CC BY
31
УДК 544.773.33
БИОМОЛЕКУЛЫ В КОЛЛОИДНЫХ НАНОКОНТЕЙНЕРАХ ДЛЯ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВ: ВКЛЮЧЕНИЕ И СВОЙСТВА ДЕЛЬТА-СОН ИНДУЦИРУЮЩЕГО ПЕПТИДА
Т.В. Суханова1, И.А. Прудченко1, Е.С. Ефремов1, С.В. Угланова2, Л.Ю. Филатова2, Е.А. Марквичева1, Н.Л. Клячко2
(Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; кафедра химической энзимологии химического факультета МГУ; e-mail: klyachko@enzyme.chem.msu.ru)
Для включения гидрофильных биомолекул созданы и охарактеризованы наноэмульсии типа вода в масле (в/м) из нетоксичных компонентов с использованием низких концентраций АОТ (5%) и соевого лецитина Lipoid S100 (10%) в эвкалиптовом масле и лимонене. Выявлено, что наибольшей солюбилизационной емкостью (12% водного раствора) обладали системы с использованием АОТ; методом фотон-корреляционной спектроскопии показано, что размеры наноэмульсий 5% АОТ в эвкалиптовом масле увеличивались линейно с ростом содержания воды. Показано, что гидрофильный дельта-сон индуцирующий пептид (ДСИП), относящийся к регуляторным нейропептидам, способен включаться в наноэмуль-сии типа в/м в отсутствие и в присутствии дополнительных биополимеров. Включение ДСИП в наноэмульсии приводит к существенной его стабилизации (80-90% через 2 мес инкубирования при 22°С против 28% в водном растворе). Изучена кинетика выхода пептида в модельном эксперименте in vitro; выявлено существенное замедление выхода пептида из наноэмульсии по сравнению с водным раствором. Содержащие ДСИП наноэмульсионные системы, пригодные для использования в медицине и косметологии, могут служить основой для разработки новых стабильных лекарственных форм пептидных препаратов пролонгированного действия.
Ключевые слова: наноэмульсии, обращенные мицеллы, дельта-сон индуцирующий пептид (ДСИП), стабильность ДСИП, выход пептида in vitro.
Разработка лекарственных препаратов на основе природных биологически активных соединений (пептидов и ферментов) - одно из перспективных направлений фармакологии. Пептиды, в частности нейропепти-ды, занимают важное место в химической передаче информации и других регуляторных процессах. Использованный в данной работе дельта-сон индуцирующий пептид, ДСИП (ТгрА1а01у01уА8рА1а8ег01у01и), относится к регуляторным нейропептидам и обладает стресс-протективным и адаптогенным действием [1]. Кроме того, ДСИП проявляет антиоксидантные свойства, снижая, в частности, перекисное окисление ли-пидов, и ускоряет фосфорилирование АТФ [2]. Проблема использования ДСИП и многих других водорастворимых пептидов и ферментов заключается в их низкой химической стабильности и быстром расщеплении под действием ферментативных систем организма. Одним из перспективных вариантов решения проблемы стабильности биомолекул является их включение в различные коллоидные наноконтейнеры [3-12]. Так, например, тройные системы поверхностно-активное вещество
(ПАВ)/липид-вода-масло /органический растворитель, образующие мицеллы, микро- и наноэмульсии типа вода/масло или масло/вода используются как контейнеры для различных вариантов (интраназальной, трансдер-мальной и т.д.) доставки лекарств [13-16], регуляции свойств ферментов [17-20], изменения их стабильности [17, 20], а также в качестве матриц для получения на-ночастиц типа полимер-ПАВ для увеличения времени выхода водорастворимых лекарств [4, 21-22]. Интерес к системам на основе ПАВ/липидов большой, их привлекательность обусловлена, в частности, простотой приготовления и универсальностью, позволяющией работать как с водорастворимыми, так и водонераствори-мыми соединениями. Однако не всегда можно заранее предсказать, как поведет себя биомолекула в присутствии ПАВ/липидов и органических растворителей различной природы. Кроме того, представляется важным разработка стабильных систем с низкими концентрациями ПАВ и уменьшение количества компонентов. Данная работа посвящена разработке наноэмульсий типа вода/масло, включению ДСИП в такие системы и изу-
чению стабильности пептида в наноэмульсиях. Разработанный на основе биокапсул ированных в наноконтей-неры биоактивных пептидов и ферментов подход может быть использован для создания эффективных систем доставки лекарств.
