CC BY
27
УДК 577.118:577.-022.532]-092.9(0433)
ВЛИЯНИЕ НАНОЧАСТИЦ ПРОИЗВОДНЫХ ФУЛЛЕРЕНА С60 НА ФЕРМЕНТЫ СЫВОРОТКИ КРОВИ МЫШЕЙ
© 2008 г. Ю.С. Дудакова1, В.Б. Бородулин1, Н.Ю. Логинова1, И.А. Горошинская2, Е.В. Бобылева1, И.В. Бабушкина1
1Саратовский государственный медицинский университет, 410012, г. Саратов, ул. Б. Казачья, 112, meduniv@sgmu.ru
2 Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, 344037, г. Ростов-на-Дону, ул. 14 линия, 63, rnioi@list.ru
1Saratov State Medical University, 410012, Saratov, B.Kazach 'ia St., 112, meduniv@sgmu.ru
2 Rostov Oncology Research and
Development Institute, 344037, Rostov-on-Don, 14-line, 63, rnioi@list.ru
Исследована активность трансаминаз, у-глутамилтрансферазы, щелочной фосфатазы, креатинкиназы и лактатдегидроге-назы в сыворотке крови мышей, которым вводили водорастворимый комплекс поливинилпирролидона с фуллереном Сю (ПВП*С60) или один из двух фуллеренпирролидинов (соединение 1 и 2). Анализ полученных данных показал, что введение комплекса ПВП*С60 оказалось наиболее щадящим для организма животных, в то время как соединения 1 и 2 оказывают дестабилизирующее действие на мембранные структуры клеток печени и, возможно, некоторых других органов, но не сердца.
Ключевые слова: наночастицы, производные фуллерена С60, сывороточные ферменты.
The influence of three derivatives of fullerene C60—fullerenepyrrolidines on activity of main serum enzymes in blood of mice was studied. The complex ofpolyvinilpyrrolidon with fullerene C60 does not change the activity of enzymes greatly. Other derivatives of fullerene C60 cause increase of most of studied enzymes.
Keywords: nanoparticles, derivatives of fullerene C60, serum enzymes.
В настоящее время большое внимание уделяется синтезу физиологически активных производных фул-леренов. Среди уже созданных имеются красители, соединения, обладающие различными оптическими, электрофизическими и биологическими свойствами, позволяющими предполагать перспективность их применения в медицине [1-3].
Установив в предшествующих исследованиях существенное влияние наночастиц производных фуллерена С60 на содержание белка, азотистых продуктов белкового метаболизма и наиболее распространенные в клинической биохимии показатели углеводного и жирового метаболизма [4], а также на морфологические параметры внутренних органов мышей, данную работу посвятили изучению эффектов введения жи-
вотным производных фуллерена С60 на ферменты сыворотки крови. Для исследования были выбраны ферменты, локализованные в разных органах, по активности которых в сыворотке крови принято судить о состоянии клеток этих органов. Оценивали активность трансаминаз (аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ)), креатинкиназы (КК), у-глутамилтрансферазы (ГГТ), щелочной фос-фатазы (ЩФ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ).
Активность трансаминаз, являющихся внутриклеточными ферментами с наибольшей удельной активностью в печени, принято использовать в первую очередь как тест на изменение проницаемости клеточных мембран гепатоцитов. Поскольку уровень АЛТ высок также в почках и поджелудочной железе, а АСТ присутствует в значительных концентрациях в сердце, по активности данных ферментов в сыворотке можно судить и о состоянии клеток этих органов. Экскреторные ферменты ГГТ и ЩФ, располагающиеся на наружной поверхности клеточных мембран, предположительно связывают молекулы веществ, которые необходимо экскретировать, и, учитывая преимущественную локализацию этих ферментов, могут использоваться как высокочувствительные индикаторы при нарушении функции печени (например, при токсическом гепатите, холестазе), а также почек. Наибольшее содержание КК наблюдается в скелетных мышцах и миокарде. В легких, почках и печени ее концентрация более чем в 100 раз ниже, чем в скелетных мышцах, и в среднем в 20 раз ниже, чем в сердце, что обусловило преимущественное использование этого фермента в диагностике инфаркта миокарда. ЛДГ присутствует в разных тканях (значительно различающихся по ее изоферментному составу) и, будучи одним из центральных ферментов углеводного обмена, является важным биохимическим показателем метаболизма, позволяющим судить о степени выраженности внутритканевой гипоксии [5].
