CC BY
44
УДК 579.6: 618.3-06 Ю.А. Новопашина, Е.П. Колеватых
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ДРОЖЖЕВЫХ ГРИБОВ, ВЕГЕТИРУЮЩИХ НА СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧКАХ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН
Кировская государственная медицинская академия (Киров, Россия)
Yu.A. Novopashina, Е.Р. Kolevatykh
BIOLOGICAL PROPERTIES OF YEASTS VEGETATING ON REPRODUCTIVE MUCOUS MEMBRANE OF PREGNANT FEMALES
Kirov State Medical Academy (Kirov, Russia)
В работе приведены материалы исследования таксономических, морфологических, культураль-ных свойств дрожжевых грибов, вегетирующих на слизистых оболочках репродуктивной системы женщин в период беременности. Изучались видовая принадлежность дрожжевых грибов рода Candida, гемолитическая активность, чувствительность к антимикотическим препаратам. Всего было обследовано 104 женщины в сроке гестации 31-33 недели: 60 человек с диагнозом вульвовагинальный кандидоз (ВВК) (первая группа) и 44 человека без заболеваний половых органов (вторая группа, группа сравнения). Взятие клинического материала осуществляли при осмотре врачом-гинекологом в асептических условиях стерильными инструментами в транспортные среды HiCulture™ Transport Swabs фирмы HiMedia. Использовали бактериоскопиче-ский, микологический, молекулярно-генетический (полимеразная цепная реакция, ПЦР) методы. Результаты исследования обрабатывали с помощью программы STATISTICA for Windows версия 6.1. Использовали непараметрические и параметрические методы анализа. Критерием статистической достоверности получаемых данных считали общепринятую в медицине величину p<0,05. Установлено преобладание дрожжевых грибов у пациентов первой группы по сравнению с представителями второй группы (96% и 27% соответственно, p<0,05). Среди штаммов, выделенных в монокультуре, наиболее часто обнаруживались виды Candida lipolitica (14±2,2%), Candida glabrata (13±1,9%), Candida krusei (12±1,8%); Candida albicans был выявлен в 7% случаев. При ВВК персистируют гемолитические формы C. glabrata, C. albicans, устойчивые к флю-коназолу, каспофунгину. Показатели низкой чувствительности возбудителей ВВК к антибиотикам необходимо учитывать при проведении антимико-тической терапии.
Ключевые слова: дрожжевые грибы, вульвовагинальный кандидоз, флюконазол, каспофунгин, по-лимеразная цепная реакция.
The article demonstrates detailed overview on the investigation of taxonomic, morphological, cultural properties of yeasts, vegetating on mucous membranes of female reproductive system during pregnancy. Yeast fungi Candida was examined to find out what species they could belong to. Moreover, their hemolytic activity and sensitivity to antifungal preparations were studied. 104 women on gestation period of 31-33 weeks were evaluated: 60 people with diagnosis of vulvovaginal candidiasis (VVC) (first group) and 44 people who didn't have diseases of the genital organs (the second group, the comparison group). Clinical sampling was carried out by a gynecologist in aseptic conditions with sterile instruments in transport system HiCulture ™ Transport Swabs (produced by HiMedia Company). Bacterioscopy, mycological and molecular genetic polymerase chain reaction (PCR) methods were used. The results of the investigations were processed with software STATISTICA ver. 6.1 for Windows. Both non-parametric and parametric analysis methods were used. The criterion for statistical significance of the data considered p<0.05 was used as the accepted value in medicine. The prevalence of yeasts in patients of the first group was found as compared with the second group (96% and 27%, respectively, p<0,05). Among the strains identified monoculturally, most frequently detected species proved Candida lipolitica (14±2,2%), Candida glabrata (13±1,9%), Candida krusei (12±1,8%); Candida albicans were detected in 7% of cases. The hemolytic form of C. glabrata, C. albicans which are resistant to fluconazole and caspofungin are prevalent among patients with VVC. Indicators of low sensitivity of VVC pathogens to antibiotics should be considered in antimycotic therapy.
