый год в реках и в предустьевых местах. Годовой жизненный цикл красноперок состоит из пресноводного - нерест (апрель - июнь) и зимовка (ноябрь - март), а также из морского - нагул в прибрежных морских водах. Сеголетки и годовики постоянно встречаются в реках и прибрежье. Эти рыбы легко содержатся в лабораторных аквариумах от месяца до года, это связано с непритязательностью к качеству воды, с эвритермностью (3-25Со) и эврифагией этого вида. Рыбы хорошо переносят транспортировку в небольших емкостях и даже без воды до 1-1,5 часов. Крупношечешуйная красноперка становится половозрелой в 2-3 года, живет около 7-8 лет и достигает длины 50 см и массы 1,5 кг. Обитает во всех реках Приморья от Кореи до Амура (Новиков и др. 2002). В последнее время успешно разрабатывается технология по искусственному воспроизводству красноперок (Гавренков, 1996).
Строение органа обоняния красноперки крупночешуйной аналогично другим костистым рыбам, описанным ранее (Бронштейн, 1977). Обонятельные капсулы красноперки находятся на дорсальной стороне
головы, наружу открывающимися двумя отверстиями - входным и выходным. Выходное отверстие больше в сечении, чем входное, это обеспечивает постоянный ток воды через обонятельную капсулу. На дне обонятельной капсулы находится обонятельная розетка, состоящая из соединительнотканных складок, отходящих билатерально от центральной септы. Они покрыты сенсорным (рецепторным) эпителием на боковых поверхностях и индифферентным на вершинах складок. Число складок у красноперки в процессе онтогенеза увеличивается: у сеголеток 10, годовиков 12-16, а у половозрелых особей 20-25. Также увеличивается и размеры складок, их длина у сеголеток составляет 329,09 мкм; у годовиков -519,6 мкм; у половозрелых особей-1054,3 мкм, соответственно возрастает и ширина складок- 100,01; 142,5; 185,04 мкм.
Сенсорный эпителий на поверхности складок у красноперки располагается волнообразно, что увеличивает его площадь. Данные изгибы эпителия нельзя отнести к истинно вторичным складкам, описанных у лососевых (Дорошенко, 1984), так как их вершины не покрыты индифферентным эпителием. Рост сенсорного эпителия в онтогенезе происходит равномерно, у сеголеток его средняя толщина составляет 34,4 мкм, у годовиков 45,82 мкм, у половозрелых особей красноперки (3-4 года) 54,36 мкм. Сенсорный эпителий состоит из опорных, рецепторных, базальных, секреторных 1 и 2 типов клеток, в индифферентном эпителии отсутствуют рецепторные клетки и преобладают бокаловидные секреторные клетки 1 типа. В сенсорном эпителии красноперки наблюдается большое число секреторных клеток 2 типа. Плотность различных клеток в эпителии у красноперки в процессе онтогенеза изменяется (табл. 1). Происходит увеличение числа рецепторных клеток в сенсорном эпителии, а также профильного поля рецепторных и секреторных клеток.
В целом нормальная структура сенсорного эпителия красноперки представляет стройный ряд клеток, он плотно прилегает к подстилающему соединительнотканному слою. Между клетками отсутствуют полости и
межклеточное вещество, которое есть в подстилающей соединительной ткани. На поверхности эпителия четко виды жгутики клеток, это цилиарный аппарат состоящий из булавы из которой и выходят жгутики (Бронштейн, 1977; Пащенко, Касумян, 1984). Норма строения органа обоняния красноперки в дальнейшем послужит для сравнения с патологическими изменениями, происходящими под влиянием ксенобиотиков.
Поведенческие ответы на действие токсикантов
Действие тяжелых металлов на красноперку, в острых экспериментах, происходит не однозначно и зависит от токсичности ионов металла, однако, есть и общие признаки. В первые минуты рыба ведет себя спокойно без резких движений, по истечения 0,5-1 часа наблюдается кашель, подергивание жабрами, ослизнение покровов. Далее дыхательные движения резко увеличиваются до 80-100 в минуту, когда в контроле не превышают 40-50. Через 5-7 часов наблюдается нарушение равновесия, рыбы плавают боком, круговыми, толчкообразными движениями. Фаза возбуждения переходит в фазу угнетения: замедления дыхательного ритма (1-2 в мин.), нарушения равновесия и координации движения, понижения ответных реакций на раздражение. На всем протяжении воздействия наблюдается обильное секреторное выделение кожных покровов, жабр и обонятельного эпителия, потемнение покровов тела, осветление плавников, особенно их дистальной части. Жабры в процессе воздействия солей тяжелых металлов начинают менять свою окраску с алых на бледно розовую. На дистальных частях жаберных лепестков происходит некроз респираторного эпителия. Рыба умирает от удушья с широко открытым ртом, раздвинутыми жабрами, переворачивается вверх вентральной стороной тела или ложится на бок, с не большим изгибом тела, мертвая рыба не всплывает.
