CC BY
40
Медицинская иммунология 2012, Т. 14, № 1-2, стр. 33-42 © 2012, СПб РО РААКИ
Обзоры
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ВИРУСА НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ,
связывающего фактор некроза опухолей
Орловская И.А.1, Цырендоржиев Д.Д.1, Топоркова Л.Б.1, Курилин В.В.1, Лопатникова Ю.А.1, Вязовая Е. А.1, Гилева И.П.2, Щелкунов С.Н.2, Сенников С.В.1
1 НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск
2 ФБУНГНЦВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово, Новосибирская область
Резюме. В настоящем обзоре собственных экспериментальных данныъх приведены результаты изучения in vivo и in vitro эффектов TNF-связывающего белка вируса натуральной оспы (VARV-CrmB) на TNF-зависимые изменения функциональной активности мышиных и человеческих клеток. In vitro VARV-CrmB отменяет вызываемую TNF повышенную продукцию IL-1 в и IL-6 моно-нуклеарными клетками человека и их повышенную окислительно-метаболическую активность. Рекомбинантный белок VARV-CrmB восстанавливает TNF-индуцированное снижение количества эритроидных колоний и оказывает корригирующие эффекты на колониеобразующую активность ГМ-предшественников мыши и человека. In vivo белок VARV-CrmB оказывает выраженный лечебный эффект на проявления LPS-индуцированного эндотоксического шока у SPF мышей Balb/C, достоверно увеличивая процент выживших животных. Белок VARV-CrmB уменьшает выраженность коллаген-индуцированного артрита на ранних сроках его формирования. Аппликативное воздействие белка VARV-CrmB нормализует TNF-индуцированное повышение миграционной и окислительно-метаболической активности лейкоцитов мышей и оказывает корригирующие эффекты на колониеобразующую активность гемопоэтических предшественников. Аппликативное воздействие VARV-CrmB снижает миграцию лейкоцитов из кожного лоскута в афферентной фазе контактной реакции на ДНХБ и показатель «отека уха» в эфферентной фазе контактной реакции на ДНХБ. Полученные результаты демонстрируют TNF-блокирующие свойства белкаVARV-CrmB. Совокупность полученных нами данных позволяет рассматривать рекомбинантный вирусный белок VARV-CrmB как новый потенциальный TNF-антагонист, эффекты которого могут быть реализованы за счет его нейтрализующей способности TNF-индуцированной активации окислительно-метаболической, цитокин-продуцирующей и миграционной функций эффекторных клеток при терапии патологических воспалительных процессов.
Ключевые слова: TNF, TNF-связывающий белок, контактный дерматит, коллаген-индуцированный артрит.
Orlovskaya I.A., Tsyrendorzhiev D.D., Toporkova L.B., Kurilin V.V., Lopatnikova Y.A., Vyazovaya E.A.,
Адрес для переписки:
Орловская Ирина Анатольевна,
НИИКИ СО РАМН
630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14. Тел.: (913) 748-60-99.
E-mail: [email protected]
Gileva I.P., Schelkunov S.N., Sennikov S.V.
BIOLOGICAL EFFECTS OF TNF-BINDING VARIOLAVIRUS RECOMBINANT PROTEIN
Abstract. This review presents a summary of our data concerning in vivo and in vitro effects of recombinant TNF-binding protein from variola virus (VARV-CrmB) upon TNF-induced functional changes of
33
Орловская И.А. и др.
Медицинская Иммунология
human and murine cells. VARV-CrmB protein blocks TNF-induced production of IL-ip and IL-6 by human mononuclear cells, and their in vitro oxidation-related metabolic (OM) activity. VARV-CrmB protein restores TNF-induced reduction of BFU-E+CFU-E colony-forming activity and normalizes TNF-induced effects upon CFU-GM formation in a colony-forming model of human and murine bone morrow cells (BMC). VARV-CrmB protein displays a pronounced in vivo alleviation of LPS-induced endotoxic shock symptoms in SPF BALB/C mice thus significantly increasing survival of experimental animals. Moreover, VARV-CrmB protein decreases intensity of collagen-induced arthritis at early terms. Application of VARV-CrmB protein results in normalization of TNF-induced increase of migratory and OM activity of murine leukocytes, and exerts corrective effects upon colony-forming ability of murine hematopoietic precursors. Skin application of VARV-CrmB protein decreases leukocyte migration from a skin scrap in afferent phase of DNCB-induced contact reaction, as well as “ear oedema” index. Our results demonstrate TNF-blocking properties of VARV-CrmB protein. In summary, our data allow to consider a recombinant variola virus VARV-CrmB as a new potential TNF-antagonist. Its effects can be explained by its ability of neutralizing TNF-induced activation of oxidation-related metabolic, cytokine-producing and migratory functions of effector cells in therapy of
pathological inflammatory processes. (Med. Immunol.,
Keywords: TNF, TNF-bindingprotein, contact dermatitis, collagen
Введение
Особое внимание в развитии воспалительного процесса придается провоспалительным свойствам фактора некроза опухолей (TNF), которые имеют фундаментальное значение в патогенезе многих воспалительных заболеваний. Гиперпродукция TNF приводит к развитию хронических воспалительных заболеваний, в том числе аутоиммунной природы, таких как ревматоидный артрит, системная красная волчанка, псориаз, атопический дерматит и многие другие. Наиболее веские доказательства патогенетического значения TNF получены при ревматоидном артрите. Согласно современным представлениям, именно цитотоксическими эффектами TNF обусловлены основные проявления заболевания: хронический синовит, деструктивные поражения хряща и кости. Под действием TNF повышается функциональная активность нейтрофилов, в том числе мигрировавших в сустав с образованием активных форм кислорода и высвобождением лизосомальных ферментов, которые оказывают повреждающее действие на хрящевую и костную ткань.