Key words: yeast fungi, vulvovaginal candidiasis, fluconazole, caspofungin, polymerase chain reaction
Введение
За последние десятилетия микозы, обусловленные дрожжевыми грибами, стали важной клинической проблемой. Широкое распространение новых медицинских технологий (инвазивных диагностических и лечебных процедур, цитостатической и имму-носупрессивной терапии, трансплантации), пандемия ВИЧ-инфекции, успехи в лечении бактериальных инфекций привели к увеличению популяции имму-нокомпрометированных пациентов с высоким риском развития микозов [1, 2]. Стремительно возрастающая во всех странах, по данным Всемирной организации здравоохранения, распространенность грибов как возбудителей инфекций к началу XXI века превратилась в одну из трудно решаемых проблем. Это связано с высокой резистентностью грибов к нерационально используемым антибактериальным препаратам, с обильным загрязнением среды обитания химическими соединениями, радиоактивными отходами, способными вызывать у грибов мутационные изменения. В медицине в настоящее время ведущая роль принадлежит дрожжевым грибам Candida spp. [3].
Цель исследования: оценка видовой принадлежности и особенностей биологических свойств дрожжевых грибов в микробиоценозе нижних отделов половых путей при вульвовагинальном кандидозе (ВВК) у беременных.
Вятский медицинский вестник, № 3, 2015
Задачи: изучить качественный и количественный состав микроорганизмов, составляющий микро-биоту нижних отделов половых путей у беременных женщин; определить видовую принадлежность и особенности биологических свойств дрожжевых грибов среди возбудителей вульвовагинального кандидоза; установить чувствительность выделенных изолятов к антифунгальным препаратам in vitro.
Материалы и методы
Под наблюдением находилось 104 пациентки КОГБУЗ «Кировский областной клинический перинатальный центр» в сроке гестации 31-33 недели. Средний возраст беременных в обеих группах: 27±1,9 лет. После проведения комплексного клинико-микробиологического обследования, включающего общеклинические, лабораторные и культуральные исследования с определением качественного и количественного состава микрофлоры нижних отделов половых путей, все беременные были разделены на две группы в зависимости от результатов микробиологического скрининга. Основную группу (первая группа) составили 60 женщин с лабораторно-под-твержденной манифестацией кандидозной инфекции. В контрольную группу (вторая группа) вошли 44 женщины без заболеваний мочеполовой системы. В исследование не были включены беременные с оппортунистическим кандидозом на фоне заболеваний с иммунной недостаточностью.
Критериями диагностики вульвовагинального кандидоза считали наличие жалоб пациенток на зуд, жжение в области наружных половых органов и патологические выделения из половых путей, а также клинические симптомы заболевания: гиперемия слизистых оболочек вульвы и влагалища, сметанообраз-ные и творожистые выделения, лабораторное обнаружение дрожжевых грибов рода Candida во влагалище в титре не менее 104 КОЕ/мл, низкое содержание лак-тобактерий в составе микробных ассоциаций.
Материалом для микробиологических исследований являлись содержимое влагалища, мазки со слизистой оболочки влагалища и из цервикального канала шейки матки. Изоляты отбирали стерильными инструментами при асептических условиях врачом-гинекологом в транспортные среды HiCulture™ Transport Swabs фирмы HiMedia. Посев на питательные среды проводился не позднее чем через 2 часа после взятия клинических образцов.
Для выделения и первичной идентификации дрожжевых грибов производили посев на среду Са-буро и хромогенный агар (HiMedia), инкубировали при 36°С в течение 48 ч. Затем, отобрав отдельные колонии, суспендировали в физиологическом растворе и полученную массу наносили на агаровую среду с кукурузным настоем по методу Дальмау с использованием покровного стекла, помещали в термостат при температуре 20°С. После 48-часовой инкубации микроскопировали при увеличении ><200-*400, изучали образование псевдогиф, истинных гиф, артроко-нидий, бластоконидий. Гемолитическую активность выявляли при высеве колоний на кровяной агар. Использовали дифференциально-диагностический биохимический тест CandidaTest (Lachema, Чехия). Одновременно проводили молекулярно-генетиче-ские методы с использованием набора реагентов для выявления ДНК Candida albicans, Candida glabrata,
Candida krusei в клиническом материале методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией (АмплиСенс). Устанавливали чувствительность к антимикотическим препаратам: каспофунгину, флу-коназолу, вориконазолу, амфотерицину В микрометодом серийных разведений.