Поведение рыб при действии детергентов отличается коротким периодом беспокойства и длительной агонией. Выделение слизи из кожи и
жабр значительно больше, чем при воздействии солей тяжелых металлов. Красноперка при отравлении захватывает воздух ртом. В период потери равновесия вращается вокруг продольной оси, плавает вверх брюхом, погибает с широко открытым ртом и раздвинутыми жаберными крышками.
Длительность описанных периодов характерна для 15-20 часов воздействия токсикантов из исследованных это 20 мг/л Cd и Zn, 1 мг/л Cu, 40 мг/л Кристалла-2 и Ariel (табл. 2). Короткое воздействие токсикантов, при больших концентрациях, также включает все описанные периоды, но их продолжительность соответственно сокращается.
Из исследованных веществ соли меди оказывают более токсическое влияние на рыб, смерть красноперки наступает быстрее в растворе меди, чем в растворах других солей (табл. 2). Менее, токсическое действие оказывают соли кадмия и цинка. Продолжительность жизни в растворах детергентов больше, чем в растворах тяжелых металлов. Стиральный порошок Кристалл-2 токсичнее, чем Ariel. Следует отметить, что сеголетки красноперки выдерживают более длительное время в растворах токсикантов (табл. 1).
Действие токсикантов на обонятельный эпителий
Гистофизиологическое исследование препаратов органа обоняния красноперки показало, что действие солей исследованных металлов и детергентов на сенсорный эпителий красноперки имеет ряд сходных признаков, но при разных концентрациях степень воздействия отличается.
Сульфат меди. Действие меди очень токсично и сохранение структуры сенсорного эпителия, его слоистости, наблюдалось при концентрациях 1 и 10 мг/л. Толщина сенсорного эпителия и соединительнотканной прослойки уменьшается по сравнению с контролем (табл. 3). При концентрации 1 мг/л происходит обильное выделение слизи, которая заполняет всю обонятельную капсулу, цилиарный аппарат клеток в хорошем состоянии, булавы и жгутики сохраняют свою структуру. Но
рецепторные клетки становятся более тонкими и приобретают нитевидную форму. При концентрации 10 мг/л в эпителии появляются разрывы, целых рецепторных клеток становится меньше, а их размеры уменьшаются (табл.4), слоистость эпителия сохраняется. Жгутики и ворсинки на поверхности слипаются или полностью исчезают.
При более высоких концентрациях 20 и 40 мг/л сенсорный эпителий полностью теряет свою структуру, его толщина значительно увеличивается (табл. 2) Происходит разрушение клеток (табл.4), появляются многочисленные разрывы эпителия и его отек, а также выход форменных элементов крови из капилляров.
Крайние деструктивные изменения происходят при концентрации 40 мг/л. Весь эпителий становится рыхлой массой однородных, неправильной формы клеток со светлой цитоплазмой, темным ядром и разрушенной цитоплазматической мембраной. Ткань отделяется в виде лоскутов в полость обонятельного мешка. Наблюдается выход эритроцитов и фагоцитирующих элементов крови. Отмечается ярко выраженный отек соединительной ткани (табл. 3), в виде увеличения межклеточного пространства, появления множественных обрывков волокон и увеличения размеров клеток.
Сульфат кадмия. Соли кадмия оказывают менее пагубное воздействие на сенсорный эпителий красноперки, чем соли меди. При воздействии концентраций 10 и 20 мг/л эпителий сохраняет свою структуру; его толщина, плотность клеток и их профильное поле уменьшаются по сравнению с контролем (табл. 3, 4). При концентрации 10 мг/л наблюдается обильное выделение слизи на поверхности эпителия, сохраняются жгутики и ворсинки. Обонятельная слизь находится не на поверхности эпителия, а располагается над ним на значительном расстоянии, и не обволакивает цилиарный аппарат рецепторных и мерцательных клеток. При концентрации 20 мг/л происходит слипание жгутиков или их потеря на отдельных участках, в сенсорном эпителий появляются разрывы.
Наибольшие дегенеративные процессы происходят при концентрации 40 мг/л. Толщина эпителия значительно увеличивается (табл. 3), происходит полная его деструкция. Наблюдается разрушение цитоплазматической мембраны всех клеток, остаются целыми ядра клеток, беспорядочно расположенных в толще эпителия. Эпителий на некоторых участках полностью отторгается от соединительнотканной основы. В соединительной ткани обонятельных пластин наблюдается отек, разбухание коллагеновых волокон, увеличение межклеточного пространства. Капилляры внутри первичных складок разрываются, происходит выход кровяных элементов наружу.
Сульфат цинка. Все исследованные концентрации сульфата цинка 10, 20 и 40 мг/л не приводят к полной деструкции сенсорного эпителия, как при воздействии ^ и Cd. Только при концентрации 20 мг/л начинается обильное выделение слизи и потеря жгутиков и ворсинок, клетки не разрушаются. При концентрации 40 мг/л отмечаются полная потеря цилиарного аппарата, разрывы сенсорного эпителия, частичное разрушение рецепторных клеткок (табл. 3). Отмечается увеличение толщины сенсорного эпителия и соединительнотканной прослойки по сравнению с контролем (табл. 2).
