CC BY
203
УДК: 577.1:616.9-084
Н.Р. Телесманич, З.И. Микашинович, Н.С. Ломаковский, Т.Д. Лосева, С.О. Чайка
БИОХИМИЯ ВИРУСА ЭБОЛА И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ АСПЕКТЫ
БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ
ГБОУ ВПО Ростовский государственный медицинский университет Минздрава России,
кафедра общей и клинической биохимии № 1, Ростов-на-Дону, Россия.
В статье представлены результаты комплексной аналитической работы по научным и прикладным исследованиям отечественных и зарубежных ученых за последние 10 лет, включая изучения 2014 г. по РНК-геномным возбудителям лихорадок Эбола и Марбург. Представлены современные представления по биохимическому строению Марбург и Эбола, структура которых схожа по количеству и размещению основных протеинов — NP-VP35-VP40-GP-VP30(35)-VP24-L, но несколько отличается по антигенам, что обуславливает отсутствие перекрестных серологических реакций. Представлен цикл репликации вирусов, изучение которого является основой для формирования молекулярных аспектов создания терапевтических стратегий для филовирусных лихорадок. В концептуальном плане представлены современные представления о функционировании интерфероновой защиты макроорганизма и блоке системы интерферона, которую вызывают филовирусы. Представлена стратегия лечения и научные достижения в области конструирования вакцин.
Ключевые слова: вирус Эбола, вирус Марбург, филовирусные лихорадки.
N.R. Telesmanich, Z.I. Mikashinovich, N.S. Lomakovskij, T.D. Loseva, S.O. Chayka
BIOCHEMISTRY OF EBOLA VIRUS AND MOLECULAR MECHANISMS
OF BIOLOGY PROTECTION
SBEIHPE Rostov state medical university Ministry of Health protection of Russia, department of common and clinical biochemistry №1, Rostov-on-Don, Russia.
The article contains the results of integrated analytic literature review on scientific and applied researches of national and foreign scientists in the past decade including investigations of 2014 year on RNA-genome causative agents of Ebola and Marburg fever. Modern concepts on biochemical structure of Ebola and Marburg are demonstrated here; the structure of both viruses has the same number and location of main proteins — NP-VP35-VP40-GP-VP30(35)-VP24-L, but has difference in antigens that determine absence of cross-serological reactions. The article contains the cycle of virus replication the studying of one is basic in forming of molecular aspects of therapeutic strategies creation for filoviridae fevers. Modern data of interferon protection action on macroorganism and block in interferon system induced by filoviridae are bringing to you attention. The strategy of treatment and scientific advances in vaccine design is presents here.
Key words: Ebola virus, Marburg virus, filoviridae fevers.
РНК-содержащие ретровирусы — возбудители геморрагических лихорадок семейства филовиру-сов (Filoviridae) разделены на два рода: Эболавирус и Марбургвирус, являются возбудителями высококонтагиозных геморрагических лихорадок, отнесены к особо опасным инфекциям I группы патоген-ности. По МКБ-10 код А98.4. степень опасности вирусов Эбола и Марбург соотносимы со степенью опасности чумы, которая относится к I группе па-тогенности среди бактериальных инфекций. Представителей рода Эболавирус разделяют на четыре вида: Zair ebolavirus (вирус Эбола Заир), Sudan ebolavirus (вирус Эбола Судан), Reston ebolavirus (вирус Эбола Рестон), Yvory Coast ebolavirus [1, 2].
