CC BY
7-Спецвыпуск № 1, 2015
УДК 619:578.842. 11:616-092+619:616.9:636.7
Плиска А. А., Аблов А. М., Анганова Е. В., Батомункуев А. С., Барышников П. И., Чхенкели В. А., Демина Т. В., Очирова Л. А.
Pliska A. A., Ablov A. M., Anganova E. V., Batomunkuev A. S., Baryshnikov P. I., Chkhenkeli V. A., Demina T. V., Ochirova L. A.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ СОБАК ПРИ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЯХ
THE BIOLOGICAL PROPERTIES OF THE MICROORGANISMS ISOLATED FROM THE DOGS AT INTESTINAL INFECTIONS
В статье представлены результаты изучения биологических свойств микроорганизмов, выделенных от собак при кишечных инфекциях бактериальной этиологии. Показано, что микроорганизмы, изолированные от больных собак, характеризуются большей внутрипопуляционной гетерогенностью по биохимическим свойствам по сравнению со штаммами, выделенными от здоровых собак. Установлено, что энтеробактерии, являющиеся возбудителям кишечных инфекций у собак, обладают фенотипическими маркерами патогенности (адгезивная, гемолитической ДНКазная, анти-лизоцимная, фосфатазная, протеолитическая активность), способствующими реализации их патогенного потенциала и обеспечивающими их участие на различных этапах инфекционного процесса. У штаммов, выделенных от больных собак, отмечается значимо более высокая биологическая активность и персистентный потенциал по сравнению с изолятами, полученными от здоровых животных ^<0,05). Энтеробактерии в микробных ассоциациях (по сравнению с монокультурами) характеризуются значимым увеличением частоты встречаемости признака персистенции, а также гемолитической, протеолитической активности, продукции ДНКазы и щелочной фосфатазы.
Ключевые слова: кишечные инфекции, собаки, бактерии, биологические свойства, патогенность, персистенция.
The results of the determination of phenotypic markers of pathogenic of bacteria isolated from dogs with intestinal infections of bacterial etiology are presented in the article. The microorganisms isolated from dogs with intestinal infections have higher intra-population heterogeneity on biochemical properties compared with strains isolated from healthy dogs. Enterobac-teriaceae which causes intestinal infections in dogs have phenotypic markers of pathogenicity: adhesive, hemolytic, DNase, antilysozymic, phosphatase, proteolytic activity. This helps to the realization of their pathogenic potential and provides participation at different stages of the infectious process. The strains isolated from sick dogs had higher biological activity and persistent potential compared with strains isolated from healthy dogs (p<0,05). Enterobacteriaceae in microbial associations (compared with monocultures) are characterized by a significant increase in the incidence of persistent trait, and hemolytic, proteolytic activity, production of DNase and alkaline phosphatase.
Keywords: intestinal infection, dogs, bacteria, biological properties, pathogenicity, persistence.
Плиска Анна Александровна -
кандидат ветеринарных наук,
ветеринарный врач-бактериолог
Иркутская межобластная ветеринарная лаборатория
Тел.: (3952) 38-91-09
Е-mail: pliska_a@mail.ru
Аблов Александр Михайлович -
заместитель директора
Иркутская межобластная ветеринарная лаборатория
Тел.: (3952) 38-91-09
E-mail: Imvl2004@vet.irkutsk.ru
Анганова Елена Витальевна -
доктор биологических наук, профессор кафедры
эпидемиологии и микробиологии
Иркутская государственная медицинская академия
последипломного образования; старший научный
сотрудник лаборатории эпидемиологически
и социально значимых инфекций
Научный центр проблем здоровья семьи
и репродукции человека
Тел.: (3952) 33-34-25
Е-mail: eva.irk@mail.ru
Батомункуев Алдар Содномишиевич -
кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры специальных ветеринарных дисциплин Иркутская государственная сельскохозяйственная академия
Pliska Anna Anna Alexandrovna -
Ph.D. of Veterinary Sciences, veterinary bacteriologist Irkutsk Interregional Veterinary Laboratory Tel.: (3952) 38-91-09 Е-mail: pliska_a@mail.ru
Ablov Alexander Mikhaylovich -
Deputy Director
Irkutsk Interregional Veterinary Laboratory