В связи с этим, TNF в настоящее время рассматривается как основная мишень для разработки новых биомедицинских технологий лечения ревматоидного артрита и других воспалительных заболеваний. В качестве подходов к антицитоки-новой стратегии лечения этих заболеваний используют различные ингибиторы TNF на основе генно-инженерных продуктов. Используются или проходят апробацию антитела против TNF, растворимые рецепторы к TNF, аптамеры [17].
Эти подходы имеют свои достоинства и недостатки [19, 22, 26]. Необходимость расшире-
2012, vol. 14, N1-2, pp 33-42)
induced arthritis.
ния спектра анти-TNF препаратов обусловлена тем, что различные анти-TNF препараты обладают разной терапевтической эффективностью, обусловленной особенностями их биологических активностей: Etanercept — единственный из анти-TNF препаратов, способный связывать и нейтрализовывать лимфотоксин; Infliximab и Adalimumab, в отличие от Etanercept, способен фиксировать комплемент и, следовательно, приводить к лизису клеток, экспрессирующих мембраносвязанный TNF и т.д. Также следует отметить, что многие пациенты, страдающие ревматоидным артритом (или другим воспали-тельным/аутоиммунным заболеванием), оказываются чувствительными к одному анти-TNF препарату, но не к другим. Кроме того, в связи с иммуногенностью анти-TNF препаратов эффективность терапии может снижаться. При потере чувствительности к какому-либо анти-TNF препарату его можно заменить другим — есть сообщения, что применение Adalimumab у пациентов, потерявших чувствительность к Infliximab или Etanercept, оказывается эффективным. Хотя известные в настоящее время ингибиторы TNF продемонстрировали относительно высокую эффективность в процессе контролируемых исследований терапии ревматоидного артрита [15, 20], в реальной клинической практике около 30-40% пациентов рефрактерны к терапии этими препаратами, менее чем у половины из них удается достигнуть полной или частичной ремиссии, а около 1/3 — вынуждены прекращать лечение из-за развития вторичной неэффективности или побочных эффектов через 2-3 года терапии. Лечение известными в настоящее время ингибиторами TNF может сопровождаться развитием инфекционных осложнений, в первую
34
2012, Т. 14, № 1-2
Эффекты анти-TNFбелка ВНО
очередь туберкулезной инфекции. Длительное (3 года и более) лечение больных ревматоидным артритом моноклональными антителами к TNF (infliximab или adalimumab) вызывает также развитие псориаза у значительной части пациентов; причины и механизмы таких осложнений остаются невыясненными. Следовательно, существует необходимость создания препаратов нового типа, более безопасных и эффективно блокирующих активность TNF.
Известно, что ряд вирусов в ходе эволюции выработали специфические способы защиты от иммунной системы человека, заключающиеся в экспрессии вирусных белков, которые могут эффективно вмешиваться в иммунорегуляцию, блокируя биологическую активность некоторых иммунорегуляторов. В частности, ортопоксви-русы продуцируют белки, блокирующие активность TNF [12, 28]. В настоящее время эти вирусные белки рассматриваются как эффективный подход для разработки новых биомедицинских технологий защиты человека в качестве препаратов антицитокинового действия.
1. Физико-химические характеристики и сравнительная нейтрализующая активность TNF-блокирующего белка вируса натуральной оспы (vARv-crmB)
На базе ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» получены ба-куловирусы, продуцирующие рекомбинантный белок vTNFR вируса натуральной оспы — VARV-CrmB [3, 4] и разработан метод выделения этого белка [7]. При изучении его физико-химических свойств оказалось, что VARV-CrmB при синтезе в клетках насекомых формирует олигомерные формы. При фракционировании афинновыде-ленного VARV-CrmB в SDS-ПААГ в нередуцирующих условиях он детектируется окрашиванием красителем Кумасси R250, в основном как полипептид с молекулярной массой около 90 кДа, а в редуцирующих условиях — как 47 кДа. Результаты определения TNF-нейтрализующей активности культуральной среды после разрушения замораживанием-оттаиванием клеток насекомых линии Sf21, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом, показали, что такая активность связана с фракциями, содержащими высокомолекулярные белки. По-видимому, олигомерные формы VARV-CrmB достаточно лабильны, и применяемый способ выделения рекомбинантного белка позволяет сохранять в основном его более стабильные димерные формы. Также показано, что в клетках насекомых синтезируемый вирусный белок эффективно гликозилируется, что может положительно влиять на его стабильность при потенциальном терапевтическом использовании. Результаты проведенного иссле-
дования свидетельствуют, что рекомбинантный вирусный белок VARV-CrmB нейтрализует in vitro цитотоксическое действие hTNF, hLT и MuTNF. Эффективность нейтрализации hTNF соизмерима с активностью химерных клеточных рецепторов и моноклонального антитела mAb MAK195 [2, 5, 16].