Первый открытый РНК-геномный представитель этого семейства — вирус Марбург - был впервые выделен в 1967 году в Германии. Выделение вируса было связано с внутрилабораторным заражением сотрудников, инфицированных привезенными из Уганды зелеными мартышками. Заражение от африканских мартышек произошло в результате работы исследователей с клеточными культурами почек этих животных. Наблюдали 31 случай с семью летальными исходами. Пять случаев лихорадки Марбург возникли среди медицинского персонала, имевших прямой контакт с кровью больных сотрудников лаборатории и один случай наблюдали у жены переболевшего сотрудника, вирус был выделен из его семенной жидкости через три месяца после его заболевания [3]. Однако, выделить вирус Марбург от обезьян, живущих в природе, не удавалось. Антитела же к вирусу обнаруживались у мартышек, бабуинов, человекообразных обезьян. Все это говорит о том, что у обезьян инфекция протекает инапарантно. Вирус Марбург, как и другие представители арбовирусных природноочаговых инфекций, размножается в комарах Aedes aegypti. Зеленые мартышки, от которых произошло заражение, имеют латинское название Cercopithecus aethiops, что обусловливает ешР одно название болезни — церкоптековая лихорадка. РНК-геномный вирус Марбург выделен Р.Зигертом в 1967 г. [4].
Несмотря на то, что вирус циркулирует в природных очагах Африки, первые вспышки заболевания (не считая внутрилабораторного заражения) были зафиксированы в Европе — Германия, Югославия (Марбург, Франкфурт на Майне, Белград), имели завозной характер [5].
В мае 2004 года при проведении экспериментов с вирусом Эбола была инфицирована и погибла сотрудница отдела особо опасных инфекций Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Кольцова, Россия), это также пример внутрилабораторного заражения. Однако система зашиты вирусологического центра, включающая организационную работу и технические условия, были настолько хорошо поставлены, что ситуация была купирована и оставалась секретной до 2014 года, пока перед миром не возникла опасность Эбола, которая в настоящее время требует использования любого бесценного опыта, в основе которого лежит жизнь людей. Больше случаев на территории России не наблюдалось, что свидетельствует о том, что вспышки могут быть
связаны с завозом вируса или с опасностью работы в лабораториях.
РНК-геномный вирус Эбола открыт в 1976 году в период одновременных вспышек в двух странах Заире и Судане. Заир — нынешняя демократическая республика Конго, вспышка была в районе реки Эбола, что и дало название вирусу. Природные очаги циркуляции вируса располагаются в зоне влажных тропических лесов центральной и западной Африки. Инфицирования людей вирусом связывают с прямым контактом с обезьянами. Вирус обнаруживается в мертвых антилопах, дикобразах, шимпанзе. Антитела к вирусу обнаружены у сво-бодноживущих обезьян, предполагают, что, подобно людям, обезьяны инфицируются непосредственно из природного очага [6].
Еще одна разновидность вируса Эбола — вирус Рестон (RESTV). РНК-геномный вирус выделен в 1989 году в городе Рестон, Вирджиния. Отличается от вируса Эбола отсутствием патогенности для человека, чем может претендовать на основу для разработки вакцин. Вирус Рестон был выделен от обезьян циномолгус (М нсаса fasicularis), которых привезли в Вирджинию из исследовавательский лабораторий США. Вспышки регистрируются, в основном, от обезьян. Заражение четырех людей, контактировавших в питомнике с больными обезьянами, характеризовалось отсутствием клинических симптомов [7]. На сегодняшний день не зарегистрировано ни одного случая болезни (или смерти) человека вирусом Рестон.
Последняя вспышка лихорадки Эбола началась в Гвинее и охватила Либерию, Сьерра-Лионе и Нигерию. Общее число случаев в этих странах составило 3069, из которых 1427 закончились летальным исходом. Начало эпидемии объявили 21 марта 2014 г., когда лаборатория ВОЗ выделила и идентифицировала вирус с помощью ОТ-ПЦР. Секвенирование фрагмента гена вируса показало сходства с подтипом Zair. В этот период в стране, помимо эпидемии Эбола, зарегистрированы эпидемии холеры, менингита, кори. Этот факт является интересным, т.к. вирус Эбола сходен по строению с вирусом кори.
Возбудитель Заир вируса Эбола наиболее вирулентный среди пяти известных подтипов. Дальнейшие исследования полученного штамма показали наличие филогенетических отличий, позволяющих выделить его в новую самостоятельную таксономическую группу, близкую к подтипу Заир (идентичность генома — 97%) [8].