Количественные данные, имеющие показатели близкие к нормальному распределению, представлены в виде среднего арифметического и стандартного отклонения. Качественные данные описывались относительными величинами (%) в виде 95-% доверительных интервалов.
Для оценки статистической значимости различий выборочных количественных данных, в случае их близкого к нормальному распределению, использовался критерий Стьюдента; в случае отличного от нормального распределения применялись непараметрические методы статистического анализа (критерий Манна-Уитни).
Оценка статистической значимости различия выборочных относительных величин выполнялась с помощью критерия х2.
В качестве критического уровня статистической значимости (p) принято значение p<0,005.
Статистическая обработка выполнена с использованием программы STATISTICA for Windows версия 6.1.
Результаты исследования и их практическая значимость
У женщин с клинически и лабораторно подтвержденным диагнозом вульвовагинальный канди-доз отмечается снижение концентрации микроорганизмов родов Lactobacillus и Bifidobacterium (104 КОЕ/мл) в сравнении с контрольной группой (106 КОЕ/мл). В то же время установлено резкое увеличение титров дрожжевых грибов (106 КОЕ/мл) и микроорганизмов рода Staphylococcus sp. (105 КОЕ/мл) в 1 группе пациентов.
Дрожжевые грибы были выделены у 96% (p<0,05) пациентов первой группы. Наиболее часто вегетировали виды Candida lipolitica (14±2,2%), Candida glabrata (13±1,9%), Candida krusei (12±1,8%); Candida albicans и C. tropicalis (7%).
Среди пациентов с ВВК выявлена тенденция не только к увеличению титров условно-патогенных микроорганизмов, но и к увеличению общего количества высеваемых микроорганизмов, среди идентифицированных штаммов можно выделить: Porphyromonas spp., Fusobacterium spp.
Анализ чувствительности штаммов Candida spp. к противогрибковым препаратам: флюконазолу, каспофунгину, вориконазолу, амфотерицину В выявил значительный рост числа резистентных штаммов. Cреди видов С. glabrata, C. tropicalis, C. krusei 67% оказались устойчивы к действию флюконазо-ла. C. krusei устойчив к вориконазолу и флюконазо-лу в 100% в обеих группах. Выявлены резистовары к каспофунгину (7%). Сохраняется антифунгаль-ная активность вориконазола (80%) к С. albicans, C. lipolitica, С. tropicalis. C. krusei, C. glabrata проявили низкую чувствительность к полиенам (амфотерици-ну В) в обеих группах (табл.). Гемолитическая активность наиболее выражена у C. glabrata и С. albicans, изолированных от беременных 1 группы (28 и 42%; 0 и 13% соответственно).
Таблица
Частота персистенции резистентных штаммов дрожжевых грибов рода Candida (первая группа/вторая группа, %)
Дрожжевые грибы Частота персистенции резистентных штаммов дрожжевых грибов рода Candida (%)
Флюконазол Вориконазол Каспо< )унгин Амфоте эицин В
1 группа 2 группа 1 группа 2 группа 1 группа 2 группа 1 группа 2 группа
C. albicans 60 24 6 2 11 2 10 2
C. lipolitica 4 3 2 0 8 3 2 2
C. glabrata 67 3 77 40 6 0 78 72
C. krusei 100 100 100 100 7 3 95 70
С. tropicalis 67 3 6 0 7 2 13 10
Обсуждение результатов
Необходимо отметить, что у женщин первой группы отмечалось снижение концентрации микроорганизмов родов Lactobacillus и Bifidobacterium (104 КОЕ/мл) в сравнении с контрольной группой (106 КОЕ/мл). Как известно, микроорганизмы родов Lactobacillus и Bifidobacterium являются представителями нормофлоры, персистирующими на слизистых оболочках половых путей, за счет их жизнедеятельности обеспечивается образование слабокислой рН среды, которая создает неблагоприятные условия для роста и развития посторонней микрофлоры [3]. Дисбаланс в микросимбиоценозе приводит к замещению и изменению бактериального состава слизистых оболочек. Установлено резкое увеличение титров дрожжевых грибов (106 КОЕ/мл) и микроорганизмов рода Staphylococcus spp. (105 КОЕ/мл) в 1 группе пациентов.