2. Исследование влияния vARv-CrmB на функциональную активность клеток
2.1. Влияние varv-crmB на TNF-стимулированную продукцию цитокинов (IL-1 и IL-6) мононуклеарными клетками (МНК) здоровых доноров
Результаты исследования показали, что TNF в концентрации 2 нг/мл увеличивает продукцию IL-1 в и IL-6 в культуре МНК соответственно в 246,7 и 13,5 раза (р < 0,01). Воздействие VARV-CrmB (100 нг/мл) увеличивало концентрации IL-1p и IL-6 соответственно в 2,8 раза (р < 0,05) и 1,6 раза (р = 0,08) по сравнению с контролем (спонтанная продукция). В концентрации 10 нг/мл VARV-CrmB не вызывал значимых изменений содержания цитокинов. Различия в содержании IL-1 в в кондиционной среде культуры МНК при добавлении VARV-CrmB (100 нг/мл и 10 нг/мл) были достоверны.
ПолиAbXNF (1000 нг/мл, 100 нг/мл и 50 нг/мл) нейтрализовали TNF-индуцированную продукцию IL-1 в и IL-6; при максимальной концентрации антител уровень цитокинов был наименьшим.
Применение моноAbXNF в концентрации 100 нг/мл и 50 нг/мл не приводило к полной нейтрализации TNF-индуцированной продукции IL-1 в и IL-6. При соинкубации моноAbXNF в концентрации 100 нг/мл с TNF содержание IL-^ и IL-6 в культуре МНК уменьшалось в 93,3 и 8,9 раза (р < 0,05) соответственно. В концентрации 50 нг/мл моноAbXNF снижало TNF-индуцированную продукцию IL-1 в и IL-6 соответственно в 15,2 и 1,6 раза (р < 0,05).
В результате предварительной совместной инкубации TNF и белка VARV-CrmB в различных концентрациях (100 нг/мл и 10 нг/мл) полностью отменялись эффекты TNF на продукцию IL-1 в и IL-6 в культуре МНК, а концентрации цитокинов снижалась до уровня спонтанной продукции.
Следует отметить, что в концентрации 100 нг/мл эффекты моноAbXNF, полиAbXNF и белка VARV-CrmB на блокирование TNF-опосредованной продукции цитокинов в культуре МНК были сопоставимы и не имели достоверных различий. Наряду с этим только белок VARV-CrmB в более низкой концентрации (10 нг/мл) обладал полной нейтрализую-
35
Орловская И.А. и др.
Медицинская Иммунология
щей активностью на эффекты TNF, в отличие от моноAbTNF и поли^^р
Таким образом, белок VARV-CrmB обладает большей TNF-нейтрализующей способностью по сравнению с полиAbTNF и моноAbXNp
2.2. Влияние VARV-CrmB на окислительно-метаболическую активность мононуклеарных клеток
Регулирующее действие цитокинов при различных патологических состояниях, в том числе при воспалении, во многом реализуется через активацию наработки активных метаболитов кислорода (АМК). Известно, что TNF, взаимодействуя с клеточными рецепторами TNFRI (p55) и TNFRII (p75), модулирует окислительный метаболизм фагоцитирующих клеток [24]. Высокая реакционная способность АМК определяет их токсичность для биологических систем на всех уровнях — от молекулярно-клеточного до орга-низменного. Например, гиперпродукция TNF и АМК при массивной антигенной нагрузке и/ или на фоне дефицита антиоксидантов приводит к разрушению клеток и тканей [6].
Показано, что TNF (2 нг/мл) усиливает хемилюминесцентный (ХЛ) ответ МНК здоровых доноров в 2 раза (р < 0,01). В то же время белок VARV-CrmB и полиАЬр^ соответственно в концентрациях 8 нг/мл и 50 нг/мг не оказывают влияние на окислительно-метаболическую функцию МНК. При добавлении 8 нг/мл полиАЬтор. TNF-индуцированный ХЛ ответ снижается в 1,35 раза. ПолиАЬхот в концентрации 50 нг/мл практически отменяют эффект TNF. VARV-CrmB (8 нг/мл), как и полиАЬ^р- (50 нг/мл) отменяют TNF-индуцированный ХЛ ответ МНК. Так, максимальное пиковое значение ХЛ ответа (Imax) МНК крови доноров при действии TNF (2 нг/мл) в среднем составило 2982,9±194,1 имп/103 МНК. При добавлении 8 нг/мл полиАЬ-^ значение Imax TNF-индуцированного ХЛ ответа МНК снизилось до 1986,2±344,8 имп/103 МНК (р < 0,05), а 50 нг/мл полиАЬ^р- — до 1228,1±178,9 имп/103 МНК (р < 0,01). При добавлении 8 нг/мл TNF-связывающего белка VARV-CrmB значение Imax TNF-индуцированного ХЛ ответа МНК снизилось до 1129±347,4 имп/103 МНК (р < 0,01).
Таким образом, по результатам исследования окислительно-метаболической функции МНК, VARV-CrmB обладает большей TNF-нейтрализующей способностью по сравнению с полиAbXNF и моноАЬ^р
2.3. Влияние varv-crmB на колониеобразующую активность клеток костного мозга мыши и человека в условиях воздействия rTNF
Хронические воспалительные процессы часто сопровождаются формированием анемии.