Необходимо отметить, что непрекращающаяся вспышка в Сьерра-Леоне, по данным специалистов, связана с тайными захоронениями, где контактировавшие с усопшими остаются без внимания медицинских работников.
Для создания эффективных вакцинных терапевтических препаратов и диагностических препаратов необходимо тщательное изучение молекулярных аспектов строения и репликации вирусов, а также биохимических механизмов защиты макроорганизма.
Трудность решения этой задачи усугубляется тем, что из-за высокой котнагиозности филовиру-
сов работа с ними опасна, требует соблюдения всех мер предосторожности и наличия лаборатории с высшей степенью защиты персонала (Р-4).
В данной ситуации аналитическая работа, связанная с обобщением литературы и последних достижений, приобретает немаловажное значение в формировании концепций жизнедеятельности вируса и его взаимоотношения с эукариотическими клетками.
Цель работы: анализ современной литературы и обобщение опыта исследований биохимии механизмов защиты макроорганизма, строения и репликации вирусов Эбола и Марбург, а также известных молекулярно-биологических подходов к конструированию вакцин и лечебных препаратов.
Биохимическое строение вирусов Марбург и Эбола.
Вирус Марбург имеет общие черты строения с рабдовирусами, с вирусами кори и бешенства [9]. Геномы вирусов Марбург и Эбола представлены в виде одноцепочечной сегментированной РНК негативной полярности и являются самыми большими среди отряда Mononegavirales, к которым они относятся. Геномная РНК кодирует семь структурных белков от 3' к 5' концу. В отличие от других представителей отряда, содержат четыре нуклео-капсидных белка вместо трех — NP, VP30, VP35 и L, они же являются структурными, необходимыми для репликации [10].
В отличие от других вирусов, имеющих округлую форму, вирусы Эбола и Марбург длинные, «червеподобны» и очень крупные, длина их составляет: у Марбург — 800-1400 нм (инфекционная активность 790 нм); Эбола в длину 665 нм, диаметр 70-100 нм. Внешне напоминают рабдовирусы, но не имеют антигенного родства с ними. Длина генома и 19200 нуклеотидов, имеющих ММ 4,2 МДа.
В состав вириона входит поверхностный белок GP, представляющий собой гликопротеиновые рецепторы для слияния с мембраной клетки хозяина, матриксные белки (VP40 и VP24) и четыре белка нуклеокапсида (NP, VP30, VP35 и L). Нуклеокап-сидные и матричные белки в результате взаимодействия с организмом млекопитающего «оборачиваются» в липидную оболочку, формирующуюся из плазматической мембраны клетки хозяина. Матричные белки VP40 и VP24 связаны с центральным рибонуклеопротеидным кором с одной стороны, а, с другой, с гликопротеин-несущим двойным липидным слоем, образуя липопротеиновую мембрану толщиной 20-30 нм, полученным из клетки человека, и локализуются на внутренней стороне сформировавшейся липидной мембраны VP40, поэтому является наружным белком нуклеокапсида — «вирусного ядра». VP24 — играет роль в «раздевании» вируса при проникновении в клетку.
Рибонуклеопротеидный кор состоит из геномной РНК и капсидирующих ее нуклеопротеинов (белков нуклеокапсида) — NP и VP30; два других белка нуклеокапсида - VP35 и L связываются с NP, который связан непосредственно с РНК, образуя комплекс репликации вируса. L-белок является РНК-зависимой РНК-полимеразой — самый большой по размеру белок, его функция — син-
тезировать матричные РНК с вирионной РНК, и на поздней стадии саму вирионную РНК на матрице, порядок расположения которых следующий: 3-лидер-NP-VP35-VP40-GP-VP30(35)-VP24-L-трейлер.
На поверхности вириона гликопротеин GP-трансмембранный белок формирует шипы-рецепторы длиной 7-10 нм. Это единственный поверхностный белок вирионов Марбург и Эбола. Один из участков этого белка похож по структуре и свойствам на фрагменты вирусов иммунодефицита человека (ВИЧ). Предполагается, что это и является одной из причин высокой патогенности фило-вирусов.