При действии всех концентраций цинка и малых концентраций меди (1, 10 мг/л) и кадмия (10 мг/л) выявлена реакция вытягивания рецепторных клеток, они приобретают нитевидную форму, ядерная часть у таких клеток почти не выражена, слой цитоплазмы очень тонкий с повышенным сродством к основным красителям. Реакция рецепторных клеток связана с их сократительной способностью.
Детергенты. Действие бытовых детергентов на сенсорный эпителий отличается от солей тяжелых металлов большим выделением слизи на поверхность эпителия. Однако, процесс воздействия происходит в направлении постепенной деструкции эпителия.
Кристалл-2. Уже на первых стадиях воздействия наблюдается полная потеря жгутиков. При действии Кристалла-2 сенсорный эпителий отекает, его толщина увеличивается по сравнению с контролем (табл. 3). Рецепторные клетки разрушаются, это происходит при всех исследованных концентрациях. Структура сенсорного эпителия превращаются в рыхлую не оформленную массу разрушенных клеток с выраженными темными ядрами, такая картина аналогична для высоких концентраций тяжелых металлов. В эпителии наблюдаются продольные и поперечные разрывы, отслоение от соединительнотканной основы. Строение эпителия после воздействия 100мг/л Кристалла-2, можно охарактеризовать как некробиоз.
Ariel. При воздействии 40 мг/л Ariel сохраняется слоистость сенсорного эпителия. Однако плотность целых рецепторных клеток снижается до 2 на 50 мкм и опорных до 6,8 по сравнению с контролем 4,78 и 7,48 соответственно.
При воздействии 100 мг/л Ariel рецепторные клетки полностью разрушаются. Сенсорный эпителий после воздействия приобретает губчатую структуру, цитоплазматическая мембрана клеток разрушается и на препарате видны темные ядра клеток. Эпителий отслаивается, обрывки эпителия отстают в виде лоскутов ткани.
Аналогичная картина обнаруживается у сеголеток при действии всех исследованных концентраций, а сенсорный эпителий у них сильней подвержен отеку, чем у половозрелых рыб. При воздействии высоких концентраций на последних стадиях воздействия наблюдается некробиоз сенсорного эпителия.
Столь сильное поражение сенсорного эпителия бытовыми детергентами, по-видимому, лишает рыбу полностью обонятельной рецепции, что согласуется с ранее полученными данными (Пащенко, Касумян, 1984).
ОБСУЖДЕНИЕ
Проведенные эксперименты не выявили специфики в поведенческих реакциях красноперки на воздействие солей меди, кадмия, цинка. Отмеченные ранее (Метелев и др., 1971; Лукьяненко, 1983; Baatrup et el., 1990; Doving, 1991) поведенческие реакции подтверждают проведенные исследования. Процесс воздействия тяжелых металлов и бытовых детергентов на поведение красноперки проходит одинаково в последовательности ряда стадий - раздражения, беспокойства, понижения чувствительности, нарушения равновесия и атаксии, смерти от асфиксии. Время наступления и продолжительность стадий зависит от концентрации и природы воздействующего вещества. Токсичность изученных веществ на организм красноперки крупночешуйной распределилась следующим образом: сульфат меди, менее токсичны сульфат кадмия и цинка. Выявленные в данной работе показатели летальности солей тяжелых металлов подтверждают и ранее проведенные исследования на других рыбах (Лукьяненко, 1983; Касумян, Морси, 1998; Winberg et al., 1992). Токсичность меди на организм красноперки в несколько раз превышает другие исследованные вещества. Так, смерть, при концентрации Cu 1 мг/л, наступает, в среднем, через 15 часов, тогда как с Cd и Zn при концентрации 20 мг/л через 18 и 21 часов соответственно (табл. 2). При более высоких концентрациях меди время до наступления смерти сокращается в несколько раз. Детергенты Кристалл-2 и Ariel менее токсичны, чем соли тяжелых металлов. При концентрации 40 мг/л Кристалла-2 смерть наступает через 10 часов, а в Ariel через 18 часов (табл. 2). Можно с уверенностью говорить, что ЛД50 для крупночушуйчатой красноперки для сульфата меди составляет 1 мг/л, а сульфатов цинка и кадмия 10 мг/л. Бытовые детергенты менее токсичны (ЛД50 40 мг/л), чем тяжелые металлы, а из них более пагубно влияет Кристалл-2 чем Ariel.
В проведенных экспериментах достоверно установлено (р>0,95), что после взаимодействия Ariel с водой более 5 часов его токсичность резко
уменьшается. В свежем растворе Ariel половозрелые особи в среднем живут 18 часов, а в растворе подверженному гидролизу более суток (32ч). Столь быстрая детоксикация для Кристалла-2 не отмечена, и он сохраняет свое негативное воздействие более длительное время.