В основе патогенеза анемии хронических заболеваний лежат TNF-опосредованные нарушения пролиферации и усиление апоптоза эритро-идных предшественников; показано снижение колониеобразующей активности эритроидных предшественников (БОЕ-Э) в костном мозге больных ревматоидным артритом. Эти изменения могут быть скорректированы с помощью препаратов, блокирующих активность TNF: внесение анти-TNF антител в культуру моно-нуклеарных клеток больных ревматоидным артритом приводит к увеличению количества БОЕ-Э. Кроме того, доказано, что использование анти-TNF антител в лечении анемии при ревматоидном артрите приводит к значительному повышению уровня гемоглобина [25]. Для оценки дифференцировочных процессов в костном мозге мыши и человека исследовалась колониеобразующая способность коммитиро-ванных гемопоэтических предшественников в метилцеллюлозной культуре ККМ. Было обнаружено, что VARV-CrmB в отсутствие rmTNF не оказывает эффекта на костномозговой гемопоэз (количество эритроидных и гранулоцитар-но-макрофагальных колоний под воздействием VARV-CrmB достоверно не изменялось), что можно интерпретировать как отсутствие токсического эффекта изучаемого белка на гемопоэтические предшественники. Внесение rmTNF в различных концентрациях в культуру ККМ мышей приводило к достоверному снижению количества эритроидных предшественников (БОЕ-Э+КОЕ-Э). Вместе с тем мы наблюдали увеличение числа КОЕ-ГМ по сравнению с контролем (культуральная среда) при воздействии rmTNF в концентрациях 2 нг/мл. Совместное воздействие rmTNF и VARV-CrmB приводит к восстановлению rmTNF-индуцированного снижения количества эритроидных колоний и rmTNF-индуцированного повышения численности КОЕ-ГМ до исходного уровня [8]. Нами показано, что rhTNF в дозе 2 нг/мл и 20 нг/мл обладает способностью ингибировать рост как эритроидных, так и гранулоцитарно-макро-фагальных колоний, образуемых ККМ человека. VARV-CrmB дозозависимым образом восстанавливает rhTNF-обусловленное снижение колониеобразующей способности гемопоэтических предшественников.
3. Изучение противовоспалительных эффектов varv-crmB в модели ЛПС-индуцированого септического шока у мышей
Кроме эффективной TNF-нейтрализующей активности in vitro показано, что VARV-CrmB
36
2012, Т. 14, № 1-2
Эффекты анти-TNFбелка ВНО
оказывает выраженный лечебный эффект на проявления LPS-индуцированного эндотоксического шока у SPF мышей линии Balb/C, достоверно увеличивая процент выживших животных. Гистологическое изучение внутренних органов и головного мозга экспериментальных животных показало, что VARV-CrmB предупреждает появление инфарктов в сердце, снижает степень нарушений кровообращения в сосудах внутренних органов, головного мозга и брыжейки, препятствует развитию острой почечной недостаточности, наблюдаемые у животных контрольной группы [1].
4. Изучение эффектов VARV-CrmB в модели коллаген-индуцированного артрита (КИА) у мышей
4.1. Сравнительная оценка клинических проявлений КИА при введении поли-AbTNF и vARv-CrmB
Развитие КИА на ранних сроках (2 и 7 сутки) после разрешающей инъекции коллагена II характеризовалось эритемой и отеком преимущественно задних конечностей мышей (группа мышей КИА). На 14 и 21 сутки наблюдения выявлены: эритема и отек не только задних, но и передних конечностей, а также видимая деформация суставов с ограничением их подвижности. Ширина лапы и тибиотарзального сустава мышей на всех сроках развития КИА была достоверно большей, чем у животных контрольной группы (максимальное увеличение ширины лапы наблюдалось на 7 сутки, а ширины тибиотарзального сустава — на 14 сутки развития КИА). Введение поли-AbTNF (группа мышей КИА+AbTNF) приводило к снижению отечности конечности мышей на всех сроках исследования, а ширины тибиотарзального сустава — начиная с 7 суток наблюдения. Однако снижение ширины лапы и тибиотарзального сустава при введении поли-AbTNF на ранних сроках наблюдения (2 и 7 сутки) статистически не отличалась от данных у животных II группы (КИА), а на поздних (14 и 21 сутки) сроках — эти изменения были статистически значимыми. Подобные результаты были получены при введении мышам VARV-CrmB (группа мышей КИА+VARV-Crmb). При этом снижение ширины лап и тибиотар-зального сустава у мышей данной группы была более значимой, чем у животных, получавших поли-AbTNF.
В динамике развития КИА наблюдали закономерное усиление клинических проявлений артрита, которое повышается вплоть до 21 суток наблюдения. Введение поли-AbTNF и VARV-CrmB приводило к снижению степени активности ар-
трита у мышей на ранних сроках наблюдения. Так, только через 2 суток после введения поли-AbTNF сумма баллов по шкале была статистически ниже, чем у мышей группы КИА. В то же время, у мышей группы КИА+VARV-CrmB сумма баллов была достоверно меньшей на 2 и 7 сут. Затем, к 14 и 21 суткам показатели шкальной оценки степени активности артрита во всех сравниваемых группах практически не различались.
Таким образом, при введении VARV-CrmB улучшение клинического состояния КИА имеет более продолжительный характер, чем при инъекции поли-AbTNF. Однако к концу срока наблюдения у животных всех групп клинические проявления артрита (шкальная оценка) практически не различались между собой.
4.2. Изменение коллагенолитической активности сыворотки крови и содержания суммарных сывороточных гликозаминогликанов в динамике развития КИА и при введении поли-AbTNF и VARV-CrmB
Результаты исследования показали, что коллагенолитическая активность сыворотки крови (КАС) в динамике развития КИА закономерно возрастает, достигая максимума к 14 суткам наблюдения, что свидетельствует о повышении суммарной активности коллагеназы и протеаз [10]. Введение поли-AbTNF и VARV-CrmB приводило к снижению КАС, причем при воздействии VARV-CrmB наблюдается более выраженный эффект.