Tel.: (3952) 38-91-09
E-mail: Imvl2004@vet.irkutsk.ru
Anganova Elena Vitalievna -
Doctor of Biological Sciences,
Professor of the Department
of Epidemiology and microbiology
Irkutsk State Medical Асademy
of Postgraduate Education; senior researcher
of laboratory of Epidemical and Social Important
Infections Scientific Centre for Family Health
and Human Reproduction Problems
Tel.: (3952) 33-34-25
Е-mail: eva.irk@mail.ru
Batomunkuev Aldar Sodnomishievich -
Ph.D. of Veterinary Sciences, Docent of the Department of special veterinary disciplines Irkutsk State Agricultural Academy
80
,,„ „„„„, Jj Ставрополья
научно-практическии журнал
Тел. и факс: (3952) 29-09-75 Е-mail: batomunkuev.irk@mail.ru
Барышников Петр Иванович -
доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии, эпизоотологии, паразитологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Алтайский государственный аграрный университет, г. Барнаул Тел.: (3852) 31-39-70 Е-mail: ivm@asau.ru
Демина Татьяна Васильевна -
доктор биологических наук, профессор кафедры технологии производства и переработки сельскохозяйственной продукции и ветеринарно-санитарной экспертизы Иркутская государственная сельскохозяйственная академия Тел. и факс: (3952) 29-09-75 E-mail: demina2006@mail.ru
Очирова Луиза Андреевна -
кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры технологии производства и переработки сельскохозяйственной продукции и ветеринарно-санитарной экспертизы Иркутская государственная сельскохозяйственная академия Тел. и факс: (3952) 29-09-75
Tel. and fax: (3952) 29-09-75 Е-mail: batomunkuev.irk@mail.ru
Baryshnikov Peter Ivanovich -
Doctor of Veterinary Sciences, Professor, Head of the Department Microbiology, epizootiology, parasitology and veterinary sanitary examination Altai State
Agrarian University, Barnaul Tel.: (3852) 31-39-70 Е-mail: ivm@asau.ru
Chkhenkeli Vera Alexandrovna -
Doctor of Biological Sciences, Professor, Head of the Department Anatomy, physiology and microbiology Irkutsk State Agricultural Academy Tel. and fax: (3952) 29-09-75 E-mail: chrhenkeli@rambler.ru
Demina Tatyana Vasiljevna -
Doctor of Biological Sciences, Professor of technology of production and processing of agricultural products and veterinary-sanitary examination Irkutsk State Agricultural Academy Tel. and fax: (3952) 29-09-75 E-mail: demina2006@mail.ru
Ochirova Louise Andrejevna -
candidate of veterinary sciences,
docent of technology of production
and processing of agricultural products
and veterinary-sanitary examination
Irkutsk State
Agricultural Academy
Tel. and fax: (3952) 29-09-75
Чхенкели Вера Александровна -
доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой анатомии, физиологии и микробиологии Иркутская государственная сельскохозяйственная академия Тел. и факс: (3952) 29-09-75 E-mail: chrhenkeli@rambler.ru
Современный уровень изучения биологических свойств микроорганизмов показывает, что количественный показатель не всегда определяет способность изолята вызывать заболевание, которое в большей степени связано с реализацией патогенного потенциала возбудителя [1, с. 535]. Для каждого вида возбудителей характерен комплекс маркеров пато-генности, благодаря которым осуществляется развитие инфекционного процесса. Пусковым этапом развития инфекционного процесса является адгезивность [2, с.104]. Гемолитическая активность, наряду с другими факторами патогенности, может быть использована для выявления этиологической значимости бактерий в инфекционной патологии [3, с. 73]. Фосфатазная активность способствует увеличению проницаемости клеточных мембран, ДНКазная активность - повреждению структуры нуклеиновых кислот [4, с. 14]. Факторы пер-систенции (в частности, антилизоцимная активность) увеличивают биологический потенциал бактериальной клетки и способствуют выживанию бактерий в макроорганизме [5, с. 4]. Вопросы персистенции бактерий в организме хозяина приобретают особое значение для изучения патогенеза различных инфекций.
В настоящее время в связи с увеличением значимости ассоциированных инфекций [6, с. 77; 8, с. 26], возрос интерес к изучению свойств микроорганизмов в микробных ассоциациях.
