CC BY
40
УДК 577.156.6:541.182-034]-092.9(045)
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ВЫСОКОДИСПЕРСНЫХ ПОРОШКОВ МЕТАЛЛОВ НА ФЕРМЕНТЫ СЫВОРОТКИ КРОВИ МЫШЕЙ
© 2010 г. Ю.С. Дудакова1, И.В. Бабушкина2, А.Н. Понукалин1, В.Б. Бородулин1, И.А. Клименко1, М.М. Сакала1, И.А. Горошинская3
1Саратовский государственный медицинский университет, ул. Б. Казачья, 112, г. Саратов, 410012,
2г
Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии, ул. Чернышевского, 148, г. Саратов, 410002, [email protected]
3Ростовский научно-исследовательский
онкологический институт, ул. 14линия, 63, г. Ростов н/Д, 344037, [email protected]
2Saratov State Medical University, B.Kazachia St., 112, Saratov, 410012, [email protected]
2Saratov Research Institute of Traumatology and Orthopedy, Chernyshevskiy St., 148, Saratov, 410002, [email protected]
3 Rostov Research Oncological Institute, 14-line, 63, Rostov-on-Don, 344037, [email protected]
Проведено исследование активности трансаминаз, лактатдегидрогеназы, гаммаглутамилтрансферазы, щелочной фосфатазы, креатинкиназы и амилазы в сыворотке крови самцов мышей, которым перорально вводились суспензии высокодисперсных порошков металлов (железа, меди, цинка и сплава этих металлов) в различных концентрациях. Анализ полученных результатов позволил предположить, что высокодисперсные порошки металлов оказывают токсическое действие на организм. Выявлено, что введение суспензии нанопорошка цинка оказалось наиболее щадящим для организма животных. Наиболее выраженным токсическим действием обладает нанопорошок меди и железа, оказывая дестабилизирующее действие на мембранные структуры гепатоцитов.
Ключевые слова: наночастицы, высокодисперсные порошки металлов, сывороточные ферменты.
It is carried out research of activity aminotransferases, lactatedehydrogenase, gammaglutamiltransferase, alkaline phosphatase, frea-tinphosphokinase and amylase in blood serum of mice, which were entered per os suspensions high disperse powders of metals (iron, copper, zinc and an alloy of these metals) in various concentration. The analysis of the received results has allowed to assume, that high disperse powders of metals have toxic effect on organism. It is shown, that introduction of suspension of alloy [Fe Zn Cu] has appeared the most sparing for animal organisms. The most expressed toxic action possesses nanopowder copper, having destabilizing effect on membranous structures of hepatocytes.
Keywords: nanoparticles, high disperse powders of metals, blood serum enzymes.
Использование высокодисперсных порошков (ВДП) металлов для создания лекарственных средств является одним из приоритетных направлений современной медицины, поскольку металлы в виде наноча-стиц характеризуются высокой проникающей способностью, химической (в том числе каталитической) и биологической активностью, обладают пролонгированным действием [1]. Вместе с тем низкая токсичность и биодиградируемость - определяющие свойства лекарственного средства [2].
Наиболее широко применяемые в биологии и медицине частицы состоят из ферромагнитного или парамагнитного ядра и имеют калиброванные контролируемые размеры от нескольких нанометров до нескольких микрон, обычно с очень небольшим разбросом по диаметру [3].
В медицинской практике и биологии наночастицы наиболее часто используют в форме биосовместимых магнитных жидкостей, которые представляют собой взвесь магнитных частиц в водных буферных растворах разного состава, иногда в водно-масляных эмульсиях [3].
Особое внимание уделяется исследованию действия на организм ВДП биогенных металлов, в частности меди, цинка, железа, биологическая ценность которых определяется многогранностью функций в сложных биохимических процессах и активным участием в клеточном дыхании, обеспечивающем нормальное функционирование тканей организма.
Данная работа посвящена изучению эффектов пе-рорального введения ВДП железа, меди, цинка и сплава ре гп Си] на ферменты сыворотки крови животных. Для исследования выбраны ферменты, локализованные в разных органах. По их активности в сыворотке крови принято судить о состоянии клеток этих органов. В работе оценена активность трансами-наз (аспартатаминотрансферазы (АсАТ) и аланинами-нотрансферазы (АлАТ)), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), гаммаглутаминтрансферазы (ГГТ), щелочной фосфа-тазы (ЩФ), креатинфосфокиназы (КФК) и амилазы.