Активация КАС в динамике развития КИА сопровождается разрушением хрящевой ткани, о чем свидетельствует возрастание уровня сывороточных гликозаминогликанов (сГАГ). Введение мышам поли-AbTNF и VARV-CrmB приводит к снижению уровня сГАГ .
4.3. Изменение численности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови и костномозговых гранулоцитарно-макрофагальных предшественников в динамике развития КИА при введении поли-AbTNF и VARV-CrmB
Развитие воспалительного процесса реализуется за счет эффекторных клеток крови (нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов), имеющих костномозговое происхождение. В нашем исследовании при развитии КИА происходит увеличение как относительной, так и абсолютной численности нейтрофилов крови, которые играют ключевую роль в реализации воспалительного процесса. Результаты исследования показали, что введение поли-AbTNF и VARV-CrmB приводит к снижению численности нейтрофилов крови.
37
Орловская И.А. и др.
Медицинская Иммунология
Пополнение популяции нейтрофильных гра-нулоцитов в процессе развития КИА происходит, очевидно, за счет увеличения численности грану-лоцитарно-макрофагальных предшественников в условиях активной продукции TNF. Повышение количества КОЕ-ГМ наблюдалось в группе КИА на всех сроках исследования. В работе [27] также показан стимулирующий эффект TNF в концентрации 2 нг на рост КОЕ-ГМ, в то время как эритроидная дифференцировка была подавлена. Опубликованы данные об увеличении гранулоцитарно-макрофагального и снижении эритроидного компартмента под влиянием TNF при введении его in vivo [18].
Показано, что введение животным поли-Abj^ и VARV-CrmB приводит к достоверному снижению числа КОЕ-ГМ на 7 сутки наблюдения, а на последующие сроки исследования не наблюдается корректирующих эффектов от введения препаратов, а на 3 неделе обнаруживается достоверная стимуляция исследуемого показателя под воздействием VARV-CrmB.
4.4. Состояние окислительно-метаболической функции лейкоцитов крови в динамике развития КИА у мышей и при введении поли-AbTNF и УАКА-crmB
Результаты исследования показали, что окислительно-метаболическая функция (ОМФ) лейкоцитов крови в динамике развития КИА значительно усиливается и сохраняется на высоком уровне до конца срока наблюдения. Введение поли-AbTNF и VARV-CrmB мышам с КИА приводило к достоверному снижению ОМФ лейкоцитов крови. При этом, VARV-CrmB оказывал более выраженный эффект на ОМФ лейкоцитов крови мышей с КИА.
5. Изучение эффектов vaRv-crmB при эпику-танном воздействии rmTNF и в модели экспериментального дерматита у мышей
Аллергический контактный дерматит относится к аллергическим реакциям замедленного типа и развивается в 2 этапа: в афферентной фазе гаптены проникают в кожу, захватываются резидентными дендритными клетками эпидермиса — клетками Лангерганса (ДК/КЛ), которые затем мигрируют в регионарные лимфатические узлы и индуцируют активацию специфических Т-клеточных предшественников. TNF является главным звеном в запуске воспалительной реакции кожи в ответ на контакт с повреждающим агентом [13]. Вторая, эфферентная фаза контактной реакции индуцируется повторным контактом кожи с гаптеном на любом отдаленном от места первого контакта участке. Это приво-
дит к быстрому рекрутированию специфических Т-лимфоцитов и локальной воспалительной реакции, с максимальными проявлениями через 24-48 часов после провокации. Эта реакция затем постепенно затухает при участии цитокинов IL-4 и IL-10 [11]. Блокада провоспалительных цитокинов с помощью моноклональных антител существенно снижает миграцию дендритных клеток в дренирующие лимфатические узлы и вызывает ослабление повреждений кожи [21]. Миграции лейкоцитов из кожного эксплантата оценивалась по Larsen et al. [23].
5.1. Изучение влияния rmtNf и vaRv-crmB на миграционную и окислительно-метаболическую функцию лейкоцитов, а также костномозговой гемопоэз мышей при эпикутанном способе воздействия
При аппликации rmTNF на дорзальную поверхность ушей наблюдалось достоверное увеличения количества мигрирующих лейкоцитов. При обработке мышей VARV-Crmb миграционная активность клеток не менялась. В то же время rVARV-Crmb достоверно снижал количество мигрирующих лейкоцитов у rmTNF-обработанных мышей.
Результаты исследования окислительно-метаболической активности лейкоцитов показали, что уже через 2 ч после эпикутанной обработки rmTNF происходит усиление активности ОМФ лейкоцитов крови мышей, которое достигает максимума через 24 ч, а затем постепенно снижается, достигая контрольных величин к 72 ч наблюдения. При эпикутанной аппликации VARV-CrmB после воздействия rmTNF данный показатель значительно снижался, свидетельствуя о TNF-нейтрализующей способности белка [9].
В работе исследовалось влияние TNF-нейтрализующего рекомбинантного белка VARV-CrmB и rmTNF при эпикутанном способе воздействия на колониеобразующую активность клеток костного мозга (ККМ) мышей. Через 30 мин после аппликации rmTNF наносился исследуемый белок, и через 24 оценивалось количество колоний гемопоэтических предшественников (БОЕ-Э, КОЕ-Э, КОЕ-ГМ) в метилцеллюлозной культуре. В другом эксперименте rmTNF+VARV-CrmB аппликацировались трехкратно в течение трех суток, и через 24 оценивалось количество колоний гемопоэтических предшественников (БОЕ-Э, КОЕ-Э, КОЕ-ГМ) в метилцеллюлозной культуре.