Сеголетки красноперки толерантны по отношению ко всем исследованным токсикантам, по сравнению с половозрелыми особями. В растворах сульфатов цинка и кадмия сеголетки в среднем выдерживают более суток (табл. 2). Токсикорезесцентность молоди рыб хорошо известна (Метелев и др. 1971; Лукьяненко 1983), но причина этого пока не ясна.
Наиболее сильным воздействием на процессы деструкции сенсорного эпителия оказывают соли меди, она вызывает быстропротекающие, тяжелые изменения в эпителии и нарушение хеморецепции. Действие кадмия на порядок ниже, и еще слабее у цинка. Аналогично действие тяжелых металлов на хеморецепторы рыб по силе воздействия показано рядом других исследователей (Vijayamadhavan, Iwai, 1975; Brown, at el., 1982; Лукьяненко 1983; Рябова и др., 1991; Winberg at el. 1992; Woo at el. 1993; Julliard и др., 1995, 1996 Касумян, Морси, 1998). Исследования действия бытовых детергентов- Кристалл-2 и Ariel, которые проведены в данной работе, на рыбах ранее не проводились. Следует отметить, что деструктивные воздействия детергента Кристалл-2 аналогичны тяжелым металлам, но процесс разрушения более длителен. Менее пагубное разрушения из всех исследованных веществ оказывает Ariel. Его действие имеет более длительный период деструкции эпителия и сохраняет структурные особенности эпителия. Ослабление токсичности Ariel после взаимодействия с водой делает это средство бытовой химии более конкурентно способным по параметрам биологической безопасности для водных организмов в сравнении с Кристаллом-2, который такими свойствами не обладает.
Процесс воздействия солей тяжелых металлов и детергентов на обонятельный эпителий красноперки крупночешуйной направлен на его
постепенную деструкцию и зависит от концентрации токсиканта. Эти изменения в эпителии можно разделить на ряд последовательных этапов.
На первом этапе происходит проникновение токсиканта в обонятельную капсулу рыбы и соприкосновение его с поверхностью эпителия, наблюдается обжигающий эффект, ответ на который - обильное выделение слизи на поверхности обонятельного эпителия, который можно назвать - токсический насморк. Обильное выделение слизи при действии солей тяжелых металлов отмечали и другие авторы, изучавшие дегенеративные процессы в обонятельном эпителии (Винников, 1956; Бирюкава и др., 1998). Ранее отмечено, что слизистые шельфы не обволакивают цилиарный аппарат рецепторных и мерцательных клеток, а располагаются над ними на значительном расстоянии, объединяясь в своеобразный полог, покрывающий обонятельные складки. Возвышаясь над поверхностью последних, слизь заполняет всю обонятельную полость (Пащенко, Касумян, 1984). Жгутики рецепторных клеток, ворсинки и микровиллы опорных клеток остаются целыми, иногда слипаются в пучки. Обонятельная слизь первой воспринимает изменения окружающей водной среды, ультраструктура и химический состав ее влияют на характер первичных процессов обонятельной рецепции, протекающих в погруженных в нее жгутиках рецепторных клеток (Винников и др., 1979).
На следующем этапе воздействия происходит исчезновение жгутиков и ворсинок с поверхности эпителия, в сенсорном эпителии появляются продольные и поперечные разрывы, число рецепторных клеток сокращается. Исчезновение на поверхности эпителия цилиарного аппарата клеток, а потом и булав отмечено ранее при действии детергента ТХ-100 (Пащенко, Касумян 1984). Рецепторные клетки на фоне сокращения их плотности, изменяют свою структуру, они вытягиваются в длину, приобретая нитевидную форму, очень тонкий слой цитоплазмы окружает палочкообразное темное ядро.
В дальнейшем рецепторные клетки исчезают из эпителия, количество разрывов резко увеличивается, эпителий отслаивается от соединительной
ткани. В ткани можно различить сохранившиеся опорные и базальные клетки, сильно подвергшиеся деструкции. Продольные пустоты в эпителии связаны с элиминацией рецепторных клеток.
Конечный этап токсической деструкции сенсорного эпителия выражается в полном разрушении клеток эпителия, последний превращается в рыхлую массу бесформенных клеток с разрывами цитоплазматической мембраны и темными округлыми ядрами, происходит активный некробиоз. Обрывки эпителиальной ткани выбрасываются в среду в виде частей клеток и ядер. Выброс содержимого эпителия в полость обонятельного мешка описан и другими авторами (Винников, 1956; Breucker et al 1979; Пащенко, Камсумян, 1984) Отмечается увеличение толщины сенсорного эпителия и соединительнотканной прослойки, в которой наблюдается отек.