Белки, ассоциированные с нуклеокапсидом, участвуют в транскрипции и репликации генома, а белки, ассоциированные с оболочкой, необходимы при сборке вириона и связывании с рецепторами эукариотической клетки при проникновении [10, 11,12, 13, 14].
Хотя вирус Эбола схож с вирусом Марбург по количеству и размещению основных протеинов, но существующие антигенные отличия между ними, в частности, в размерах структурных белков, обусловливают отсутствие перекрестных серологических реакций, что, с одной стороны говорит о необходимости конструирования узкоспецифичных тест-систем, направленных на каждый из вирусов, для применения специфической этиотропной терапии, которая в настоящее время носит экспериментальный характер, с другой стороны, тест-системы, направленные на обнаружение семь филовирусов без узкой специализации внутри рода, уже могут быть эффективным методом диагностики в комплексе с клиническими проявлениями. Вирус Эбо-ла содержит поверхностный гликопротеин GP, который, в отличие от Марбург, может обнаруживаться в растворимой форме и оказывать прямое разрушающее действие на клетки кровеносных сосудов человека, следствием чего является резкое повышение проницаемости сосудов и массивное кровотечение.
Цикл репликации филовирусов
Для того, чтобы вирус Эбола попал в клетку и начал цикл воспроизведения, необходимы рецепторы NPC1, протеины, которые транспортируют холестерол. В связи с этим было высказано предположение, что мутации гена NРC1 у некоторых людей могут делать их невосприимчивыми к геморрагической лихорадке Эбола [15]. К настоящему времени описано большое количество возможных рецепторов для связывания и проникновения фи-ловирусов в клетки мишени, в том числе большой класс рецепторов С-лектинов эукариотических клеток. После адсорбции на рецепторах клетки-мишени, при помощи рецепторов-«шипов» GP, происходит проникновение филовирусов в клетку при помощи эндосом. Протеолитический фермент, ингибитор катепсина, эндосомы клетки-хозяина, участвуют в процессе высвобождения вирусного нуклеокапсида и защищают каскад конформацион-ных изменений — рецепторов вируса GP. Все это
приводит к слиянию мембран вируса и эндосомы и высвобождению вирусного нуклеокапсида в цитоплазму клетки [16].
Транскрипция и репликация филовирусов проходят в цитоплазме инфицированных клеток. В процессе транскрипции синтезируется семь моно-цистронных полиаденилированных субгеномных мРНК, комплементарных геномной РНК, каждая из которых кодирует один из вирусных белков [17]. Синтез мРНК белка NP вируса Эбола наблюдается в клетках через 7 ч, аналогичной мРНК вируса Марбург — через 12 ч после инфицирования. Через 18 ч в общем пуле РНК определяются мРНК, кодирующие другие вирусные белки. Трансляция вирусных белков осуществляется белоксинтезиру-ющей системой клетки-хозяина либо на рибосомах, связанных с шероховатым эндоплазматическим ре-тикуломом (белки GP, NP), либо на свободных рибосомах цитоплазмы клеток [10].
РНК-зависимая РНК-полимераза L филовиру-сов в комплексе с кофакторами осуществляет процессы репликации, транскрипции, полиаденили-рования и, по-видимому, кепирования вирусных субгеномных мРНК.
Процесс репликации осуществляется тем же полимеразным вирусным комплексом (белки VP24, VP35 и L-РНК-зависимая РНК-полимераза), что и процесс транскрипции. Вновь синтезированная геномная РНК инкапсидируется белком NP и формирует вирусный рибонуклеопротеин, на основе которого формируются новые вирусные частицы [18].
Образование зрелых вирусных частиц включает в себя стадии сборки нуклеокапсида и дальнейшей инкапсуляции в оболочку, из плазмолеммы инфицированной клетки, с которой ассоциированы молекулы поверхностного гликопротеина вируса GP (рецептора) и матриксного белка VP40. Механизмы сборки вирионов филовирусов еще не достаточно понятны, однако исследования последних лет показали, что сборка нуклеокапсида происходит в цитоплазме клеток-хозяина, после чего вирус выходит во внеклеточное пространство посредством почкования [18].