Материалом для исследования служили смывы с прямой кишки, полученные от собак, поступивших на лечение в факультетский клинико-экспериментальный отдел «Айболит» Иркутской государственной сельскохозяйственной академии, а также от здоровых собак, содержащихся в питомниках К-9 и МВД (г Иркутск) за период 2009-2011 гг. Исследования по выделению, идентификации полученных микроорганизмов, определении их биологических свойств выполняли на базе бактериологического отдела Иркутской межобластной ветеринарной лаборатории по общепринятым методикам; определение биохимических свойств микроорганизмов проводили с помощью тест-систем для биохимической идентификации ПБДЭ и фирмы Lachema (Чехия). Вирусные инфекционные болезни собак исключали в соответствии с «Инструкцией по применению набора для выявления антигена вируса чумы собак иммуноферментным анализом (ИФА)» и «Инструкцией по применению набора для выявления антигенов парвовируса собак, вирусов энтерита норок и панлейкопении кошек иммуноферментным анализом (ИФА)». Определение адгезивной, гемолитической,
естник АПК
Ставрополья
протеолитической, ДНКазной, фосфатазной и антилизоцимной активности микроорганизмов проводили с использованием стандартных методов [7].
Вирулентность микроорганизмов оценивали in vivo методом биопроб (с использованием трех лабораторных животных для каждой бактериальной культуры; время наблюдения - 6, 24, 48, 72 часа и 10 суток) согласно «Методическим указаниям по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробакте-риями» № 13-7-2/1759 от 11 .10.1999 г Эксперименты проводили на беспородных белых мышах в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными МЗ СССР (1977) и «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1986).
Всего обследовано 43 собаки, в т.ч. с коли-бактериозами (опытная группа) - 27, здоровые животные (контрольная группа) - 16. Выделено 80 культур, в т.ч. от животных опытной группы -43, контрольной группы - 37 изолятов. У выделенных штаммов энтеробактерий (диарееген-ные и непатогенные E.coli, условно-патогенные энтеробактерии) определяли наличие факторов патогенности и тестировали на вирулентность. Выделенные стафилококки только тестировали in vivo методом биопроб.
При статистической обработке материалов при сравнении попарно связанных выборок использовали критерий знаков.
Оценка биохимических свойств представителей семейства Enterobacteriaceaе, выделенных от собак, позволила установить, что энтеробак-терии проявили биохимические свойства, типичные для бактерий данного семейства. Вместе с тем непатогенные E.coli, выделенные от здоровых собак, проявили меньшую гетерогенность по биохимическим свойствам по сравнению с патогенными E.coli, у которых установлены разные варианты подвижности, ферментации сахарозы и образования орнитиндекарбоксилазы. Кроме того, выявлены различия по ряду биохимических характеристик E.coli опытной и контрольной групп. Так, патогенные E.coli в большинстве случаев (90,5 %) ферментировали сахарозу и обладали подвижностью в отличие от непатогенных штаммов, которые данными свойствами не обладали. Напротив, кишечные палочки, выделенные от здоровых собак, чаще характеризовались наличием орнитиндекарбоксилазы (100,0 и 71,4 % соответственно). Также следует отметить, что представители рода Staphylococcus - S.aureus, выделенные из прямой кишки больных животных, оказались более вариабельными по биохимическим свойствам по сравнению со штаммами S.aureus, полученными от здоровых животных.
Изучение распространенности фенотипиче-ских маркеров патогенности у энтеробактерий, выделенных от здоровых и больных животных,
показало, что энтеробактерии, выделенные от собак с кишечными инфекциями, характеризовались значимо более высоким патогенным потенциалом по сравнению с изолятами, полученными от здоровых животных. Установлено, что 63,3 % возбудителей кишечных инфекций у собак обладали протеолитической активностью, 40,0 % штаммов характеризовались продукцией ДНКазы, третья часть - продуцировала щелочную фосфатазу и обладала антилизоцимной и адгезивной активностью; у каждого десятого штамма отмечалась гемолитическая активность.