Активность трансаминаз (АсАТ и АлАТ) широко используется в биохимической практике как тест на изменение проницаемости мембран гепатоцитов и выраженность цитолитического синдрома, так как наибольшая удельная активность данных ферментов отмечена в печени. Поскольку высокая активность АсАТ проявляется также в сердце, поджелудочной железе и почках, а АлАТ - в поджелудочной железе и селезенке, по активности данных ферментов можно судить о состоянии клеток данных органов.
ЛДГ - гликолитический цинксодержащий фермент, обратимо катализирующий окисление лактата в пируват, является важным биохимическим показателем углеводного обмена, отражающим степень выра-
женности внутритканевой гипоксии. Наибольшая активность ЛДГ обнаружена в печени, почках и сердечной мускулатуре (в зависимости от изоферментного состава). В работе определена активность общей ЛДГ.
Экскреторные ферменты ГГТ и ЩФ, локализованные преимущественно в печени и почках, используются в качестве индикаторов токсического поражения данных органов.
Наибольшая активность КФК наблюдается в сердечной мышце, что обусловило преимущественное использование этого фермента в диагностике инфаркта миокарда.
Не менее важным биохимическим показателем является амилаза сыворотки крови, относящаяся к группе гидролаз, катализирующих гидролиз полисахаридов. Определение активности амилазы имеет важное значение в диагностике заболеваний поджелудочной железы [4].
Объектом исследования стали ВДП железа, меди, цинка и сплава [Ре гп Си], синтезированные на плазмо-химическом комплексе ФГУП РФ ГНЦ ГНИИХТЭОС (г. Москва). Средний размер наночастиц колебался в пределах 50 - 80 нм. Процентное содержание элементов в сплаве ре гп Си]: Бе - 25, гп - 15, Си - 60 %.
Работа выполнена на трехмесячных самцах белых беспородных мышей массой 20,0±3,0 г, содержавшихся на стандартном рационе вивария.
Мышей распределяли в одну контрольную группу (10 мышей), которая не подвергалась воздействиям ВДП - группа сравнения; 4 экспериментальные группы (160 мышей). 1-я экспериментальная группа получала ВДП железа; 2-я - ВДП меди; 3-я - ВДП цинка; 4-я - ВПД сплава [Бе гп Си].
Каждая экспериментальная группа состояла из 4 подгрупп в зависимости от концентрации введенного исследуемого нанопорошка. 1 -й подгруппе вводили 1 мкг/20 г (0,05 мг/кг); 2-й - 25 мкг/20 г (1,25 мг/кг); 3-й - 50 мкг /20 г (2,5 мг/кг); 4-й - 100 мкг/20 г (5,0 мг/кг). Выбранные концентрации наночастиц не превышают максимальных переносимых доз для данных металлов [5]. Все ВДП вводились в виде масляной суспензии в количестве 0,01 мл/сут в течение 5 дней. По окончании эксперимента мышей декапитировали.
В биохимических исследованиях анализировалась сыворотка крови. Для этого в ходе процедуры декапи-тации собиралась смешанная кровь с горлового среза в сухую чистую пробирку без использования антикоагулянтов. Для ускоренного образования кровяного тромба пробирку со смешанной кровью помещали на 10 мин в термостат с температурой 37 °С. После отделения тромба плазму центрифугировали в течение 10 мин. Полученную сыворотку переносили в сухую чистую пробирку и использовали для дальнейшего биохимического исследования.
Для клинико-лабораторного исследования сыворотки крови экспериментальных животных использовали прибор «HOSPITEX», Screen master (Швейцария) -полуавтоматический анализатор, включающий фотометр, микропроцессор, в котором запрограммирован алгоритм проведения 60 биохимических тестов, инкубатор, обеспечивающий температуру + 37 °С. Все определения проводили по конечной точке. Прибор представляет собой спектрофотометр со стандартным набором реагентов, предназначенный конкретно для определения одного из изучаемых биохимических парамет-
ров крови: АсАТ, АлАТ, ЛДГ, ЩФ, КФК, ГГТ, амилазы. Методы являются унифицированными [6].
Полученные цифровые данные были обработаны статистически с использованием критерия Стьюдента с определением достоверности различий между контрольной и экспериментальными группами. Достоверными считались различия между группами при р < 0,05.
Результаты исследований
Результаты исследований биохимических показателей при пероральном введении суспензий нанопо-рошков металлов отражены в табл. 1 - 4.