Среди пациентов с ВВК выявлена тенденция не только к увеличению титров условно-патогенных микроорганизмов, но и к увеличению общего количества высеваемых микроорганизмов, среди идентифицированных штаммов можно выделить: Porphyromonas spp., Fusobakterium spp., которые являются возбудителями гнойно-воспалительных процессов.
Особый интерес для нашего исследования представляло определение видовой принадлежности дрожжевых грибов среди возбудителей вульвовагинального кандидоза. Дрожжевые грибы были выделены у 96% (p<0,05) пациентов первой группы. Наиболее часто ве-гетировали виды Candida lipolitica (14±2,2%), Candida glabrata (13±1,9%), Candida krusei (12±1,8%); Candida albicans и C. tropicalis (7%). Имеются сведения [4], что C. glabrata и C. krusei отличаются невысокой вирулентностью, однако им труднее противодействовать, так как C. krusei устойчив к азолам, а C. glabrata быстро приобретает резистентность к ним. Нами обнаружены факторы вирулентности в виде протеаз и фос-фолипаз среди видов C. glabrata и C. krusei в первой группе обследованных женщин. Исходы лечения при инфекциях, вызванных C. tropicalis и C. glabrata были неблагоприятными по сравнению с заболеваниями, обусловленными C. albicans.
Анализ чувствительности штаммов Candida spp. к противогрибковым препаратам: флюконазолу, каспофунгину, вориконазолу, амфотерицину В выявил значительное преобладение числа резистентных штаммов. Среди видов С. glabrata, C. tropicalis, 67% оказались устойчивы к действию флюконазола. Выявлены резистовары к каспофунгину (7%). Сохраняется антифунгальная активность вориконазола (80%) к С. albicans, C. lipolitica, С. tropicalis. C. krusei,
C. glabrata проявили низкую чувствительность к по-лиенам (амфотерицину В) в обеих группах.
Литературные данные свидетельствуют об увеличении числа анемий среди беременных женщин, вероятно, это связано с тем, что микроорганизмы синтезируют гемолизины, разрушающие эритроциты. Гемолитическая активность наиболее выражена у C. glabrata и С. albicans, изолированных от беременных 1 группы (28 и 42%; 0 и 13% соответственно).
Заключение
Таким образом, эффективность лечения ВВК во многом определяется точной идентификацией возбудителя и назначением этиотропной терапии. Обнаружение, при видовой идентификации возбудителей вульвовагинальных кандидозов, представителей рода Candida, особенно штаммов С. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, требует обязательной оценки их чувствительности к антимикотическим препаратам. Комплексные методы микробиологического анализа могут прогнозировать успешное лечение, предупредить переход в хроническую форму, сократить рост частоты рецидивов заболевания.
Список литературы
1. Блинов Д.В. Вагинальные инфекции - от диагностики к рациональной комплексной терапии // Акушерство, гинекология и репродукция. 2011. № 4. С. 44-47.
2. Махновец Е.Н. Современные представления о вульвовагинальном кандидозе и его терапия // Клиническая дерматология и венерология. 2013. № 1. С. 9-14.
3. Меджидова М.К., Донников А.Е., Балушкина А.А., Тютюнник В. Л. Микробиоценоз влагалища и его особенности у беременных перед родами // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2012. 11 (2). С. 38-46.
4. Price M.F., LaRocco M.T., Gentry L.O. Fluconazole susceptibilities of Candida species and distribution of species recovered from blood cultures over a 5-year period. Antimicrob Agents Chemother 2014; 38:1422-1424.
Сведения об авторах
Новопашина Юлия Андреевна - аспирант кафедры микробиологии и вирусологии Кировской ГМА. E-mail: [email protected].
Колеватых Екатерина Петровна - к.м.н., доцент, заведующая кафедрой микробиологии и вирусологии Кировской ГМА. E-mail: [email protected]; [email protected].