Накожные аппликации rmTNF в течение трех суток вызывают статистически достоверное снижение количества эритроидных колоний (БОЕ-
38
2012, Т. 14, № 1-2
Эффекты анти-TNFбелка ВНО
Э+КОЕ-Э), в основном за счет поздних КОЕ-Э. Совместное эпикутанное нанесение TNF+VARV-CrmB восстанавливает количество эритроидных колоний (в том числе КОЕ-Э). После аппликации rmTNF повышается количество КОЕ-ГМ, VARV-Crmb достоверно снижает их количество до уровня контрольных значений. Аналогичные изменения наблюдаются через сутки после однократной аппликации.
Таким образом, TNF-блокирующие свойства VARV-CrmB продемонстрированы при эпи-кутанных аппликациях VARV-CrmB и rmTNF: VARV-CrmB оказывает корригирующие эффекты в отношении TNF-зависимых изменений колониеобразующей активности гемопоэтических предшественников.
5.2. Изучение противовоспалительного потенциала VARV-CrmB в модели экспериментального дерматита у мышей
Для оценки миграции дендритных клеток из эпидермиса мышам линии Balb/c апплици-ровали раствор ДНХБ на дорзальную сторону обоих ушей и через 30 минут VARV-CrmB в физиологическом растворе. Контролем служил растворитель; в качестве положительного контроля животным вводили подкожно в ушную раковину поликлональные АТ к TNFa в дозе 3 мкг/мышь. Через 17 часов готовили кожные эксплантаты, помещали их в 24-луночный планшет, и через 24 часа культивирования подсчитывали мигрировавшие клетки.
Показано, что аппликативное воздействие VARV-CrmB достоверно снижает миграцию лейкоцитов, вызванную аллергеном. Внутрикожное введение поли-AbTNF также эффективно снижает миграцию лейкоцитов. Полученные результаты демонстрируют эффективность VARV-CrmB в изучаемой модели.
Для оценки влияния аппликативных воздействий VARV-CrmB на клеточный иммунный ответ использовали метод «величина отека уха» (MEST) на фоне ДНХБ [14]. 50 мкл 1% раствора ДНХБ наносили на межлопаточную область мышей Balb/c в течение 3-х дней. VARV-CrmB наносили на этот же участок кожи через 30 минут после аллергена, животным контрольной группы апплицировали растворитель.
На 5-ый день от начала аппликаций всем животным наносили 25 мкл 0,5% ДНХБ на обе поверхности левого уха, на правое наносили такое же количество растворителя. Через 24, 48 и 72 часа замеряли толщину обоих ушей с помощью электронного штангенциркуля, за величину отека принимали разницу толщины левого и правого ушей для каждого животного. Показано,
что аппликативное воздействие VARV-CrmB достоверно снижает показатель отека уха. Кроме того, при воздействии VARV-CrmB отмечалось более раннее отторжение струпа в очаге воспалительной реакции, что может свидетельствовать об ускорении процесса ранозаживления под влиянием VARV-CrmB.
Заключение
Получен рекомбинантный белок вируса натуральной оспы — VARV-CrmB и изучены его физико-химические свойства. Исследованы биологические эффекты VARV-CrmB in vitro. Установлено, что предварительная соинкубация TNF и VARV-CrmB в различных концентрациях (100 нг/мл и 10 нг/мл) полностью отменяет эффекты TNF на продукцию IL-1 в и IL-6 в культуре МНК, а концентрации цитокинов снижается до уровня спонтанной продукции. Белок VARV-CrmB обладает большей по сравнению с полиAbXNF и моноAbXNF TNF-нейтрализующей способностью на продукцию IL-1 и IL-6 моно-нуклеарами. При изучении влияния VARV-CrmB на TNF-индуцированную генерацию активных метаболитов кислорода установлено, что тестируемый белок отменяет TNF-стимулированный хемилюминесцентный ответ МНК в большей степени, чем специфическое антитело против TNF.
В модели костномозгового гемопоэза мышейВа1Ь/с показано, что совместное воздействие rmTNF и VARV-CrmB приводит к восстановлению rmTNF-индуцированного снижения количества эритроидных колоний и rmTNF-индуцированного повышения численности КОЕ-ГМ до исходного уровня. rhTNF обладает способностью ингибировать рост как эритроид-ных, так и гранулоцитарно-макрофагальных колоний, образуемых ККМ человека. Воздействие VARV-CrmB дозозависимым образом восстанавливает rhTNF-обусловленное снижение колониеобразующей способности гемопоэтических предшественников.
Исследования in vivo показали, что VARV-CrmB оказывает выраженный лечебный эффект на проявления LPS-индуцированного эндотоксического шока у SPF мышей линии Balb/C, достоверно увеличивая процент выживших животных.
На модели коллаген-индуцированного артрита (КИА) показано, что введение поли-AbTNF и VARV-CrmB приводит к снижению степени активности артрита, коллагенолитической активности сыворотки и содержания гликоза-
39
Орловская И.А. и др.
Медицинская Иммунология
миногликанов на ранних сроках КИА. VARV-CrmB оказывает более выраженный эффект, чем AbTNF. Введение поли-AbTNF и VARV-CrmB приводит к снижению численности нейтро-фильных гранулоцитов и ГМ-предшественников (на ранних сроках) в процессе развития КИА. Введение поли-AbTNF и VARV-CrmB приводит к достоверному снижению окислительно-метаболической активности лейкоцитов, причем более выраженный эффект наблюдается при воздействии VARV-CrmB.