Таблица 1
Влияние исследуемого ВДП железа на активность ферментов сыворотки крови (1-я группа)
Биохимический показатель Контроль Концентрация наночастиц, мг/кг
0,05 1,25 2,50 5,00
M±m M±m р* M±m Р M±m Р M±m Р
АсАТ, МЕ 120,00± ±9,25 327,00± ±12,81 <0,001 342,50± ±11,91 <0,001 372,50± ±15,33 <0,001 517,50± ±6,34 <0,001
АлАТ, МЕ 50,00± ±2,06 82,40± ±0,62 <0,001 68,20± ±3,39 <0,001 57,90± ±2,77 >0,05 56,80± ±2,76 >0,05
ЛДГ, МЕ 2025,00± ±153,28 5312,50± ±72,88 <0,001 12887,50± ±280,10 <0,001 13786,50± ±303,66 <0,001 14119,00± ±152,58 <0,001
ГГТ, МЕ 103,2± ±16,66 115,70± ±2,95 >0,05 131,40± ±2,99 >0,05 140,50± ±1,17 <0,05 135,00± ±2,98 >0,05
ЩФ, МЕ 396,00± ±2,18 58,40± ±1,90 <0,001 76,90± ±3,22 <0,001 128,30± ±1,36 <0,001 122,80± ±1,03 <0,001
КФК, МЕ 1290,00± ±60,88 4636,00± ±181,00 <0,001 2981,00± ±139,07 <0,001 3474,00± ±46,05 <0,05 3488,00± ±67,71 <0,001
Амилаза, МЕ 444,00± ±7,20 458,30± ±26,03 >0,05 482,20± ±9,18 <0,01 397,10± ±17,45 <0,05 266,40± ±2,56 <0,001
' — р - уровень вероятности различий в сравнении с контролем, то же - для табл. 2 - 4.
Таблица 2
Влияние исследуемого ВДП меди на активность ферментов сыворотки крови (2-я группа)
Биохимический показатель Контроль Концентрация наночастиц, мг/кг
0,05 1,25 2,50 5,00
M±m M±m р M±m р M±m р M±m р
АсАТ, МЕ 120,00± ±9,25 142,70± ±10,15 >0,05 112,40± ±2,93 >0,05 110,50± ±2,08 >0,05 197,14± ±18,04 <0,001
АлАТ, МЕ 50,00± ±2,06 66,00± ±4,27 <0,01 78,40± ±3,61 <0,001 102,70± ±9,04 <0,001 103,29± ±6,03 <0,001
ЛДГ, МЕ 2025,00± ±153,28 2414,20± ±27,27 <0,05 2770,40± ±109,20 <0,001 3109,60± ±141,65 <0,001 2884,57± ±226,76 <0,001
ГГТ, МЕ 103,22± ±16,66 131,00± ±5,04 >0,05 155,50± ±6,43 <0,05 175,00± ±1,29 <0,001 124,29± ±4,14 >0,05
ЩФ, МЕ 396,00± ±2,18 318,40± ±18,53 <0,001 302,70± ±16,70 <0,001 325,10± ±15,51 <0,001 373,29± ±10,56 <0,05
КФК, МЕ 1290,00± ±60,88 2478,60± ±103,72 <0,001 2412,00± ±58,21 <0,001 2552,00± ±61,46 <0,001 2562,57± ±24,51 <0,001
Амилаза, МЕ 444,00± ±7,20 515,60± ±6,09 <0,001 549,30± ±9,15 <0,001 571,10± ±5,98 <0,001 604,57± ±2,43 <0,001
Таблица 3
Влияние исследуемого ВДП цинка на активность ферментов сыворотки крови (3-я группа)
Биохимический показатель Контроль Концентрация наночастиц, мг/кг
0,05 1,25 2,50 5,00
M±m M±m Р M±m Р M±m Р M±m Р
АсАТ, МЕ 120,00± ±9,25 138,90± ±8,46 >0,05 153,00± ±8,71 <0,05 129,40± ±4,29 >0,05 155,60± ±9,24 <0,05
АлАТ, МЕ 50,00± ±2,06 70,90± ±4,18 <0,001 54,80± ±2,17 >0,05 122,00± ±4,42 <0,05 69,00± ±6,74 <0,05
ЛДГ, МЕ 2025,00± ±153,28 1935,40± ±72,77 >0,05 2113,30± ±137,03 >0,05 2259,90± ±124,62 >0,05 2025,40± ±148,06 >0,05
ГГТ, МЕ 103,22± ±16,66 132,00± ±3,59 >0,05 129,50± ±4,68 >0,05 140,00± ±3,25 0,05 159,50± ±3,02 <0,01
ЩФ, МЕ 396,00± ±2,18 280,20± ±5,12 <0,001 206,50± ±3,71 <0,001 164,00± ±0,76 <0,001 284,20±0,85 <0,001
КФК, МЕ 1290,00± ±60,88 1200,40± ±48,46 >0,05 3498,80± ±42,70 <0,001 3653,90± ±10,84 <0,001 2803,40± ±79,95 <0,001
Амилаза, МЕ 444,00± ±7,20 121,90± ±4,96 <0,001 119,10± ±6,10 <0,001 139,10± ±7,70 <0,001 152,50± ±5,56 <0,001
Таблица 4
Влияние исследуемого ВДП сплава ^ Zn на активность ферментов сыворотки крови (4-я группа)
Биохимический показатель Контроль Концентрация наночастиц, мг/кг
0,05 1,25 2,50 5,00
M±m M±m р M±m р M±m р M±m р