Ранее были описаны фазы воздействия 0,5% раствора детергента ТХ-100 на обонятельную выстилку мальков белого амура Ctenopharyngodon idella (Пащенко, Касумян 1984): «I фаза — разрушение цилиарного аппарата мерцательных и рецепторных жгутиковых клеток и микровиллей рецепторных микровиллярных клеток; II фаза—элиминация булав рецепторных клеток, изменение поверхностной структуры опорных клеток; III фаза — регенерация клеточных элементов обонятельной выстилки». Данные фазы соответствуют начальным этапам деструктивных изменений обонятельного эпителия описанным в этой работе, за исключением последней.
На основании поэтапного воздействия тяжелых металлов и бытовых детергентов на обонятельный эпителий автор предлагает шкалу, по которой можно определить степень дегенеративных процессов обонятельной выстилки при влиянии различных токсикантов (табл. 5). Шкала позволяет судить о степени поражения сенсорного эпителия, и проводить наблюдения за состоянием загрязнения водной среды. Следует отметить, что рыбу на гистологию брали в стадии переворачивания или предсмертных судорог, то есть в момент уже необратимых процессов. Фиксация обонятельного
эпителия в определенном физиологическом состоянии рыб и дальнейшая его оценка делает эту шкалу применимой для разнообразных природных условий. При использовании в качестве объекта биотестирования красноперки данный метод можно применять в искусственных условиях и естественных водоемах с различной соленостью.
Ранее автором обнаружены изменения строении обонятельного эпителия малоротой корюшки (Бянкин, Дорошенко, 1997), выловленной в б. Золотой Рог (западное побережье Японского моря) подверженной сильному антропогенному загрязнению (бытовые и промышленные стоки). Обнаружено наличие деструктивных изменений, которое проявляется в поперечных разрывах обонятельного эпителия. Клетки эпителия значительно уменьшаются в своем диаметре, их профильное поле уменьшается в 1,2 раза. Часть рецепторных клеток элиминирует из сенсорного эпителия их плотность снижается с 8,51 в норме до 3,41 на 50 мкм, что четко прослеживается на препаратах в виде разрывов. Секреторные элементы в сенсорном эпителии отсутствуют, хотя имеются в норме. Однако присутствует гипертрофия этих клеток в индифферентном эпителии малоротой корюшки, профильное поле клеток 1 типа увеличивается до 205,43 по сравнению с нормой 170,2. Этот факт говорит о повышенной секреции обонятельной слизи. Общая гистоморфологические картина обонятельного эпителия малоротой корюшки, свидетельствует о значительных дегенеративных процессах эпителия и соответствует III баллам преложенной шкалы оценки (табл.5).
Описанные ранее (Бянкин, 2001) опухолевые образования в органе обоняния лобана выловленного в бухте подверженной радиоактивному загрязнению. В бухте Западной (зал. Советская Гавань, западное побережья Японское море) находятся атомные подводные лодки и этот факт не исключает загрязнения грунта бухты радиоктивными веществами. Лобан питается в основном перифитоном и детритом. В кишечнике лобана обнаружено много грунта. Перерабатывая грунт, лобан может получить
сверхмалые дозы радиоактивных веществ, которые накапливаются в грунте возле атомных энергетических установок (Яблоков, 2001). У двух особей, из 15 исследованных, отмечены опухолевые образования разной формы и размера, имеющие свойства фибром.
Морфофункциональные деструктивные изменения в органе обоняния рыб описаны ранее при действии детергентов (Пащенко, Касумян, 1984; Пяткина, Дмитриева, 1990), солей тяжелых металлов (Hara at el., 1983; Baatrup at el., 1990; Касумян и др., 1991; Рябова и др., 1991; Klaprat at el.,1992; Olvera Ribeiro at el., 1995; Saucier at el., 1991 a, 1991b; Winberg at el., 1992; Бирюкова и др., 1998) аналогичны приведенным в данной работе. Однако оценка этих воздействий для биомониторинга водной среды практически не разработана, поэтому данная работа, возможно, послужит скромным началом в разработке таких гистопатологических методик.
Действие массовых антропогенных загрязнителей на органы рыб: солей тяжелых металлов, детергентов, радионуклидов проявляются в разной разрушительной степени. Орган обоняния рыб является анализатором химического состава водной среды, и воздействие на него чужеродных для экосистемы веществ выражается в структурных изменениях обонятельного эпителия, деструкциях различной степени тяжести, вплоть до полной потери функционального строения эпителия. Разработанная шкала оценки степени поражения обонятельного эпителия рыб, под действием тяжелых металлов и бытовых детергентов, может применятся в биомониторинге водной среды.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Бронштейн А.А. Обонятельные рецепторы позвоночных. - Л. 1977. Наука, 160 с.
Бирюкова И.В., Матросов В.В., Евдокимов В.В. Дегенеративные и восстановительные процессы в обонятельной выстилке мальклв кеты Oncorhynchus keta Walbaum при остром воздействии солей меди и цинка// Цитология.- 1998. Т.40, вып. 1, С. 5-9.
Бянкин А.Г., Дорошенко М.А. Особенности строения органа обоняния азиатской и малоротой корюшек в связи с их экологией// Биомониторинг и
рациональное использование гидробионтов/Тез. докл. конф. молодых ученых.- Владивосток. ТИНРО-центр, 27-29 мая 1997. С. 9-10.