TNF-блокирующие свойства VARV-CrmB продемонстрированы при эпикутанных аппликациях rmTNF и VARV-CrmB. Эпикутанное воздействие VARV-Crmb нормализует повышенную миграционную и окислительно-метаболическую активность лейкоцитов rmTNF-обработанных мышей. При эпикутанном воздействии VARV-CrmB оказывает корригирующие эффекты в отношении TNF-зависимых изменений колониеобразующей активности гемопоэтических предшественников.
Исследование противовоспалительного потенциала VARV-CrmB в модели контактного дерматита продемонстрировало, что аппликативное воздействие VARV-CrmB достоверно снижает миграцию лейкоцитов из кожного лоскута в афферентной фазе контактной реакции на ДНХБ; этот эффект сравним с внутрикожным введением поли-AbTNF. Показано, что аппликативное воздействие VARV-CrmB достоверно снижает показатель «отека уха» в эфферентной фазе контактной реакции на ДНХБ. Кроме того, при воздействии VARV-CrmB отмечалось более раннее отторжение струпа в очаге воспалительной реакции, что может свидетельствовать об ускорении процесса ранозаживления под влиянием VARV-CrmB. Полученные результаты демонстрируют TNF-блокирующие свойства VARV-CrmB, причем в ряде случаев исследуемый белок проявляет более выраженные эффекты по сравнению с поли-AbTNF.
Таким образом, совокупность полученных нами данных позволяет рассматривать рекомбинантный вирусный белок VARV-CrmB как новый потенциальный TNF-антагонист, эффекты которого могут быть реализованы за счет его нейтрализующей способности TNF-индуцированной активации окислительно-метаболической, цито-кин-продуцирующей и миграционной функций эффекторных клеток при терапии патологических воспалительных процессов.
Благодарности
Работа выполнена при финансовой поддержке Федеральной целевой программой «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. (гос. Контракт 02.740.11.0485) и РФФИ (грант 10-04-00387а).
Список литературы
1. Гилева И.П., Малкова Е.М., Непомнящих Е.С., Виноградов И.В., Лебедев Л.Р., Коч-нева Г.В., Гражданцева А.А., Рябчикова Е.И., Щелкунов С.Н. Изучение действия TNF-связывающего белка вируса натуральной оспы на развитие ЛПС-индуцированного эндотоксического шока // Цитокины и воспаление. — 2006. - № 1. - С. 44-49.
2. Гилева И.П., Непонящих Т.С., Рязан-кин И.А., Щелкунов С.Н. Рекомбинантный TNF-связывающий белок вируса натуральной оспы как потенциальный TNF-антагонист нового поколения // Биохимия. - 2009. - Т. 74. -С.1664-1667.
3. Гилева И.П., Рязанкин И.А., Максю-тов З.А., Тотменин А.В., Агеенко В.А., Нестеров А.Е., Щелкунов С.Н. Рекомбинантная плаз-мидная ДНК pFastBac-G2R, содержащая фрагмент генома вируса натуральной оспы, кодирующий белок-аналог рецептора TNF, и штамм ба-куловируса BVi67, продуцирующий растворимый рецептор TNF вируса натуральной оспы // Рос. патент № 2241754. — 2003.
4. Гилева И.П., Рязанкин И.А., Максю-тов З.А., Тотменин А.В., Лебедев Л.Р., Нестеров А.Е., Агеенко В.А., Щелкунов С.Н., Сандах-чиев Л.С. Сравнительное изучение свойств орто-поксвирусных растворимых рецепторов фактора некроза опухолей // Доклады РАН. — 2003. — Т. 390. — С. 160-164.
5. Гилева И.П., Рязанкин И.А., Непомнящих Е.С., Тотменин А.В., Максютов З.А., Лебедев Л.Р., Афиногенова Г.Н., Пустошило-ва Н.М., Щелкунов С.Н. Экспрессия генов TNF-связывающих белков ортопоксвирусов в клетках насекомых и изучение свойств рекомбинантных белков // Молекуляр. биология. — 2005. — Т. 39. — С.218-225.
6. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньщико-ва Е.Б. Окислительный стресс: Биохимические и патофизиологические аспекты — М.: МАИК «Наука/Интерпериодика», 2001. — 343 с.
40
2012, Т. 14, № 1-2
Эффекты анти-TNFбелка ВНО
7. Лебедев Л.Р, Рязанкин И.А., Сизов А.А., Агеенко В.А., Одегов В.Н., Афиногенова Г.Н., Щелкунов С.Н. Способ очистки антагонистов фактора некроза опухолей и исследование их некоторых свойств // Биотехнология. — 2001. — № 6. - С. 14-18.
8. Топоркова Л.Б., Петухова А.А., Гилева И.П., Орловская И.А. Рекомбинантный белок вируса натуральной оспы нейтрализует эффекты фактора некроза опухолей на модели костномозгового гемопоэза мышей BALB/С // Медицинская иммунология. — 2010. — Т. 12, № 4-5. — С.297-304.
9. Цырендоржиев Д.Д., Сенников С.В., Вязовая Е.А., Гилева И.П., Щелкунов С.Н., Рязанкин И.А., Лебедев Л.Р., Топоркова Л.Б., Ку-рилин В.В., Петухова А.А., Орловская И.А. Влияние рекомбинантного TNF-связывающего белка вируса натуральной оспы на миграционную и окислительно-метаболическую функцию лейкоцитов крови мышей при эпикутанной аппликации фактора некроза опухолей // Бюллетень СО РАМН. — 2011. — № 3. — С. 73-78.