Экспериментальная часть Материалы
В работе использовали ДСИП (pI 4,7; 849 Da, лаборатория химии пептидов, ИБХ РАН); DEAE-Декст-ран (MM = 500 кДа, "PKS", Германия). Модифицированный хитозан в форме четвертичного аммониевого основания (MM = 6500 кДа, степень дезацетилирова-ния 0,87; степень замещения 0,65) был любезно предоставлен профессором А. Бартковиаком (Польша). Использовали также эвкалиптовое масло (ООО "Натуральные масла", Россия), (Я)-(+)-лимонен, изопро-пилмиристат, плюроник F127 ("Sigma-Aldrich", США), натриевую соль ди-(2-этил)-гексилового эфира сульфоянтарной кислоты (Aerosol OT, АОТ) ("Sigma Ultra", США), соевый лецитин Lipoid S100, ("Lipoid", Германия), ацетонитрил ("Biosolve", Нидерланды), трифторуксусную кислоту (ТФУ) ("Aldrich", США) и деионизованную воду, очищенную c помощью установки "Millipore" (США).
Методы
Приготовление наноэмульсий. Для приготовления наноэмульсии (рис. 1) к 100 мкл органической фазы добавляли 2-12 мкл водной фазы и энергично пере-
мешивали на мешалке ("Vortex", США) до получения прозрачной системы. Органическая фаза представляла собой эвкалиптовое масло (ЭМ), лимонен или изопропилмиристат, содержащие в качестве ПАВ АОТ (5% v/v) или липоид S100 (10% v/v); водная фаза представляла собой либо деионизиро-ванную воду, либо фосфатно-солевой буфер (PBS, pH 7,4), содержащие 2% (w/v) плюроника F127. В качестве дополнительных компонентов в состав водной фазы вводили либо DEAE-декстран, либо модифицированный хитозан до конечной концентрации 2 мг/мл в виде водных растворов. Конечная концентрация ДСИП в системе была постоянной и составляла 4,5 мг/мл.
Определение размеров наноэмульсии (обращенных мицелл). Молекулярные характеристики образующихся наноэмульсий (обращенных мицелл) исследованы методом динамического светорассеяния на установке "ALV-CGS-5022F" (Германия). Измерения проводили в неполяризованном свете при угле рассеяния 90°. Перед измерением растворы анализируемых образцов фильтровали через фильтры фирмы "Millipore" (0,45 мкм) непосредственно в измерительную кювету. Анализировали зависимости гидродинамических радиусов мицелл от содержания воды в системе (молярное отношение воды и поверхностно-активного вещества).
Определение концентрации ДСИП методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) проводили в изократическом и градиентном
Рис. 1. Схематическое изображение обратной наноэмульсии
режиме (ацетонитрил) на хроматографе "System Gold" ("Beckman", США), колонка Luna 5u C18(2) 100, 150x2,0 мм ("Phenomenex", США) при длине волны 222 нм. Объем вводимой в инжектор пробы составлял 10 мкл. При работе в изократическом режиме использовали подвижную фазу, содержащую 0,07% ТФУ в 13%-м ацетонитриле, скорость элюции составляла 0,25 мл/мин. При работе в режиме градиента ацетонитрила использовали системы А (0,07% ТФУ в воде) и В (90%-й раствор ацетонит-рила). Доля системы В возрастала в течение 34 мин в диапазоне 0-60%. Скорость элюции составляла 0,3 мл/мин.
Изучение стабильности пептида в составе наноэмульсии. Пробирки эппендорф, содержащие по 103 мкл оптически прозрачной наноэмульсии с включенным пептидом в отсутствие и в присутствии полимерных добавок (плюроник F127, DEAE-декстран и хитозан), инкубировали в течение 2 мес при 22 и 4°С. Через определенные промежутки времени аликвоты образцов разводили 10-кратно 70%-м раствором ацетонитрила и анализировали методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в градиенте ацетонитрила.
Изучение кинетики выхода пептида из наноэмульсии in vitro. В качестве модели для изучения кинетики выхода ДСИП из наноэмульсии in vitro был использован диализ через полупроницаемую мембрану. В типичном эксперименте 103 мкл пептидсодер-жащей наноэмульсии помещали в микропробирку, закрытую мембраной "Spectrapor" ("Spectrum Medical Industries, Inc.", США), задерживающую частицы с
молекулярными массами выше 8 кДа и свободно пропускающую ДСИП и низкомолекулярные вещества. Диализ проводили в течение суток при 37°С против 1 мл составного буфера PBS (рН 7,4), имитирующего солевой состав организма. Через определенные промежутки времени отбирали аликвоты из внешнего раствора, проводили определение концентрации ДСИП методом ВЭЖХ и строили профиль выхода пептида из наноэмульсии.