Оценивали влияние на активность вышеперечисленных ферментов трех производных фуллерена С60: водорастворимого комплекса поливинилпирролидона с фул-лереном С60 (ПВП*С60) и двух фуллеренпирролидинов ^метил-1(4-диметиламинофенил)фуллерено-С60-[^^пирролидина (соединение 1) и ^метил-1(4-нитрофенил) фуллереноС60[1,9c] пирролидина (соединение 2). В качестве растворителя для фуллеренпирроли-динов использовался диметилсульфооксид (ДМСО).
Работа выполнена на белых беспородных трехмесячных самцах мышей, содержавшихся на стандартном рационе вивария. Мышей распределили в 5 экспериментальных групп. 1-й перорально вводился комплекс ПВП*С60; 2-й - соединение 1; 3-й - соединение 2; 4-й - ДМСО (контроль для фуллеренпирролидинов). 5-я служила контролем по отношению ко всем исследуемым соединениям и не подвергалась воздействию исследуемых веществ. Суточная доза вводимых веществ составляла 1-10-2 мг на 20 г массы мыши. Соединения вводились в виде раствора (100 мкл) в течение 5 дней. По окончании проведения эксперимента мышей декапитировали.
В клинико-лабораторных исследованиях анализировалась сыворотка крови. Для этого в ходе процедуры декапитации собиралась смешанная кровь с горло-
вого среза в сухую чистую пробирку без использования антикоагулянтов. Для ускоренного образования кровяного тромба пробирку со смешанной кровью помещали на 10 мин в термостат с температурой 37 0С. Затем, используя тонкую стеклянную палочку, тромб аккуратно отделяли от стенок пробирки. После этого пробирку помещали в центрифугу и центрифугировали 10 мин. Полученную сыворотку переносили в сухую чистую пробирку.
Оценка влияния комплекса ПВП*Сбо и фуллеренпирролидинов на обменные процессы, происходящие в организме, была проведена на основе данных, полученных в ходе биохимического исследования сыворотки крови на биохимическом анализаторе «Hospitex screen master» (Швейцария).
В работе были использованы жидкие реагенты производства «Витал Диагностикс СПб», предназначенные для определения одного из изучаемых ферментов в сыворотке крови: АЛТ, АСТ, КК, ГГТ, ЩФ, ЛДГ. Все методы являются унифицированными [6].
Цифровые данные обработаны статистически по методу Стьюдента с определением достоверности различий между контрольной и опытными группами. Достоверными считались различия между группами при р<0,05.
Результаты исследований
Результаты биохимического анализа отражены в таблице.
По активности трансаминаз в сыворотке крови можно судить о влиянии соединений фуллерена С6о на состояние ряда органов. Активность АЛТ отражает в большей степени состояние ткани печени, почек, поджелудочной железы, активность АСТ - главным образом печени и сердца.
В контрольной группе животных активность АЛТ в сыворотке крови составила 431,98±29,14 ед/л (100 %). Комплекс ПВП*С60 вызывал значительное уменьшение активности АЛТ с высокой степенью достоверности (р<0,001). Так, активность АЛТ в сыворотке крови после введения животным ПВП*С60 составила 50,3 % по сравнению с контролем, что может быть связано с ингибирующим влиянием фулле-рена С60, входящего в состав комплекса.