Бянкин А.Г. Опухолеподобные образований в органе обоняния лобана Mugil cephalus из залива Советская Гавань Японского моря //Биология моря, 2001, том 27, № 5, с. 375-376.
Вдовин А.Н., Гавренков Ю.И. Оценка и состояние запасов дальневосточных красноперок залива Петра Великого // Вопр. Ихтиологии.-1995. Т.35 Вып. 5. С. 714-717.
Винников Я. А. Дегенеративные и восстановительные процессы в органе обоняния рыб и земноводных // Бюл. эксперем. биол. и мед.- 1956. Т. 42, № 10, 57-59
Винников Я.А., Пяткина Г.А., Шахматова Е.И., Наточин Ю.В. Структура и ионный состав обонятельной и распираторной слизи осетровых рыб и окислительная гипотеза обоняния // Докл. АН СССР. - 1979. Т.245. №3. С. 750-752.
Гавренков Ю.И. Биология, морфология и состояние запасов Дальневосточных красноперок рода ТпЬо^оп Южного Приморья // Изв. ТИНРО. - 1998. Т. 123. - С.74-81
Гавренков Ю.И. К биотехнике культивирования дальневосточных красноперок рода ТпЬо^оп в Южном Приморье//Вопр. Ихтиологии. 1996. Т.36 Вып. 3. С.423-426.
Дорошенко М.А. Гистофизиологическая характеристика
обонятельного и зрительного анализатора Дальневосточных лососей // Сенсорная физиология рыб. - Мурманск, Апатиты.- 1984. С. 51-53.
Дорошенко М.А. Гистофизиология органа обоняния рыб.-Владивосток. 2002. изд. Дальрыбвтуза. 140 с.
Кадмий: экологические аспекты (Гигиенические критерии состояния окружающей среды; 135). ВОЗ, Женева, 1994. С. 161.
Касумян А. О. Воздействие химических загрязнителей на пищевое поведение и чувствительность рыб к пищевым стимулам// Вопр. ихтиологии. - 2001. Т. 41 №1 С. 82-95.
Касумян А.О. Девицина Г.В., Червова Л.С., Малюкина Г.А. Хеморецепция и токсикология рыб // Экспериментальная водная токсикология.- 1991. Вып. 16. Рига: Зинатне. С. 37-41.
Касумян А.О., Морси А.М.. Влияние тяжелых металлов на пищевую активность и вкусовые поведенческие ответы карпа Cyprinus Caprio: 1. Медь, кадмий, цинк и свинец // Вопр. ихтиологии.- 1998. Т.38 Вып. 3. С. 393409.
Исидов В.А. Введение в химическую экотоксикологию.- СПб.- 1999. Химиздат.- 144 с.
Лукьяненко В.И. Общая ихтиотоксикология.- М.: Легк. и пищ. пром-ть. 1983, 320с.
Меркулов Г.А. Курс патологической техники. 5-е изд. - Л.- 1969. Медицина, 423с.
Метелев В.В., Канаев А. И., Дзасохова Н. Г. Водная токсикология. М.-1971. Колос, 247 с. ил.
Новиков Н.П., Соколовский А.С., Соколовская Т.Г., Яковлев Ю.М. Рыбы приморья: Монография. Владивосток: Дальрыбвтуз, 2002, 552с.
Рябова Л.В., Хернади Л., Шаланкин Я.. Влияние повышенной концентрации меди на хеморецепторы рыб // Биоиндикация и биомониоринг: Сб. матер. межд. шк. сем. Курск - М.- 1991. С. 198-204.
Пащенко Н.И., Касумян А.О. Дегенеративные и востановительные процессы в обонятельной выстилке белого амура Ctenopharyngodon idella (Val.) (Cyprinidae) после действия на нее детергента тритон-Х-100//Вопр. Ихтиологии. - 1984. Т.24. Вып. 1. С. 128-137.
Пяткина Г. А., Дмитриева Т.М. Цитохимическое выявление аденилатигуанилатциклазы в обонятельной выстилки хариуса Thymallus acrticus baikalensis: влияние промышленных стоков// Журн. эволюции биохимии и физиологии.- 1990. Т. 26. №2. С. 242-245.
Циппель Г.П., Фидлер В., Хагер Д., Кюхлен-Еуус Ж., Маер К., Рековски К., Шуман Р., Тидеман В., Войтт З., Вахтер Т. Ответы митральных клеток обонятельных луковиц золотой рыбки при воздействии на обонятельный эпителий различными химическими, механическими и тепловыми стимулами// Биофизика.- 1995. Т. 40, №1. С. 163-184.
Яблоков А.В. Об «экологической частоте» атомной энергетики// Глобальные проблемы биосферы/Серия «Чтения памяти академика А.Л. Яншина»; Вып. 1.- М.: Наука, 2001 .- 198с.