Молекулярные механизмы защиты от филовирусов
В настоящее время накоплено небольшое количество данных по биохимическим процессам, протекающим в макроорганизме в результате инфицирования филовирусами. Это объясняется тем, что вспышки заболевания происходят в регионах, удаленных от клинических лабораторий, в которых работает высококвалифицированный персонал. Таким образом, основные данные по биологической защите получены на моделях морских (nonhuman primates) обезьянах. Установлено, что филовиру-сы блокируют иммунный ответ организма и «защищают» клетки, в которых они реплицируются от разрушения иммунной системой. Реплицируются вирусы Эбола и Марбург в моноцитах, макрофагах и дендритных клетках. Инфицированные фи-ловирусами клетки выделяют большое количество
хемокинов и цитокинов, к которым относятся ин-терлейкины и интерфероны, чем запускают каскад прокоагулятивного белкового тканевого фактора (procoagulant protein tissue factor), что нарушает систему свертывания крови и повреждает сосуды. Поражение дендритных клеток вызывает их аномальное созревание, следствием этого является неполноценный алаптивный иммунный ответ В и Т лимфоцитов, приводящий к неконтролируемому распространению и росту вирусов в организме. Лимфоцитов в крови становится меньше, наблюдается дегенерация лимфоидной ткани.
На ранних стадиях появляются факторы воспаления в виде увеличения количества цитокинов: интерферона-а (ИФН-а), интерлейкинов (IL-6), белков воспаления макрофагов (MYP-1a, MIP-1Р); на поздних стадиях появляется интерферон р, у, интерлейкин-18, неспецифический фактор воспаления, характерный для особо опасных инфекций — чумы, туляремии — TNF-a. В то же время уменьшается уровень IL-4, IL-8, IL-10. Цитокины воспаления действуют системно, индуцируют клинические проявления. При высоких концентрациях факторы неспецифической защиты организма — цитокины, интерлейкины — токсичны, они запускают каскад коагуляции, происходит выброс IL-6, TNF-a и оксида азота (NO), нарушение целостности кровеносных сосудов и гомеостаза [16].
Система интерферона (ИФН)
Изучение действия представителей арбовиру-сов, к которым относятся Марбург и Эбола, на систему интерферона, показало существование множества механизмов подавления индуцируемого ими антивирусного ответа [19].
Представители арбовирусов являются индукторами ИФН I типа (а), который синтезируется в лейкоцитах. Фибробласты, в ответ на вирусные, дву-спиральные РНК, являются продуцентами р-ИФН. Т-лимфоциты вырабатывают у-интерферон.
Все эти клетки оказываются повреждены в результате инфицирования Эбола и Марбург. Вирусы нарушают клеточный механизм индукции ИФН-зависимых генов, действуя на активацию сигнальных факторов транскрипции STAT [20].
Вирусные белки, описанные выше, взаимодействуют с тирозиновыми киназами и препятствуют их фосфорилированию, возникает блок активности системы ИФН на этапе передачи сигналов антивирусным клеточным генам, обеспечивая необходимые условия для вирусной репродукции. В механизме индукции участвуют интерферон-регу-лируемые эндогенные факторы (IRF) и Tool-like рецепторы (TLR); РНК-геномные вирусы взаимодействуют с Tool-like рецепторами на клеточной поверхности. В индукции синтеза ИФН участвуют сигнальные киназы и РНК-хеликазы, передающие сигналы на ИФН-регулируемые эндогенные факторы (IRF). Рецепторы для ИФН ассоциированы с тирозиновыми киназами, которые активируют латентные факторы транскрипции (STAT1 и STAT2). В результате происходит индукция транскрипции ИФН-зависимых генов антивирусных белков.
Биохимия антивирусного действия включает процессы избирательного подавления транскрипции и трансляции вирусных РНК в зараженных клетках при помощи комплекса ферментативных систем: протеинкиназы, изоформы (2''-5''-оли-гоаденилатсинтазы); 2-5А-активируемая рибону-клеаза, аденозиндезаминаза, NO-синтаза, белки ГТФ-азы [21, 22].