Проведенные исследования выявили, что эн-теробактерии, выделенные от здоровых собак, по критерию знаков значимо реже (p<0,05) проявляли фенотипические признаки патогенно-сти по сравнению со штаммами, полученными от больных собак. Так, среди энтеробактерий, выделенных от собак контрольной группы, почти в два раза реже встречалась гемолитическая (5,6 и 10,0 % соответственно), антилизоцимная активность (16,7 % и 30,0 % соответственно) и продукция ДНКазы (16,7 и 40,0 % соответственно), а также была более низкая частота встречаемости таких маркеров, как продукция фосфата-зы,адгезивная и протеолитическая активность.
Указанная закономерность выявлена как в отношении эшерихий, так и в отношении условно-патогенных энтеробактерий. Так, сравнение распространенности фенотипических признаков биологической активности у непатогенных (от здоровых собак) и патогенных (от больных собак) штаммов E.coli показало, что непатогенные кишечные палочки в 1, 2 раза реже продуцировали щелочную фосфатазу и характеризовались протеолитической активностью, среди них в 3,1 раза реже отмечалась продукция ДНКазы; кроме того, непатогенные штаммы кишечной палочки не обладали гемолитической активностью, данное свойство выявлено только у диа-реегенных штаммов E.coli.
Для условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от здоровых животных (Citrobacter, Proteus) по сравнению с возбудителями кишечных инфекций (Citrobacter, Enterobacter, Proteus) была характерна более низкая частота встречаемости гемолитической (25,0 и 28,6 % соответственно), ДНКазной (50,0 и 100,0 % соответственно) и протеолитической (50,0 и 87,5 % соответственно) активности. Кроме того, условно-патогенные изоляты от здоровых собак не проявили адгезивной и антилизоцимной активности. Данные маркеры были установлены только у условно-патогенных энтеробактерий -возбудителей кишечных инфекций у собак (28,6 и 57,1 % соответственно).
Патогенность на уровне фенотипа, выявленная у возбудителей кишечных инфекций, подтверждена в биопробах на лабораторных животных. Так, анализ вирулентности in vivo штаммов энтеробактерий, выделенных от здоровых собак, показал, что указанные изоляты (E.coli -
82
,,„ „„„„, Jj Ставрополья
научно-практическии журнал
14, Citrobacter - 1, Proteus - 3), в течение 10-дневного наблюдения не вызывали гибели лабораторных животных. В отличие от них, при тестировании 20 диареегенных штаммов E.coli и 4 штаммов энтеробактерий родов Citrobacter и Enterobacter, выделенных от собак с кишечными инфекциями, характеризующихся наличием фенотипических маркеров патогенности, наблюдалась гибель лабораторных животных в течение 24 часов.
При тестировании стафилококков (15 штаммов), выделенных от здоровых собак, в большинстве случаев (66,7 %) не отмечалось болезненного состояния и во всех случаях в течение 10 суток гибели лабораторных животных не наблюдалось. При тестировании стафилококков (S.aureus - 7, S.gallinarum - 1, S.intermedius - 1, S.lentus - 1), полученных в микробных ассоциациях от больных собак, во всех случаях у животных отмечалось болезненное состояние через 24 часа от момента наблюдения.
Анализ частоты встречаемости фенотипиче-ских факторов патогенности в микробных ассоциациях и в монокультурах, полученных от больных собак, показало, что у энтеробактерий в микробных ассоциациях встречаемость признака персистенции в 6 раз выше по сравнению с монокультурами (47,1 % и 7,7 % соответственно). Данное различие носило значимый характер (p<0,05). Кроме того, энтеробакте-рии, входящие в микробные ассоциации, характеризуются увеличением в 1,5 раза частоты встречаемости гемолитической активности (11,7 против 7,7 % в монокультуре) и продукции щелочной фосфатазы (35,3 против 23,1 % в монокультуре), в 1,3 раза - частоты встречаемости
Литература:
1. Егорова С. А. , Кафтырева С. А., Макарова М. А. Патогенный потенциал микроорганизмов рода Klebsiella как возбудителей острых кишечных инфекций / Вестник Российской военно-медицинской академии. Приложение 2 (22). 2008. С. 535-536.
2. Бондаренко В. М., Gang Wu, Barcus M. M. Адгезивная активность клинических штаммов клебсиелл // Журнал микробиологии, эпидемиологии, иммунологии. 1996. № 2. С.104-109.