Соединение 1 выступает активатором АЛТ, так как в его присутствии активность фермента возрастает на 37,9 %. Соединение 2, напротив, выступает ингибитором, снижая активность фермента почти вдвое как относительно контроля, так и группы животных с введением ДМСО. В связи с тем, что ДМСО, который используется как растворитель для фуллеренпирроли-динов, не оказал влияния на активность фермента (она составила 434,76±17,17 ед/л), выявленное изменение активности можно связать с непосредственным влиянием исследуемых фуллеренпирролидинов.
Так как высокая активность АЛТ наблюдается в тканях печени, почек, скелетных мышц, миокарда и поджелудочной железы, то определение активности этого фермента является наиболее общим тестом для определения проницаемости мембран клеток целого ряда органов.
Полученные данные по активности АЛТ свидетельствуют о том, что только под влиянием соединения 1 наблюдается выраженный эффект увеличения
проницаемости мембран. Комплекс ПВП*С60 и соединение 2 напротив препятствуют выходу фермента из клеток.
В контрольной группе животных активность АСТ составила 512,32±20,63 ед/л. В процессе исследований выявлено, что ПВП*С60 вызывает гипоферменте-мию: активность фермента в присутствии ПВП*С60 составляет 81,2 % по сравнению с контролем.
ДМСО, соединение 1 и соединение 2 существенного воздействия на активность АСТ не оказывают. Активность этого фермента в сыворотке крови составила 511,12±13,27 ед/л при введении соединения 1, 533,00±27,49 ед/л - при введении соединения 2, 466,44±25,01 ед/л - при введении ДМСО.
КК, как и АСТ, является билокулярным митохонд-риально-цитоплазматическим ферментом, который функционирует в клетках многих тканей. Наибольшее содержание КК отмечается в миокарде и скелетных мышцах, более низкая концентрация наблюдается в почках, легких и печени.
В контрольной группе животных активность КК составила 587,74±13,05 ед/л. Комплекс ПВП*С60 проявил ингибирующий эффект на активность КК. В сыворотке крови животных, которым вводился ПВП*С60, активность составила 96,2 % в сравнении с контролем.
В присутствии фуллеренпирролидинов наблюдается другая закономерность. Введение ДМСО оказало гипо-ферментемический эффект, активность КК составила 509,40±14,95 ед/л (86,7 % от контроля). Напротив, фул-леренпирролидины вызвали небольшое увеличение активности фермента, достоверное только по сравнению с ДМСО. Активность КК у животных, которым вводилось соединение 1, составила 618,38±12,25 ед/л (105,2 % - по сравнению с контролем, 121,4 % - по сравнению с ДМСО). У животных, которым вводилось соединение 2, активность КК равна 601,66±16,16 ед/л (102,4 % - по сравнению с контролем, 118,1 % - с ДМСО).
В процессе исследований также проанализировано действие производных фуллерена на активность ГГТ, высокая активность которой наблюдается в тканях почек, печени и поджелудочной железы. ГГТ содержится в основном в мембране клеток, обладающих высокой секреторной и адсорбционной активностью: эпителиальные клетки, выстилающие желчные пути, печеночные канальцы, панкреатическая экзокринная ткань и выводные протоки. В порядке снижения удельной активности ГГТ ткани располагаются в следующей последовательности: почки, печень, поджелудочная железа, щелочная кайма клеток тонкого кишечника. Активность ГГТ не обнаружена в скелетных мышцах и миокарде. В контрольной группе животных активность ГГТ составила 103,22±16,66 ед/л. Все исследуемые соединения вызвали увеличение активности ГГТ в разной степени. Наибольшее увеличение активности ГГТ наблюдалось в сыворотке крови мышей, которым вводились фуллеренпирролидины.
Активность ГГТ под влиянием соединения 1 составила: 554,60±15,90 ед/л (537,3 % - по сравнению с контролем и 231,1 % - по сравнению с ДМСО). При введении соединения 2 активность фермента составила 308,46±11,68 ед/л (298,8 % - по отношению к контролю и 128,5 % - по отношению к ДМСО). Введение мышам ДМСО также способствовало увеличению активности ГГТ, которая в данном случае - 240,00±18,67 ед/л (232,5 % по сравнению с контролем).
