CC BY
45
УДК 615.35:577.112.083
о.Ж. Гармаева, н.н. цыбиков, Б.А. тарнуев, и.н. Есаулова, д.д. доржаева
биологическая Активность регуляторных пептидов, полученных из почек животных, перенесших дробное кровопускание
ГОУ ВПО «Бурятский государственный университет» (Улан-Удэ) Читинская государственная медицинская академия (Чита) Иркутский государственный институт усовершенствования врачей (Иркутск)
Отмечено, что кровопускание в небольших объёмах сопровождается повышением резистентности организма и проявляется, в улучшении состояния больного, сокращением, сроков лечения. Вместе с тем. известно, что регуляция физиологических функций организма осуществляется, нервными и гуморальными механизмами, а также посредством, иммунной системы., где важная роль отводится цитомединам.
Целью нашего исследования явилось изучение биологических свойств цитомединов, выделенных из почек животных, перенесших кровопотерю, их влияния на механизм, формирования, резистентности организма: влияние цитомединов, выделенных из почек интактных и перенесших кровопотерю животных, на экспрессию CD-маркеров лимфоцитов крови, доноров и. больных с явлениями иммунодефицита; исследование коагулирующих и. фибринолитических свойств цитомединов, их влияние на агрегацию тромбоцитов. В результате наших исследований показано, что пептиды, из почек баранов, перенесших кровопотерю, обладают, более выраженной, биологической активностью. В эксперименте отмечено, что показатели, системы, коагуляционного гемостаза, а такжелимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия больше изменялись при введении «опытных» пептидов.
Ключевые слова: гомеостаз, CD-маркеры, цитомедины, кровопускание
BioLoGicAL AcTMTY oF REGuLATORY pEpTiDEs oBTAINED FRoM ANIMAL KiDNEYs After FRAcTIoNAL pHLEBoTOMY
O.Zh. Garmayeva, N.N. Tsibikov, V.A. Tarnuyev, I.N. Esaulova, D.D. Dorzhayeva
Republican Clinical Hospital for War Veterans, Ulan-Ude Chita State Medical Academy, Chita Irkutsk State Institute of Physicians’ Training, Irkutsk
It has been marked, that low volume phlebotomy is accompanied, by increased resistance of the organism, and is displayed, by improvement of a patient's state and. reduction of terms of treatment. Along with that it is known that regulation, of physiological functions of the organism, is performed by nervous and. humoral mechanisms, and also by immune system, in which the important role belongs to cytomedines.
The purpose of our investigation, was to study biological features of cytomedines obtained, from the kidneys of animals having undergone blood loss; influence of cytomedines on the mechanism, of formation of organism, resistance, on expression, of CD-markers of blood lymphocytes of donors and patients with, manifestations of immune deficit; to study coagulative and. fibrinolytic features of cytomedines, their influence on thrombocyte aggregation. The results of our investigation, shown that peptides from kidneys of sheep, having undergone blood loss, have more expressed biological activity. The experiment displayed that parameters of coagilational hemostasis system, and lymphocyte-thrombocyte adhesion changed more extensively at introduction, of «experienced» peptides.
Key words: hemostasis, CD-markers, cytomedines, phlebotomy
Со времен Гиппократа знали, что болезни могут излечиваться естественными силами природы
— vis medicatix naturae. Теперь это проявление природы связывают со способностью организма к восстановлению гомеостаза и возможностью развития адаптации даже к вредным факторам. Реакции, обеспечивающие гомеостаз, могут быть направлены на поддержание известных уровней стационарного состояния, координацию комплексных процессов для устранения или ограничения действия вредоносных факторов, выработку или сохранение оптимальных форм взаимодействия организма и среды в изменившихся условиях его существования. Все эти процессы и определяют адаптацию.