АсАТ, МЕ 120,00± ±9,25 283,60± ±2,95 <0,001 557,80± ±4,81 <0,001 683,30± ±7,84 <0,001 354,50± ±2,60 <0,001
АлАТ, МЕ 50,00± ±2,06 80,70± ±1,10 <0,001 79,10± ±0,78 <0,001 243,20± ±9,07 <0,001 184,10± ±2,98 <0,001
ЛДГ, МЕ 2025,00± ±153,28 2854,40± ±16,87 <0,001 1489,20± ±10,30 <0,001 1621,80± ±12,62 <0,001 1929,80± ±20,18 >0,05
ГГТ, МЕ 103,22± ±16,66 114,50± ±2,17 >0,05 117,00± ±1,53 >0,05 123,50± ±1,30 >0,05 126,40± ±2,18 >0,05
ЩФ, МЕ 396,00± ±2,18 311,80± ±2,79 <0,001 256,40± ±3,99 <0,001 285,90± ±5,00 <0,001 412,30± ±6,90 <0,05
КФК, МЕ 1290,00± ±60,88 1264,90± ±11,67 >0,05 1939,60± ±23,15 <0,001 3247,00± ±11,93 <0,001 3041,50± ±39,88 <0,001
Амилаза, МЕ 444,00± ±7,20 320,50± ±3,76 <0,001 326,70± ±3,58 <0,001 343,40± ±4,72 <0,001 442,60± ±3,91 >0,05
Для оценки влияния ВДП металлов на ткани печени, сердца и поджелудочной железы проведено определение активности АлАТ, отражающей в основном состояние ткани печени. В контрольной группе животных активность АлАТ составила 50,00±2,06 МЕ. Все исследуемые нанопорошки вызывают значительное увеличение активности данного фермента. В экспериментах с ВДП железа наибольшее увеличение активности АлАТ (на 65 %) отмечено для самой малой концентрации наночастиц - 0,05 мг/кг. Напротив, высокие концентрации наночастиц железа достоверных изменений активности АлАТ не вызвали. При введении животным нанопорошка меди наблюдался дозозависимый эффект увеличения активности фермента. Максимальная активность АлАТ - в экспериментах с ВДП меди при концентрации 5,00 мк/кг. Введение животным ВДП цинка и сплава показало, что данные наночастицы также, вероятно, являются активаторами АлАТ.
При этом необходимо отметить, что наибольшее увеличение ферментативной активности происходит при введении ВДП в дозировках 2,50 и 5,00 мг/кг (активность фермента увеличивается в 2 - 4 раза по сравнению с контролем). Полученные данные по активности АлАТ свидетельствуют о том, что под влиянием ВДП металлов наблюдается выраженный эффект увеличения проницаемости мембран.
Активность АсАТ характеризует главным образом состояние печени и сердца. В контрольной группе она составила 120,00±9,25 МЕ. В экспериментальных группах существенное достоверное изменение наблюдалось только при введении ВДП железа и сплава ^ Zn ^^ При этом для нанопорошка железа отмечается прямая зависимость увеличения активности АсАТ от концентрации наночастиц. Для ВДП сплава ^ Zn увеличение активности АсАТ, видимо, обусловлено наночастицами железа, входящими в состав сплава, при этом наибольшая активность фер-
мента регистрируется при концентрациях наночастиц 1,25 и 2,50 мг/кг.
Изучение действия ВДП металлов на активность ЛДГ выявило, что введение нанопорошка меди оказывает влияние на активность данного фермента в меньшей степени, чем введение других нанопорош-ков. По сравнению с контрольной группой животных (активность ЛДГ составила 2025,00±153,28) самое большое увеличение активности ЛДГ наблюдалось в экспериментах с ВДП железа (активность возрастала в 2,5-4,5 раза). Ведение нанопорошка цинка в малых концентрациях (0,05 мг/кг), напротив, вызывает некоторое снижение активности ЛДГ, что, видимо, обусловлено включением наночастиц цинка в структуру фермента. Достоверное уменьшение активности ЛДГ отмечено в экспериментальных группах, получавших ВДП сплава ^ Zn ОД.