Результаты и их обсуждение Подбор наноэмульсионных систем для включения ДСИП. Поскольку ДСИП является водорастворимым пептидом, в качестве систем для включения мы взяли наноэмульсии типа вода/масло (в/м), имеющие внутреннюю полярную полость, образованную полярными "головами" ПАВ (липида), в то время как неполярные "хвосты" были направлены наружу, во внешнюю неполярную фазу (рис. 1). В качестве ПАВ для образования наноэмульсий при низких концентрациях и в отсутствие ко-ПАВ был выбран АОТ, широко используемый для включения белков и ДНК, а также для изучения функции ферментов [17, 19-20]. В работах [23-25] АОТ использовали для создания наноэмульсионных систем медицинского назначения: включения водорастворимых антибиотиков и трасдер-мальной доставки гидрофильного антинеопластика. В качестве органической фазы для образования обратных (в/м) наноэмульсий мы взяли используемые в медицине растительное масло (эвкалиптовое), лимонен и изопромилмиристат [14-15, 26]. Для получения максимальной солюбилизационной емкости систем в
Т а б л и ц а 1
Солюбилизационная емкость наноэмульсий различного состава
Номер образца Органическая фаза ПАВ Содержание водного раствора, %
1 эвкалиптовое масло АОТ* 10
2 эвкалиптовое масло липоид S100** 4
3 лимонен АОТ* 12
4 лимонен липоид S100** <2
5 изопропилмиристат АОТ* <2
6 изопропилмиристат липоид S100** <2
*Содержание в органической фазе АОТ 5%; "содержание в органической фазе липоида S100 10%.
Рис. 2. Зависимость гидродинамического радиуса наноэмульсии (5% АОТ в эвкалиптовом масле) от содержания воды в системе (молярное отношение воды и ПАВ)
качестве водной фазы использовали 2%-й водный раствор плюроника Б127. Содержание АОТ и липоида 8100 составляло 5 и 10% соответственно. Данные представлены в табл. 1.
Как видно из табл. 1, наибольшей солюбилизацион-ной емкостью обладают системы на основе АОТ. Использование липоида 8100 требует, по всей видимости, наличия дополнительных компонентов в системе, например, н-бутанола. Растворы на основе АОТ и липоида в изопропилмиристате не позволили включать сколь-нибудь значительное количество водной фазы (происходило расслаивание). Поэтому для включения ДСИП и изучения его стабильности в отсутствие и в
присутствии добавок были выбраны системы на основе АОТ.
Размеры наноэмульсии на основе АОТ в эвкалиптовом масле определяли методом фотон-корреляционной спектроскопии (динамическое светорассеяние) в зависимости от содержания водной фазы в системе. Полученные результаты свидетельствуют о достаточно узком распределении на-ноэмульсий по размерам при каждом заданном соотношении водная фаза/АОТ (рис. 2). Как видно из рис. 2, зависимость гидродинамического радиуса мицелл от степени гидратации ПАВ (молярное отношение воды и АОТ) имеет вид прямой: увеличение содержания воды приводит к увеличению размеров частиц. Следует отметить, что в условиях, выбранных для солюбилизации пептида, гидродинамический радиус частиц составляет 6,75 нм и практически не меняется при внесении в систему 2%-го раствора плюроника F-127. Размеры частиц в системе практически не меняются при инкубировании растворов в течение 2 мес.
Изучение стабильности ДСИП в наноэмульсиях. Образцы пептида в водном растворе и системе 1 (табл. 1) инкубировали в течение 2 мес при 22 и 4°С. В состав наноэмульсий в качестве дополнительных веществ мы вводили также полиэлектролиты (хи-тозан и DEAE-декстран) для возможного усиления взаимодействий с пептидом и полярными группами АОТ. Важно отметить, что хитозан обладает мукоад-гезивными свойствами [5, 27], что может быть использовано в дальнейшей работе с пептидом in vivo.