ЩФ проявляет высокую удельную активность в клетках эпителия почечных канальцев, гепатоцитах и остеобластов. Этот фермент локализуется в плазматической мембране, является эктоэнзимом.
Исследование активности ЩФ широко используют в клинической биохимии для диагностики патологии гепатобилиарной системы и костной ткани. Активность ЩФ часто повышена при обструктивных заболеваниях печени, холестазе, гепатите, явлениях гепа-тотоксичности.
Влияние исследуемых соединений на активность ферментов в сыворотке крови мышей
Показатель Контроль ПВП*С60 ДМСО Соединение 1*ДМСО Соединение 2*ДМСО
M±m M±m р M±m р M±m р р' M±m р р'
АЛТ, ед/л 431,98± ±29,14 217,38± ±7,66 <0,001 434,76± ±17,17 >0,05 595,80± ±8,03 <0,001 <0,001 229,14± ±15,41 <0,001 <0,001
АСТ, ед/л 512,32± ±20,63 416,16± ±15,01 <0,01 466,44± ±25,01 >0,05 511,12± ±13,27 >0,05 >0,05 533,00± ±27,49 >0,05 >0,05
КК, ед/л 587,74± ±13,05 565,58± ±14,88 >0,05 509,40± ±14,95 <0,001 618,38± ±12,25 >0,05 <0,001 601,66± ±16,16 >0,05 <0,001
ГГТ, ед/л 103,22± ±16,66 122,56± ±7,56 >0,05 240,00± ±18,67 <0,001 554,60± ±15,90 <0,001 <0,001 308,46± ±11,68 <0,001 <0,05
ЩФ, ед/л 381,54± ±7,03 380,78± ±8,90 >0,05 360,20± ±8,27 >0,05 446,50± ±16,54 <0,01 <0,01 562,92± ±12,70 <0,001 <0,001
ЛДГ, ед/л 2025,25± ±153,28 1892,00± ±225,60 >0,05 3046,00± ±157,69 <0,01 1173,20± ±48,20 <0,01 <0,001 1298,00± ±49,50 <0,01 <0,001
АСТ/АЛТ 1,186 1,914 1,073 0,858 2,326
ГГТ/АСТ 0,201 0,295 0,515 1,085 0,579
ЛДГ/АСТ 3,953 4,546 6,53 2,295 2,435
Примечание. Уровень вероятности различий в сравнении: р -с контролем; р'- с ДМСО.
В контрольной группе животных активность этого фермента составила 381,54±7,03 ед/л. Увеличение активности ЩФ наблюдается при введении фуллеренпирролидинов. При введении животным соединения 1 активность ЩФ - 446,50±16,54 ед/л (117,0 %), соединения 2 - 562,92±12,70 ед/л (147,5 %). Поскольку введение ДМСО не оказывало достоверного влияния на активность фермента, активирующим действием обладают сами фуллеренпирролидины.
Комплекс ПВП*Сбо не влиял на активность ЩФ (активность фермента составила 380,78±8,90 ед/л (99,8 %)).
Анализ влияния соединений фуллерена на активность ЛДГ показал, что существенного влияния по сравнению с контролем (активность равна 2025,25±153,28 ед/л) не оказал только комплекс ПВП*С60 (активность равна 1892,00±225,60 ед/л). Фуллеренпирролидины обладают выраженным ЛДГ-ингибирующим действием. Активность при введении этих веществ по сравнению с контролем (100 %) составляет 57,9 % для соединения 1 и 64,1 % - для соединения 2. ДМСО, напротив, оказывает гиперферментемиче-ский эффект с высокой степенью достоверности (активность ЛДГ равна 3046,00±157,69 ед/л). Поскольку ДМСО служит растворителем соединения 1 и соединения 2, производные фуллерена оказывают значительное ингибирующее влияние на активность ЛДГ.