Baatrup E., Doving K.B., Winberg S. Differential effects of mercurial compounds on the electroolfactogram (EOG) of salmon (Salmo salar L.) // Ecotoxicol. Environ. Safety.- 1990. V. 20. P. 269-276.
Breucker H., Zeiske E., Melinkat R. Development of the olfactory organ in Rainbow fish Nematocentris macculochi (Atherniformes, Melanotaeniidae) Cell Tiss. Res., 1979. v. 200, 53-68.
Brown S.B., Evans R.E., Thompson B.E., Hara TJ. Chemoreception and aquatic pollutants // Chemoreception in fishes/T.J. Hara ed. Elsevier. Amsterdam.-1982. P. 363-393.
Doving K.B. Assessment of animal behaviour as a method to indicate environmental toxicity // Comp. Bio-chem. and Physiol.- 1991. V. 100. №1-2. P. 247-252.
Hara T.J., Brown S.B., Evans R.E. Pollutants and chemoreception in aquatic organisms // Aquatic Toxicology //Ed. J.O. Nriagu. New York: Wiley.- 1983. P. 247-306.
Klaprat DA.. Evans R.E., Hara TJ. Environmental contaminants and chemoreception in fishes // Fish chemoreceptio / Ed. TJ. Hara. London: Chapman and Hall.- 1992. P. 321-341.
Michel W.C., Lubomudov L.M. 1995. Specificity and sensitivity of the olfactory organ of the zebrafish, Danio rerio // J. Comp. Phusiol. A.- 177, №2.-
р. 191-199. Специфичность и чувствительность обонятельного органа Danio rerio.
Olvera Ribeiro C.A., Fernandes L.M., Carvalho C.S., Cardoso R.I., Turcatii N.M.. Acute effects of mercuric chloride on the olfactory epithelium of Trichomycterus brasilinsis // Ecotoxicol. And Environ. Safety.- 1995. V. 31. №2. - C. 104-109
Julliard A.K., Saucier D., Astic L. Metal X-ray microanalysis in the olfactory system of rainbow trout exposed to low level of copper // Biol. Cell.-
1995. V. 83, №1.- p. 77-86.
Julliard A.K., Saucier D., Astic L. Time-course of apoptosis in olfactory epithelium of rainbow trout exposed to a low copper level // Tissue and Cell.-
1996. V. 28, №3.- P. 367-373.
Pickering Q. H., Henderson C. The acute toxicity of some heavy metals to different species of warm waterfishes // J. Air water Pollut., 1966. V.10 P. 453463.
Pickering Q. H., Gast M.H. Acute and chronic toxicity of cadmium to the fathead minnow Pimephales promelas // J. Fish Res. Board. Can., 1972. V. 29. P. 1099-1106.
Saucier D., Astic L., Rioux P.. The effects of early chronic exposure lo sublethal copper on the olfactoly discrimination of rainbow troul, Oncorhynchus mykiss // Environ. Biol. Fish.- 1991 a V. 30. P. 345-351.
Saucier D., Asric L., Rioux P., Godtinot F.. Histological changes in the olfactory organ of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) induced by early chronic exposure to a sublethal copper concentration // Can. J. Zool.- 1991b V. 69. № 8. P. 2239-2245.
Vijayamadhafan K.T., Iwai T. Histochemical observations on the permeation of heavy metals into taste buds of goldfish // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish.-1975. V. 41. P. 631-640.
Winberg S., Bjerselius R., Baatrup E., Doving K.B. The effect of Cu (II) on the electroolfactogram (EOG) of the atlantic salmon (Salmo salar L.) in artificial freshwater of varying inorganic carbon concentrations // Ecotoxicol. Environ. safety.- 1992. V. 24. P. 167-178.
Woo P.Т.К., Sin YM., Wong M.K. The effects of short-term acute cadmium exposure on blue tilapia, Oreochromis aureus // Environ. Biol. Fish.- 1993. V. 37. №1. P. 67-74.
Таблица .1
Плотность и профильное поле клеток в обонятельном эпителии красноперки крупночешуйчатой в норме.
Параметры Возрастные группы
0+ 1+ 3-4
Плотность Клеток на 50 мкм Рецепторных 2,7±0,2 3,31±0,4 4,87±0,5
Опорных 7,6±0,4 7,28±0,8 6,36±0,6
Базальных 8,8±0,3 10,04±0,5 10,44±0,4
Секреторных клеток 1 типа Сенсорный эпит, 0,8±0,2
Индифферентный эпит 4,0±0,2 4,4±1,7 2,5±0,8
Секреторных клеток 2 типа Сенсорный эпит, 2,4±0,7 2,87±1,4 5,4±0,5
Индифферентный эпит 0,1±0,0 1,2±0,0
Профильное поле клеток Рецепторных 36,1±1,4 48,05±0,8 48,73±1,2
Опорных 54,1±0,5 35,38±0,7 53,12±1,4
Базальных 37,9±0,2 20,58±1,2 32,49±1,7
Секреторных I типа 98,9±0,4 117,32±0,1 164,86±2,1
Секреторных II типа 55,2±0,3 72,2±0,0 51,44±1,7
Таблица. 2
Продолжительность жизни красноперки в растворах токсикантов, ч.