Рис. 3. Кинетика изменения концентрации ДСИП во внешнем растворе от времени инкубирования образцов при 37°С при диализе через полупроницаемую мембрану (граница молекулярных масс 8 кДа) против буферного раствора PBS (рН 7,4): 1 - водный раствор; 2-4 - 5% АОТ в эвкалиптовом масле, содержащий
2% F127 (2), хитозана (3), DEAE-декстрана (4)
Т а б л и ц а 2
Изменение концентрации ДСИП при его инкубировании в течение 2 мес при 22 и 4°С в наноэмульсии в отсутствие и присутствии добавок
Образец Количество ДСИП, % при температуре, °С
22 4
Система 1 (по данным табл. 1) / вода 80±4 92±1
Система 1 / PBS нет данных 83±3
Система 1 + DEAE-декстран (2 мг/мл) 76±3 88±1
Система 1 + хитозан (2 мг/мл) 73,7±0,4 87±2
Как было установлено, инкубирование пептида в наноэмульсии при 4°С сохраняет до 92% его исходной концентрации, а в водном растворе - только 38%. Следует отметить, что инкубирование ДСИП в буфере PB S приводит к его существенной дестабилизации; так, только 10% пептида обнаруживается уже на 5 сутки. При инкубировании пептида в наноэ-мульсии при 22°С через 2 мес сохраняется в среднем 73-84% от исходной концентрации, в то время как в воде его концентрация падает до 27% уже через 1 мес (табл. 2).
Изучение кинетики выхода пептида из наноэмульсии in vitro. Для изучения поведения пептид-содержащей наноэмульсии при циркулировании в организме в условиях дальнейшего разведения в присутствии солевого раствора и для слежения за выгсодом пептида из наноэмульсии в эксперименте in vitro в качестве модельного был использован диализ через полупроницаемую мембрану против буферного раствора PBS. На рис. 3 приведены данные по
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. КопликЕ.В., Умрюхин П.Е., Конорова И.Л., Терехина О.Л. и др. // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова.
2007. 107. С. 50.
2. Khvatova E.M., Samartzev VN., Zagoskin P.P., Prudchenko I.A., MikhalevaI.I. // Peptides. 2003. 24. Р. 307.
3. MishraB, PatelB.B., TiwariS. // Nanomedicine: NBM. 2009. Xx. 1-17, doi: 10.1016/j.nano.2009.04.008.
4. Anton N., Benoit J.-P., Saulnier P. // J. Controlled Release.
2008. 128. P. 185.
5. Amidi M., Mastrobattista E., Jiskoot W., Hennink W. // Advanced Drug Delivery Reviews. 2009. Doi: 10,1016/ j.addr.2009.11.009.
6. Mundargi R.C., Babu V.R., Rangaswamy V., Patel P., Aminabhavi T. V. // J. Strolled Release. 2008. 125. P. 193.
изменению концентрации ДСИП при диализе в течение суток. Как видно, при диализе пептида из водного раствора (рис. 3, кривая 1) через 24 ч он практически полностью обнаруживается в объемном растворе. Выход пептида существенно замедляется при использовании наноэмульсии с различными добавками (кривые 2-5), концентрация ДСИП в объемном растворе через 24 ч составляла немногим более 20%. Созданы наноэмульсии типа в/м на основе нетоксичных компонентов с низкими концентрациями для включения гидрофильного регуляторного ней-ропептида ДСИП. Показано, что включение пептида в нано-эмульсии АОТ в эвкалиптовом масле в присутствии плюроника Б127, ВЕЛЕ-декстрана или хито-зана приводит к повышению стабильности пептида и замедлению его выхода из наноконтейнеров. Разработанный подход на основе биокапсулированных в нано-контейнеры биоактивных пептидов и ферментов может быть использован для создания эффективных систем доставки лекарств.
7. Pinto Reis C., Neufeld R.J., Ribeiro A.J., Veiga F. II Nanomedicine. 2006. 2. P. 53.
8. PatelM.M., Goyal B.R., Bhadada S. V., Bhatt J.S., Amin A.F. II CNS Drugs. 2009. 23. P. 35.
9. Cheng Q., Feng J., Chen J., Zhu X., Li F. II Biopharm. Drug Dispos. 2008. 29. P. 431.
10. GoldbergM., Langer R., JiaX. II J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2007. 18. P. 241.
11. Prego C., Torres D., Fernandez-Megia E., Novoa-Carballal R., Quicoe E, Alonso M.J. II J. Control Release. 2006. 111. P. 299.