В процессе экспериментальных исследований проанализировано влияние нанопорошков на активность ГГТ, высокая активность которой наблюдается в тканях почек, печени и поджелудочной железы. ГГТ содержится в основном в мембранах клеток, обладающих высокой секреторной и адсорбционной активностью: эпителиальные клетки, выстилающие желчные пути, печеночные канальцы, панкреатическая экзокринная ткань и выводные протоки. В порядке снижения удельной активности ГГТ ткани располагаются так: почки, печень, поджелудочная железа, щеточная кайма клеток тонкого кишечника. Активность ГГТ не обнаружена в скелетных мышцах и миокарде. У интактных мышей активность ГГТ составила 103,22±16,66 МЕ. В экспериментах с животными, которым вводилась масляная суспензия ВДП сплава ^ Zn достоверных изменений активности данного фермента не выявлено. ВДП меди и цинка в концентрациях свыше 0,05 мг/кг оказывают активирующее действие на активность ГГТ (активность фермента возрастала на 50 - 75 % по сравнению с контролем).
ЩФ проявляет высокую удельную активность в клетках эпителия почечных канальцев, гепатоцитах и остеобластах. Этот фермент локализуется в плазматической мембране, является эктоэнзимом.
Исследование активности ЩФ широко используют в практической биохимии для диагностики патологии гепатобилиарной системы и костной ткани. Активность ЩФ часто повышена при обструктивных заболеваниях печени, гепатите, явлениях гепатоток-сичности и холестазе. В контрольной группе животных активность ЩФ составила 396,00±2,18 МЕ. Все исследуемые нанопорошки вызывают уменьшение активности фермента и, по-видимому, являются его ингибиторами. По степени усиления ингибирующих свойств исследуемые нанопорошки располагаются в следующем порядке: медь < сплав ^ Zn Cu] < цинк < < железо.
Поступила в редакцию_
КФК является митохондриально-цитоплазмати-ческим ферментом, который функционирует в клетках многих тканей. Наибольшее содержание и активность КФК отмечается в миокарде и скелетных мышцах, более низкая концентрация - в почках, легких и печени. В контрольной группе активность КФК составила 1290,00±60,88 МЕ. В присутствии ВДП металлов активность КФК существенным образом увеличивается. При малых концентрациях наночастиц (0,05 мг/кг) наибольшее увеличение активности КФК выявлено для ВДП железа и меди. При концентрациях 1,25 и 2,5 мг/кг существенное увеличение активности КФК отмечено для ВДП железа и цинка.
Для анализа действия ВДП металлов на поджелудочную железу использовали определение активности амилазы в сыворотке крови. В контрольной группе активность данного фермента колебалась в пределах 444,00±7,20 МЕ. Значительное увеличение активности амилазы выявлено только в экспериментах с нанопо-рошками меди (активность фермента возрастала на 15-35 %). Остальные наночастицы, напротив, вызывали снижение активности фермента, что может быть связано с развитием некротических изменений в поджелудочной железе под действием исследуемых на-нопорошков.
Анализ выявленных изменений позволил прийти к заключению, что введение масляных суспензий ВДП цинка оказалось наиболее щадящим для организма лабораторных животных. У них снизилась активность ЩФ и амилазы и увеличилась активность АлАТ и КФК. Введение ВДП меди, железа и сплава [Fe Zn Cu] вызывает значительные изменения активности ряда ферментов, при этом наиболее выраженным действием на ферментативную активность обладают практически равной степени ВДП меди и железа. Таким образом, полученные действия ВДП металлов на ферменты сыворотки крови лабораторных животных позволяют отнести данные нанопорошки к потенциально токсичным для организма при пероральном способе введения.
Литература
1. Глущенко Н.Н., Богословская О.А., Ольховская И.П. Физико-химические закономерности биологического действия высокодисперсных порошков металлов // Хим. физика. 2002. Т. 21, № 4. С. 79-85.
2. Современная наномедицина / А.П. Каплун [и др.] // Нанотехника. 2007. № 2. С. 3-8.
3. Звездина Н.Д., Мартынова Л.Е., Звездин К.А. Новые инструменты в медицине и биологии: использование магнитных наночастиц // Нанотехника. 2007. № 2. С. 33-42.
4. Назаренко Г.И., Кишкун А.А. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований. М., 2000. 544 с.
5. Luckey T.D., Venugopal B. Metal toxicity in mammals. London, 1977. Vol. 1. 237 р.
6. Лабораторные методы исследования в клинике / В.В. Меньшиков [и др.]. М., 1997. 386 c.
18 февраля 2009 г.