Традиционные представления о механизмах поддержания гомеостаза в многоклеточном организме в последние годы претерпели рево-
люционные изменения. Причина — выявление общего молекулярного «языка» для обмена сигнальной информацией между клетками, тканями и органами. Многообещающим направлением современной биомедицины становится выяснение поликомпонентного и многоуровнего механизма единой нейроиммуноэндокринной регуляции физиологических функций, которой принадлежит роль универсального дирижера всех процессов жизнедеятельности [8]. Важную роль в данной регуляции отводят комплексам щелочных полипептидов, получившим название цитомедины. Любая информация, поступающая в организм, контролируется системой биорегуляции, действие которой направлено на сохранение высокой степени стабильности функционирования генома, и, следовательно, основная задача системы биорегуляции заключается в управлении экспрессией генов,
процессами биосинтеза и защитными функциями организма [7].
Вместе с тем, известно, что регуляция физиологических функций организма осуществляется нервными и гуморальными механизмами, а также посредством иммунной системы, где важная роль отводится цитомединам. В последние годы появилось много работ по изучению единой интегральной клеточно-гуморальной системы защиты организма, которую образуют иммунитет, гемостаз и неспецифическая резистентность. Установлена взаимосвязь между гемостатическими и воспалительными реакциями при повреждении тканей, в основе которых лежат механизмы сигнализации, опосредуемые регуляторными пептидами [3, 4, 5, 6]. Несомненно, поддержание гомеостаза у человека и высших млекопитающих осуществляется при непосредственном участии центральной нервной системы и гуморальных факторов. Последние включают в себя железы внутренней секреции, вырабатывающие гормоны, а также громадное число биологически активных соединений, продуцируемых органами, тканями и клетками. Среди последних особое место отводится пептидам, способным вмешиваться в течение самых различных функций многоклеточного организма.
Любое повреждающее начало, в том числе кровопускание, является сигналом для запуска работы этих белков, что проявляется в увеличении количества клеток, несущих рецепторы, свидетельствующем об активации различных клонов лимфоцитов, увеличении количества иммуноглобулинов, активации системы комплемента. Вместе с тем до настоящего времени определение роли цитомединов в регуляции гомеостаза организма при физических методах лечения, среди которых кровопускание относится к пяти наиболее распространенным видам лечения и профилактики, до сих пор не выделено.
В последнее время благодаря широкому распространению и использованию общей теории функциональных систем, накоплен большой материал, показывающий значение и применение физиологических процессов регулирования и саморегулирования в клинике, установлена взаимозависимость их нервных, гуморальных и других компонентов [1, 2, 3, 9]. В этой связи представляется вполне очевидным повторное обращение к старым идеям и показаниям кровопускания, но уже с позиций новых научных представлений и с помощью новых методов исследования [10, 11].
материалы и методы
Целью нашего исследования явилось изучение биологических свойств цитомединов, выделенных из почек животных, перенесших кровопотерю, на механизм формирования резистентности организма: влияние цитомединов, выделенных из почек интактных и перенесших кровопотерю животных, на экспрессию CD-маркеров лимфоцитов крови доноров и больных с явлениями иммунодефицита; исследование коагулирующих и фибринолитических
свойств цитомединов, их влияние на агрегацию тромбоцитов. Исследования проводились на базе Бурятской Государственной сельскохозяйственной академии, Республиканского клинического госпиталя для ветеранов войн и иммунологической лаборатории Республиканской клинической больницы им. Н.А. Семашко.
Эксперименты проведены на 20 баранах. Все животные были разделены на две группы: опытные животные (10 баранов), которым пунктировали яремные вены и извлекали кровь в объеме, равном примерно 10—15 % ОЦК, через 5 дней после забора крови производили эксперимент; контрольным животным (10 баранов) кровопускание не производили. Животные содержались в стандартных условиях вивария Бурятской государственной сельскохозяйственной академии на обычном рационе при температуре 21—22 °С и естественном световом дне. Забой проводился в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Для эксперимента были взяты почки животных. Получение субстрата «регуляторных пептидов» проводилось методом уксусно-кислой экстракции с последующим осаждением комплекса полипептидов ацетоном и очисткой методом гель-фильтрации. Иммунологические исследования биологической активности цитомединов были проведены на 24 образцах крови доноров и 30 образцах крови пациентов с вторичными иммунодефицитными состояниями. Определение динамики CD-маркеров лимфоцитов проводилось с помощью моноклональных антител реакцией иммунофлюоресценции (РИФ). Использовались моноклоны производства «МедБиоспектр» (г. Москва). Анализировались показатели иммунного статуса до и после инкубации с пептидами.