Интерфероны являются важными цитокина-ми, контролирующими развитие вирусных инфекций. Известные виды человеческих интерферонов разделены на два типа. ИФН I типа объединяют семейство лейкоцитарного а-ИНФ, кодируемых 20 генами человека; и фибробластный р-ИФН (один ген и одна мРНК). Все гены ИФН типа I локализованы в 9 хромосоме человека, взаимодействуют с а и p-рецепторами. К ИФН II типа относится иммунный у-ИФН — 12 хромосома человека, содержит интроны, более сложно устроен, чем а-ИФН, взаимодействует с а-рецепторами.
Арбовирусы, к которым относят Эбола и Марбург, индуцируют ИФН I типа, синтезируется а-ИФН.
Несмотря на то, что филовирусы подавляют выработку интерферонов в макроорганизме, вместе с тем, они обладают довольно высокой чувствительностью к действию ИФН в профилактической схеме применения. Эффективность антивирусного действия значительно снижается, когда препараты ИФН вводятся после вирусного заражения [19].
Молекулярные аспекты создания терапевтической стратегии филовирусных лихорадок.
Познание биохимических основ строения, репликации вирусов Эбола и Марбург, а также системы блокирования ими выработки интерферо-нов позволяет разрабатывать пути лечения этих инфекций, однако, на сегодняшний день пока не существует эффективной схемы лечения.
Существующие приемы включают применение интерферона-а, гепарин, сыворотку реконвалес-центов, специфический антивирусный иммуноглобулин лошадей [23].
В плане гипотез разработки этиотропной терапии показана возможность регуляции цитокино-вого ответа; получены моноклональные антитела к TNF-а; используют десферал — антагонист IL-1 и TNF-а, эффективность этих средств показана на модели морских свинок [16].
В плане развития этиотропной терапии, направленной непосредственно на возбудитель, перспективной является воздействия на этапы репликации филовирусов — показано, что синтетические пептиды, имитирующие сайт слияния на рецепторах GP вируса блокируют слияние вирусной и клеточной мембраны; ингибиторы катепси-на, фермента эндосом, участвующего в процессе высвобождения вирусного нуклеокапсида, снижают репликацию вируса [23].
Относительно новая технология РНК-интерференции позволяет in vitro ингибировать экспрессию целевого гена-мишени с помощью двухцепочечных коротких РНК длиной 21-23 нм,
которые имеют те же последовательности, что и мРНК, транскриптируемая с гена-мишени. Целью для интерфирирующих РНК является РНК-зависимая РНК-полимераза, т.е. L-белок вируса
[23].
Показано также использование антисмысловых олигонуклеотидов (АСОН), принцип которых применяется для лечения онкологических заболеваний, в данном случае использовали комбинацию антисмысловых фосфородиамидат-мор-фолино-олигомеров (РМО), которые нацелены на многочисленные вирусные гены — они замедляют репликацию вируса Эбола, чем предоставляют время организму для развития защитных иммунных реакций и выведения вируса, эффективность показана на модели макак-резусов и на морских свинках. Такие антисмысловые РМО действительно могут привести к появлению высокоэффективной схемы лечения [14].
В настоящее время применяют коктейль из:
• Трех моноклональных антител - z-mapp производства «Mapp Biopharmaceutical Inc» (США), одни из них получены в 2005 году к фактору воспаления TNF-а. TKM-Ebola — комбинация интерферирующих РНК, направленных на L-протеин РНК-полимеразы вируса «Tekmira Pharmaceutical Corp» (Канада).
• Favipiravir — ингибитор РНК-зависимой РНК-полимеразы (Япония).
• Brincidofovire — липидный конъюгат цифо-вира «Chimerex» (США).
• Триазавирин, умифеновир — подавляет активность РНК вируса.