Для более адекватной оценки изменений, происходящих под влиянием производных фуллерена, вычисляли соотношения, используемые в клинической биохимии, между некоторыми из изученных ферментов: АСТ/АЛТ (коэффициент де Ритиса), ГГТ/АСТ, ЛДГ/АСТ.
Из таблицы видно, что коэффициент АСТ/АЛТ возрастает при введении животным комплекса ПВП*С60 на 61,4 %, соединения 2 - на 96,1 % за счет резкого снижения активности АЛТ. Под влиянием соединения 1 наблюдается снижение этого коэффициента на 27,7 % за счет увеличения активности АЛТ при неизменной АСТ. Поскольку при значении коэффициента де Ритиса > 1 изменения в печени трактуются как происходящие по некротическому типу, а при < 1 - по воспалительному типу [5], можно думать, что введение животным комплекса ПВП*С60 и особенно соединения 2, стимулирующее почти двукратное увеличение коэффициента АСТ/АЛТ, вызывает некротические изменения в печени, тогда как при соединении 1 изменения выражены в значительно меньшей степени и имеют воспалительный характер.
Вычисление коэффициента ГГТ/АСТ показало, что для соединения 1 характерно выраженное преимущественное увеличение активности ГГТ, тогда как эффект соединения 2 на эти ферменты, по-видимому, в значительной степени определяется действием используемого растворителя.
Поступила в редакцию_
Расчет коэффициента ЛДГ/АСТ подтвердил ЛДГ-ингибирующее действие обоих фуллеренпирролидинов, проявляемое ими, несмотря на то, что для использованного растворителя характерна активация ЛДГ.
Анализ выявленных изменений позволяет прийти к заключению, что введение комплекса ПВП*Сбо оказалось наиболее щадящим для организма животных. Под его влиянием наблюдается лишь двукратное снижение активности АЛТ и выраженное в меньшей степени ингибирование АСТ. Для изученных фуллеренпирролидинов характерно дестабилизирующее действие на мембранные структуры клеток, о чем свидетельствует увеличение в сыворотке крови уровня большинства ферментов (АЛТ, КК, ГГТ и ЩФ - под влиянием соединения 1; ГГТ и ЩФ - в случае соединения 2). Значительное увеличение ферментов холестаза (ГГТ и ЩФ) под влиянием обоих фуллеренпирролидинов позволяет предположить, что они нарушают отток желчи и способствуют развитию механической желтухи. Отсутствие увеличения в сыворотке крови активности АСТ, ЛДГ и КК свидетельствует о том, что все изученные производные фуллерена не влияют на состояние сердца. Это согласуется с полученными ранее морфологическими данными, выявившими изменения в размерах и консистенции печени, почек, поджелудочной железы и кишечника, но не сердца.
Таким образом, хотя фуллерен С60 является инертным соединением, его производные могут оказывать разнонаправленное влияние на функционирование органов и тканей, что требует тщательного и индивидуального подбора дозировок и учета возможности побочных эффектов при целенаправленном применении производных фуллерена.
Литература
1. Осипьян Ю.А., Кведер В.В. Фуллерены - новые вещества для современной техники // Материаловедение. 1997. № 1. С. 2-6.
2. Lu L.H. et al. The possible mechanisms of the antiproliferative effect of fullerenol, polyhydroxylated C60, on vascular smooth muscle sells // J. Pharmacol. 1998. Vol. 123. № 6. P. 1097-1102.
3. Трефилов В.И. и др. Фуллерены - основа материалов будущего. Киев, 2001.
4. Бородулин В.Б., Дудакова Ю.С. Влияние производных фуллерена С60 на обменные процессы мышей // Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине. Ростов н/Д, 10-12 октября 2007 г. Ростов н/Д, 2007. С. 8-9.
5. Добровольский А.П., Доценко В.Л., Панченко Е.П. Клиническая биохимия. М., 2002.
6. Меньшиков В.В. и др. Лабораторные методы исследования в клинике М., 1997.
11 декабря 2007 г.