10. Шараев П.Н., Пишков В.Н., Зворыги-на Н.Г. и др. Определение коллагенолитической активности плазмы крови // Лабораторное дело.— 1987. — № 1. — С. 60-62.
11. Akiba H., Kehren J., Ducluzeau M-T., Krasteva M., Horand F., Kaiserlian D., Kaneko F., Nicolas J-F. Skin inflammation during contact hypersensitivity is mediated by early recruitment of CD8+ T cytotoxic cells inducing keratinocyte apoptosis // J. Immunol. — 2002. — Vol. 168. — P. 3079-3087.
12. Blinov V.M., Shchelkunov S.N.,
Sandakhchiev L.S. A possible molecular factor responsible for the generalization of smallpox infection // Dokl. Ross. Akad. Nauk. — 1993. — Vol.328. — P. 109-111.
13. Enk A.H., Katz S.I. Early molecular events in the induction phase of contact sensitivity // PNAS USA. — 1992. — Vol. 89. — P. 1398-1402.
14. Garrigue J.L., Nicolas J.F., Fraginals R., Benezra C., Bour H., Schmitt D.Optimization of the mouse ear swelling test for in vivo and in vitro studies of weak contact sensitizers // Contact Dermatitis — 1994. — Vol. 30. — P. 231-237.
15. Gartlehner G., Hansen R.A., Jonas B.L. et al. The comparative efficacy and safety of bio-logics for the treatment of rheumatoid arthritis: a systemic
review and metaanalysis // J. Rheumatol. — 2006. — Vol. 33. — P. 2398-2408.
16. Gileva I.P., Nepomnyashchich T.S.,
Antonets D.V, Lebedev L.R., Kochneva G.V., Grazhdantseva A.A., Shchelkunov S.N. Properties of the recombinant TNF-binding proteins from variola, monkeypox, and cowpox viruses are different // Bioch. Bioph. Acta. — 1992. — Vol. 1764. — P. 17101718.
17. Hasegawa A., Takasaki W., Greene M.I., Murali R. Modifying TNF for therapeutic use: A perspective on the TNF receptor system // Mini. Rev. Med. Chem. — 2001. — Vol. 1. — P. 5-16.
18. Johnson C. S., Chang M.-J., Furmanski P. In Vivo Hematopoietic Effects of Tumor Necrosis Factor-a in Normal and Erythroleukemic Mice: Characterization and Therapeutic Applications // Blood. — 1988. — Vol. 72. — P. 1875-1883.
19. Juurikivi A., Sandler C., Lindstedt K.A. et al. Inhibition of c-kit tyrosine kinase by imatinib mesylate induces apoptosis in mast cells in rheumatoid synovia: a potencial approach to the treatment of arthritis // Ann. Rheum. Dis. — 2005. — ЛЫ. 64, N 8. — P. 11261131.
20. Kirou K. A., Mavragani C. P. TNF antagonists in the management of early rheumatoid ar-thritis: an overview // Int J. Adv. Rheumatol. — 2006. — N 4. — P. 49-56.
21. Kobayashi Y., Matsumoto M., Kotani M., Makino T. Possible involvement of matrix metalloproteinase-9 in Langerhans cell migration and maturation // J. Immunol. — 1999. — Vol. 163. — P. 5989-5993.
22. Kremer J.M., Westhovens R., Leon M. et al. Treatment of rheumatoid arthritis by selective inhibition of T-cell activation with fusion protein CTLA4Ig // N. Engl. J. Med. — 2003. — Vol. 49. — P. 1907-1915.
23. Larsen C.P., Steinman R.M., Witmer-Pack M., Hankins D.F., Morris P.J., Austyn J.M. Migration and maturation of Langerhans cells in skin transplants and explants // J. Exp. Med. — 1990. — Vol. 172. — P. 1483-1493.
24. Mc Devitt H., Munson S., Ettingen R., Wu A. Multiple roles for tumor necrosis factor-а and lymphotoxin а/p in immunity and autoimmunity // Arthritis Res. — 2002. — N 4 (supp. 13). — P. 141152.
25. Papadaki H., Kritikos H., Valatas V., Boumpas D., Eliopoulos G. Anemia of chronic diseases in rheumatoid arthritis is associated with
41
Орловская И.А. и др.
Медицинская Иммунология
increased apoptosis of bone marrow erythroid cells: improvement following anti-tumor necrosis factor-alpha antibody therapy // Blood. — 2002. — Vol. 100. — P. 474-482.
26. Redlich K., Schett G., Sterner G. et al. Rheumatoid arthritis therapy after tumor necrosis factor and interleukin-1 blockade // Arthritis Rheum. - 2003. - Vol. 48. - P. 3108-3119.
27. Rusten L.S., Jacobsen S.E. Tumor necrosis factor (TNF)-alpha directly inhibits human
erythropoiesis in vitro: role of p55 and p75 TNF receptors // Blood. — 1995. — Vol. 85. — P. 989-996.
28. Shchelkunov S.N., Blinov VM.,
Sandakhchiev L.S. Genes of variola and vaccinia viruses needed for overcoming of the host protective mechanisms // FEBS Lett. — 1993. — Vol. 319. — P. 80-83.
поступила в редакцию 28.07.2011 отправлена на доработку 12.10.2011 принята к печати 12.11.2011
42