12. SochaM., Bartecki P., Passirani C., Sapin A. et al. II J. Drug. Target. 2009. 17. P. 575.
13. ElMaghraby G.M. II Int. J. Pharm. 2008. 355. P. 285.
14. Santos P., Watkinson A.C., Hadgraft J., Lane M.E. // Skin Pharmacol. Physiol. 2008. 21. P. 246.
15. Junyaprasert V.B., Boonme P., Songkro S., KrauelK., Rades T. // J. Pharm. Pharm. Sci. 2007. 10. P. 288.
16. Kumar M, Misra A., Babbar A.K., Mishra A.K., Mishra P., Pathak K. // Int. J. Pharm. 2008. 358. P. 285.
17. Klyachko N.L., Levashov A.V // Curr Opin Colloid Interface Sci. 2003. 8. P. 179.
18. Klyachko N.L., Shchedrina V.A., Efimov A.V, Kazakov S.V, Gazaryan I.G., Kristal B.S., Brown A.M. // J. Biol. Chem. 2005. 280. P. 16106.
19. BiasuttiM.A., AbuinE.B., Silber J.J., CorreaN.M., LissiE.A. // Adv. Colloid Interface Sci. 2008. 136. P. 1.
20. Klyachko N.L., Levashov A.V. // Biomolecular Catalysis: Nanoscale Science and Technology / Eds. J.B. Kim, S. Kim, P. Wang. ACS Symposium Series N 986. ACS, Washington, 2008. Ch. 9. P. 156.
21. Chavanpatil M.D., Khdair A., Patil Y., Handa H., Mao G., Panyam J. // J. Pharm. Sci. 2007. 96. P. 3379.
22. Chavanpatil M.D., Khdair A., Panyam J. // Pharm. Res. 2007. 24. P. 803.
23. Liu H, Li S., Wang Y, Han F., Dong Y. // Drug Dev. Ind. Pharm. 2006. 32. P. 549.
24. Janyaprasert V.B., Boonme P., Wurster D.E., Rades T. // Drug Delivery. 2008. 15. P. 323.
25. Gupta R.R., Varshney J.M. // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2005. 41. P. 25.
26. Subramanian N., Ghosal S.K., Acharya A., Moulik S.P. // Chem. Pharm. Bull. 2005. 53. P. 1530.
27. Agnihotri S. A., Mallikarjuna N. N., Aminabhavi T. M. // J. Controlled Release. 2004. 100. P. 5.
Поступила в редакцию 20.01.10
BIOMOLECULES IN COLLOID NANOCARRIERS FOR DRUG DELIVERY: ENTRAPPMENT AND PROPERTIES OF DELTA-SLEEP INDUCING PEPTIDE
T.V. Sukhanova, I.A. Prudchenko, E.S. Efremov, S.V. Uglanova, L.Yu. Filatova, E.A. Markvicheva, N.L. Klyachko
(Shemyakin & Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS; Department of Chemical Enzymology, Faculty of Chemistry, M. V.Lomonosov Moscow State University)
Nanoemulsions of water in oil type using non-toxic components on the base of AOT (5%) and soya bean lecithin Lipoid S100 (10%) in eucalyptus oil and limonene were developed and characterized. As shown, AOT based systems possessed maximal solubilization capacity (12% of aqueous solution); sizes measured with photon-correlation spectroscopy were in linear dependence with water content. As shown, hydrophilic delta-sleep inducing peptide (DSIP) (regulatory neuropeptide) was able to be included into nanoemulsions of w/o type in the absence and presence of biopolymeric additives. DSIP entrapment into nanoemulsion led to its significant stabilization (80-90% after 2 months of incubation at 22oC in contrast to 28% in water). Peptide release kinetics was studied in model in vitro experiment (dialysis) and significant retardation of DSIP release from nanoemulsion in comparison with water was found. DSIP containing nanoemulsion systems useful for medicine and cosmetics can serve as a base for development of novel stable drug formulations of durable action.
Key words: nanoemulsions, delta-sleep inducing peptide (DSIP), peptide stability, in vitro peptide release.
Сведения об авторах: Суханова Татьяна Владимировна — аспирант Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (sukhanovat@mail.ru); Прудченко Игорь Аркадиевич - науч. сотр. Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, канд. хим. наук (iaprud@mx.ibch.ru); Ефремов Евгений Степанович - ст. науч. сотр. Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, канд. хим. наук (ees@ibch.ru); Угланова Светлана Вадимовна -аспирант кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ; Филатова Любовь Юрьевна - сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, канд. хим. наук (lubfil@rambler.ru); Марквиче-ва Елена Арнольдовна - вед. науч. сотр. Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, докт. хим. наук (lemark@mx.ibch.ru); Клячко Наталья Львовна - профессор кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, докт. хим. наук (klyachko@enzyme.chem.msu.ru).