Для определения показателей коагуляционного гемостаза мы использовали методики, вошедшие в современные руководства по изучению системы гемостаза: активированное частичное тромбопла-стиновое время (АЧТВ), протромбиновое время, тромбиновое время, каолиновое время (Барка-ган З.С., 1985).
Реакцию фибринолитической системы в ответ на введение «регуляторных пептидов» из почек баранов мы оценивали по двум параметрам, вошедшим в современное руководство по изучению системы гемостаза, — это методика определения фибринолитической активности эуглобулиновой фракции (Kowarzyk H., Buluk K., 1954) и фибрино-лиз каолиновый (Веремеенко К.Н., 1978).
Способ оценки агрегации тромбоцитов заключался в исследовании скорости и степени уменьшения оптической плотности (увеличения светопропускающей способности) тромбоцитар-ной плазмы при перемешивании с индукторами агрегации, например, аденозиндифосфатом (АДФ), адреналином, коллагеном, ристомицином и др. (при изучении спонтанной агрегации они не добавляются), а также в определении среднего размера агрегатов и скорости их образования. Использовалась методика, предложенная D. Varon с соавт. (1997).
Полученные данные были обработаны статистически общепринятыми методами для малой выборки с определением средней величины (М), средней квадратичной ошибки (ст) и ошибки средней арифметической (m). Достоверность различий оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считались существенными при Р < 0,05. Статистический отчет выполнен на компьютере IBM Pentium-4 пакетом «Microsoft Excel professional for Windows XP».
результаты и обсуждение
В результате проведенных исследований было установлено, что:
1. «Опытные» пептиды значительно увеличивают число CD3- и CD4-маркеров на лимфоцитах больных. Данное обстоятельство не должно вызывать удивления, так как лимфоциты у больных с иммунодефицитом изначально имеют низкую плотность CD-маркеров. Дополнительная стимуляция таких лимфоцитов «регуляторными пептидами» сопровождается отчетливо усиленной экспрессией CD3- и CD4-маркеров. Увеличение же биологической активности «опытных» пептидов, вероятно, обусловлено измененным качеством пептидов. Результаты приведены в таблицах 1 и 2.
2. Как известно, одним из компонентов естественной резистентности организма является коагуляционный гемостаз. По нашему мнению, повышение постгеморрагической резистентности может быть связано с улучшением микроциркуля-
ции, обусловленным антикоагулянтными, фибри-нолитическими и антиагрегационными свойствами цитомединов. Поэтому в специальной серии экспериментов мы исследовали влияние пептидов, полученных из почек интактных и «опытных» животных, на коагуляционный гемостаз и фибрино-лиз. Оказалось, что пептиды, полученные из почек интактных животных, удлиняют каолиновое время (р1 < 0,01). Вместе с тем пептиды, полученные из ткани почек животных, перенесших кровопотерю, в большей степени увеличивают частично активированное тромбопластиновое время (р2 < 0,05; р3 < 0,01), удлиняют каолиновое (р3 < 0,01), тром-биновое (р3 < 0,02) и протромбиновое (р2 < 0,01; р3 < 0,01) время. Эти результаты свидетельствуют в пользу того, что «опытные» пептиды, вероятно, определенным образом модифицируются, что усиливает их антипротеазный потенциал, а следовательно, антикоагулянтные свойства. Ингибиция протеаз системы свертывания крови сопровождается обязательной стабилизацией жидкого состояния крови, а следовательно нормализацией гемодинамического гомеостаза. Последнее является обязательным атрибутом повышения резистентности организма.