3. Саляхов Р. З., Гибидуллина З. Г, Ахтарие-ва А. А. Гемолитическая активность клинических штаммов бактерий рода Serratia // Успехи современного естествознания. 2003. № 8. С. 73.
4. Анганова Е. В. Условно-патогенные эн-теробактерии: доминирующие популяции, биологические свойства, медико-экологическая значимость : автореф. дисс. ... доктора биологических наук. Иркутск, 2012. 46 с.
5. Бухарин О. В. Проблемы персистенции патогенов в инфектологии // Микробиология. 2006. № 4. С. 4-8.
протеолитической активности. Также микробные ассоциации энтеробактерий по сравнению с монокультурами обладают и более высокой ДНКазной активностью. В то же время энтеро-бактерии в монокультуре проявили более высокую адгезивную активность.
Таким образом, проведенные исследования показали, диареегенные E.coli, возбудители эшерихиозов у собак, характеризуются большей внутрипопуляционной гетерогенностью по биохимическим свойствам по сравнению с непатогенными штаммами кишечной палочки и отличаются от последних по ряду биохимических тестов. Аналогичная тенденция прослеживается и в отношении штаммов S.aureus, выделенных от собак опытной и контрольной групп.
Энтеробактерии, являющиеся возбудителями кишечных инфекций у собак, обладали фе-нотипическими маркерами (адгезивная, гемолитической ДНКазная, антилизоцимная, фосфатазная, протеолитическая активность), способствующими реализации их патогенного потенциала и обеспечивающими их участие на различных этапах инфекционного процесса. У штаммов, выделенных от больных собак, отмечается значимо более высокая биологическая активность и персистентный потенциал по сравнению со штаммами, полученными от собак контрольной группы (по критерию знаков, p<0,05).
Энтеробактерии в микробных ассоциациях (по сравнению с монокультурами) характеризовались более высокой частотой встречаемости признака персистенции, а также гемолитиче-ской,протеолитической активности, продукции ДНКазы и щелочной фосфатазы.
References:
1. Egorova S. A., Kaftyreva S. A., Makarov M. A. The pathogenic potential of the microorganisms of the genus Klebsiella as causative agents of acute intestinal infections // Bulletin of the Russian military medical akademii. Annex 2 (22). 2008. P. 535536.
2. Bondarenko V. M. Adhesive activity of clinical strains of Klebsiella / V. M. Bondarenko, Wu Gang, M. M. Barcus // Journal of Microbiology, Epidemiology, immunologii. 1996. № 2. P. 104-109.
3. Salyakhov R. Z. Hemolytic activity of clinical strains of bacteria of the genus Ser-ratia / R. Z. Salyakhov, Z. G. Gibidullina, A. A Ahtarieva // The successes of modern estestvoznaniya. 2003. № 8. P. 73.
4. Anganova E. V. Opportunistic enterobacteria: the dominant population, biological properties, health and environmental significance : author. dissertations.... dr. biol. science. Irkutsk, 2012. 46 p.
5. Bukharin O. V. Problems persistence of pathogens in infektologii // Mikrobiology. 2006. № 4. P. 4-8.
естник АПК
Ставрополья
6. Батомункуев А. С., Плиска А. А. Биохимическая активность микроорганизмов, выделенных от собак при кишечных микст- и моно-инфекциях бактериальной этиологии // Вестник Иркутской ГСХА. 2013. № 59. С. 77-83.
7. Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований : учеб. пособие / под. ред. А. С. Ла-бинской, Л. П. Блинковой, А. С. Ещиной. М. : Медицина, 2005. 600 с.
8. Микробиологические исследования при динамике экспериментального перитонита и при применении различных схем диализа / В. В. Слинько, А. Н. Квочко, М. Н. Веревкина, Е. В. Светлакова // Ветеринарная служба Ставрополья, 2006. № 4. С. 26-29.
Batomunkuev A. S., Pliska A. A. Biochemical activity of microorganisms isolated from dogs with intestinal mikst- and monoinfections of bacterial etiologii. Herald Irkutsk GSKHA. 2013. № 59. P. 77-83. Private medical microbiology techniques with microbiological studies : textbook / under. edit A. S. Labinskaya, L. P. Blinkovo, A. S. Eschinoy. M. : Medicine, 2005. 600 p.