Концентрация, мг/л Медь Кадмий Цинк Ariel Кристалл-2
X lim Lim X lim X lim X lim
1 15 4,5-20 - - - - - - - -
10 2,6 1,8-3,3 23 20-28 38 18-41 - - - -
10(сеголетки) 3,5 3-4,5 25 20-30 41 36-51 - - - -
20 2 1,8-2,5 18 13-25 21 12-30 - - - -
40 1 0,5-1,3 5,5 4,5-6 4 3,5-5,5 18 5-28 10 9,2-30
40(сеголетки) - - - - - - 20 15-30 14 10-32
100 - - - - - - 5,5 4-6 1,5 1-2,5
Таблица. 3
Толщина тканевых слоев обонятельных складок после воздействия солей тяжелых металлов (П- половозрелые особи, С- сеголетки).
Токсикант Концентрация, мг/л Сенсорный эпителий Соеденительнотканная прослойка
П С П С
1 43,04±0,01 43,12±0,9
10 52,8±0,23 41,6±0,3 52,0±1,3 32,8±0,52
20 50,4±0,25 51,76±0,1
40 64,73±0,05 69,36±0,4
Контроль 56,36±0,46 34,4±0,52 57,44±0,78 34,32±0,04
Cd 10 42,96±0,03 32,96±0,03 57,6±1,6 34,08±0,0
20 49,12±0,1 58,04±0,5
40 77,92±0,2 88,48±0,2
Контроль 59,42±0,85 32,23±0,02 57,31±0,43 34,14±0,02
7П 10 35,76±0,3 39,04±0,5 35,76±0,6 48,4±0,27
20 43,44±1,3 47,6±1,3
40 62,32±1,2 75,01±0,2
Контроль 57,86±046 34,89±0,63 57,67±0,56 35,12±0,35
АлЫ 40 41,44±0,5 52,24±0,1 48±1,2 29,52±0,0
100 58,4±0,2 47,04±1,5
Контроль 57,27±0,54 37,4±0,52 55,34±0,58 34,2±0,06
Кристалл-2 40 48,32±0,4 35,82±0,0 46,88±0,1 36,01±0,0
100 62,16±0,1 61,84±0,2
Контроль 59,85±0,19 34,35±0,31 56,35±0,34 34,63±0,52
Таблица. 4
Плотность клеток на 50 мкм после воздействия токсикантов.
Токсикант Концентрация, мг/л рецепторных клеток опорных клеток
П С П С
Cu 1 3,88±0,63 0 5,82±0,54 0
10 2,78±0,27 0 6,31±0,34 0
Контроль 4,92±0,84 2,82±0,92 6,47±0,25 7,58±0,51
Cd 10 3,09±0,67 1,8±0,28 5,92±0,61 6,8±0,34
20 0 0 6,34±0,34 0
Контроль 4,75±0,38 2,41±0,84 6,32±0,26 7,31±0,26
Zn 10 4,07±0,56 2,1±0,51 7,51±0,45 7,53±0,31
20 3,8±0,54 0 6,2±0,53 0
40 3,1±0,77 0 6,01±0,12 0
Контроль 4,85±0,56 2,93±0,34 6,35±0,24 7,91±0,46
Ariel 40 3,15±0,34 2,05±0,37 6,63±0,34 6,8±0,28
Контроль 4,78±0,38 2,66±0,42 6,44±0,24 7,48±0,35
Примечание: при остальных концентрациях клетки сенсорного эпителия разрушаются, описание в тексте.
Таблица. 5
Шкала оценки степени поражения сенсорного эпителия, под действием тяжелых металлов и бытовых детергентов
Степень поражения, баллы Признаки Концентрация токсиканта, мг/л
Cd Zn Крис- талл-2 Ariel
I Эпителий имеет слоистость; жгутики и ворсинки не слипаются; слизи мало; клетки в хорошем состоянии (норма строения)
II Эпителий сохраняет слоистость; обильное выделение слизи; жгутики и ворсинки слипаются, частично потеряны. 1 10 10
III В эпителии наблюдаются разрывы, отек; разрушение цилиарного аппарата клеток; рецепторные клетки вытягиваются, их количество уменьшается. 10 20 20, 40 40
IV Слоистость эпителия нарушается; имеются многочисленные разрывы эпителия, отек; рецепторных и секреторных клеток нет; эпителий отслаивается от соединительной ткани; выход крови наружу, утолщение соединительной ткани. 20 40 100
V Слоистость эпителия полностью исчезает; все клетки теряют свою форму; цитоплазматическая мембрана клеток разрушается, остаются темные ядра; утолщение эпителия и соединительной ткани; выброс обрывков эпителия в полость обонятельного мешка; некробиоз эпителия. 40 40 100