3. В таблице 3 приведены сведения по исследованию влияния пептидов на способность растворения фибриного сгустка. Оказалось, что опытные пептиды резко стимулируют эуглобиновый фи-бринолиз и в то же время достоверно замедляют хагеманзависимый лизис. Последнее не должно вызывать удивления, так как пептиды обладают ан-
Таблица 1
Динамика экспрессии Сй-маркеров на лимфоцитах доноров под влиянием пептидов, полученных из почек
баранов до и после кровопотери (М ± т)
Изучаемый показатель и единицы измерения Исходные показатели, без добавления щ. п. Показатели с добавлением контрольных щ.п. Показатели с добавлением опытных щ.п.
CD3, Т-лимфоциты (кл./мкл) 0,77 ± 0,11 0,77 ± 0,11 0,78 ± 0,07
CD4, Т-хелперы (кл./мкп) 0,53 ± 0,05 0,63 ± 0,06* 0,64 ± 0,06**
CD8, цитотоксические Т-лимфоциты (кл./мкп) 0,31 ± 0,04 0,27 ± 0,04 0,27 ± 0,04
CD22, В-лимфоциты (кл./мкп) 0,29 ± 0,04 0,37 ± 0,05* 0,33 ± 0,04**
CD16, NK-клетки (кп./мкп) 0,35 ± 0,05 0,38 ± 0,06 0,34 ± 0,05
Примечание: * - достоверность различий между исходными показателями больных и с добавлением контрольных щелочных пептидов; ** - достоверность различий между исходными показателями больных и с добавлением опытных пептидов; *** - достоверность между показателями с добавлением контрольных и опытных пептидов.
Таблица 2
Динамика экспрессии Сй-маркеров на лимфоцитах больных с иммунодефицитом под влиянием пептидов, полученных из почек баранов до и после кровопотери (М ± т)
Изучаемый показатель и единицы измерения Исходные показатели, без добавления щ. п. Показатели с добавлением контрольных щ.п. Показатели с добавлением опытных щ.п.
CD3, Т-лимфоциты (кп./мкп) 0,42 ± 0,06 0,55 ± 0,08 0,68 ± 0,1***
CD4, Т-хелперы (кп./мкп) 0,34 ± 0,09 0,39 ± 0,05 0,53 ± 0,07**
CD8, цитотоксические Т-лимфоциты (кл./мкп) 0,36 ± 0,18 0,4 ± 0,06 0,42 ± 0,06
CD22, В-лимфоциты (кл./мкп) 0,28 ± 0,05 0,35 ± 0,12* 0,34 ± 0,15**
CD16, NK-клетки (кп./мкп) 0,32 ± 0,05 0,48 ± 0,07* 0,32 ± 0,02***
Примечания: те же, что и в таблице 1.
Таблица 3
Влияние щелочных пептидов, выделенных из почек баран до и после кровопускания на фибринолиз
Изучаемый показатель и единицы измерения Исходные показатели, без добавления щ. п. Показатели с добавлением контрольных щ.п. Показатели с добавлением опытных щ.п.
Фибринолиз эуглобулиновый (мин) 190 ± 14,13 225,7 ± 17,42** 150,6 ± 15,43***
Фибринолиз каолиновый (мин) 8 ± 1,41 10,14 ± 1,93** 20,0 ± 1,63***
Примечания: те же, что и в таблице 1.
типротеазным эффектом и в то же время тормозят активность Х11а фактора свертывания крови. Таким образом, пептиды, полученные из почек животных, перенесших кровопотерю, обладают выраженным антикоагулянтным эффектом, что объясняет один из механизмов повышения резистентности организма после лечебного кровопускания.
4. Оказалось, что «контрольные» пептиды достоверно увеличивают степень агрегации по кривой среднего размера агрегатов и скорость агрегации (р1 < 0,001). Вместе с тем «опытные» пептиды практически не изменили эти показатели по сравнению с исходными. При исследовании агрегации тромбоцитов по кривой светопропускания оказалось, что при введении «контрольных» пептидов увеличились степень агрегации и скорость их образования (р < 0,001). Наряду с этим «опытные» пептиды еще в большей степени увеличили эти показатели (р < 0,001). Эти факты говорят о том, что при введении пептидов интактных животных отмечается усиление агрегационной активности тромбоцитов, более выраженное при введении пептидов животных после кровопотери. Таким образом, нами получены несколько противоречивые факты. С одной стороны, пептиды почек интактных животных, и в большей степени пептиды из почек животных после кровопотери, усиливают агрегабельность тромбоцитов, что на наш взгляд не должно вызывать удивления, так как «постгеморрагические» пептиды должны усиливать агрегабельность тромбоцитов и тем самым ограничивать кровотечение. Однако в серии экспериментов по АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов пептиды почек в основном вызывают гипоагрегабельность тромбоцитов.
В результате наших исследований показано, что пептиды из почек баранов, перенесших кровопотерю, обладают большей коагуляционной и фибринолитической активностью и более выраженной биологической активностью. Последнее проявляется в усилении экспрессии CD-маркеров, особенно у больных людей. В наших исследованиях установлено, что показатели системы коагуляционного гемостаза, а также лимфоцитарно-
тромбоцитарная адгезия больше изменялись при введении «опытных » пептидов.
литература
1. Анохин П.К. Узловые вопросы теории функциональных систем / П.К. Анохин. — М. : Наука,
1980. — 196 с.
2. Вальдман А.В. Нервная система и гомеостаз / А.В. Вальдман ; под ред. П.Д. Горизонтова // Гомеостаз. — М., 1981. — С. 29 — 73.
3. Горизонтов П.Д. Гомеocтаз, его механизмы и значение / П.Д. Горизонтов // Гомеостаз. — М.,
1981. — С. 5 — 28.
4. Коняев Б.В. Кровопускание / Б.В. Коняев,
B.Э. Салищев // БМЭ. — 1980. — Т. 12. — С. 239 — 241.
5. Кузник Б.И. Теоретические и клинические аспекты биорегулирующей терапии в хирургии и травматологии / Б.И. Кузник. — Новосибирск : Наука, 2008. — 311 с.
6. Кузник Б.И. Иммуногенез, гемостаз и неспецифическая резстентность организма / Б.И. Кузник, Н.В. Васильев, Н.Н. Цыбиков. — М. : Медицина, 1989. — 320 с.
7. Кузник Б.И. Иммунный ответ и система гемостаза / Б.И. Кузник, Ю.А. Витковский // Проблемы физиологии и патологии системы гемостаза.
— Барнаул, 2000. — С. 119—127.
8. Кузник Б.И. Взаимосвязь между иммуногенезом и системой гемостаза: единая защитная система организма / Б.И. Кузник, Н.Н. Цыбиков // Успехи современной биологии. — 1981. — № 2. — С. 243 — 260.
9. Сепиашвили Р.И. Функциональная система иммунного гомеостаза / Р.И. Сепиашвили // Аллергология и иммунология. — 2003. — Т. 4, № 2. —
C. 5—14.
10. Risse G.B. The renaissance of bloodletting: a chapter in modern therapeutics / G.B. Risse. // J. Hist. Med. — 1979. — Vol. 34, N 1. — P. 3 — 22.
11. The treatment of Forphyria Cutanea Tarda by venesection / C.A. Ramsay [et al.] / Quart. J. Med. — 1974. — Vol. 43. — P. 1—29.
сведения об авторах
Цыбиков Намжил Нанзатович - д.м.н., профессор, зав. кафедрой патологической физиологии ЧГМА (454092, Челябинск, ул. Воровского, 64)
Тарнуев Владимир Абогоевич - к.м.н., доцент, зав. кафедрой традиционной медицины ИГИУВа (670047, г Улан-Удэ, ул. Пирогова 30а)
Гармаева Оюна Жоржевна - врач-рефлексотерапевт РКГВВ (тел.: 8 (950) 387-04-13; д.т. 8 (3012) 55-03-83; е-таИ: ogz18@ mail.ru)
Есаулова Ирина Николаевна - врач-рефлексотерапевт РКГВВ, асс. кафедры традиционной медицины ИГИУВа (670047, г Улан-Удэ, ул. Пирогова 30а)
Доржаева Дыжитма Доржиевна - врач-рефлексотерапевт РКГВВ (670047, Улан-Удэ, Пирогова, ул. 30а)