Однако, по информации о вспышке 2014 г., отмечается, что официально разрешенных к применению препаратов нет, рекомбинантные терапевтические моноклональные антитела z-mapp прошли первые стадии клинических испытаний, получены первые положительные результаты клинического применения моноклональных антител «z-mapp» [24].
Однако, по данным на 2014 г. [8], отмечается, что ни один из имеющихся лекарственных препаратов не способен обеспечить надежную защиту от инфекций, вызываемых филовирусами, поэтому важное значение придается патогенетической терпии, направленной на синдромы: геморрагический, диссеминированного внутрисосудистого свертывания, вторичного иммунодефицита, купирования интоксикации, нарушения гемокоагу-ляции, повышения иммуноспецифической резистентности, предупреждения ассоциированных инфекций.
Для этого используют свежезамороженную плазму (желательно реконвалесцентов; для купирования шоковых состояний применяют метод гемодилюции (коллоидные растворы); большие дозы аскорбиновой кислоты, витамин Р, сосудистые аналептики, антибиотики фторхинолонового ряда для купирования оппортунистических инфекций, а также болеутоляющие, противорвотные средства, успокаивающие средства.
Молекулярные принципы создания вакцин против вирусов Эболы и Марбург
В недалеком прошлом создание вакцин против филовирусов не представляло коммерческого интереса из-за небольшого ареала распространения данного заболевания. Однако последние вспышки филовирусных геморрагических лихорадок с высоким уровнем летальности, а также возможность применения филовирусов в качестве биотеррористического оружия поднимают вопрос о необходимости эффективной вакцины. Такая вакцина необходима, прежде всего, медицинскому персоналу, работающему в районе эпидемии, исследователей, военных [16]. Было показано, что благоприятный прогноз в ходе филовирусной инфекции коррелирует со скоростью активации организмом иммунного ответа. Следовательно, необходима такая стратегия вакцинации, которая позволяет быстро и эффективно активировать как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ [23]. Традиционные методы вакцинации с использованием ослабленных (аттенуированных) вариантов вируса Марбург и инактивированных препаратов вируса Эбола, по соображениям безопасности для первого варианта, и низкой эффективности для второго, оказались неприемлемы для использования [25].
Первые попытки разработки вакцин связаны с получением рекомбинантных вирусов, содержащих поверхностный белок — рецептор GP.
Более обнадеживающие результаты получены при совместном использовании ДНК вакцин и ре-комбинантных белков вирусов. Опыты по защите проводили на моделях мелких животных, однако на приматах эффективность защиты оказалась меньше.
Группа ученых [16] в 2005 году разработали стратегию получения искусственных вирусоподобных частиц Эбола и Марбург, содержащих основной белок матрикса VP-40 и рецепторный белок GP. Такие частицы близки по морфологии нативному вирусу, но не содержат генетического материала, поэтому абсолютно безопасны, и способствуют активации клеточного иммунитета. Такие искусственные вирусы связываются с дендритными клетками макроорганизма — (основной мишенью вируса) и активируют первое звено клеточного ответа. Эксперименты по изучению защитных свойств искусственных вирусов проводили на моделях мышей и морских свинок.
Следующий подход к разработке вакцин — это вирусные векторы (инструмент внедрения генетического материала в клетку). Для этого конструируют две ДНК плазмиды на основе ДНК — копии вирусов. Первая плазмида — содержит гены неструктурных белков репликации вируса, вторая — гены целевых белков вируса — эту конструкцию называют репликоном. Другая конструкция—по-
мощник — содержит полноразмерную ДНК — копию с делецией на 5'-конце, что препятствует образованию инфекционного потомства, но может синтезировать структурные белки. Такая векторная система индуцирует иммунный ответ. Обезьяны, иммунизированные таким репликоном — вектором были защищены от вируса Марбург, но не Эбола [26].
Эффективной стратегией разработки вакцин являются методы обратной генетики- когда в качестве основного носителя«вектора» вакцины используют другие вирусы: так, например в качестве вектора-носителя антигенов филовирусов, был использован аденовирус [27]; вирус везикулярного стоматита [28], вирус парагриппа [29]
В 2000 году группа авторов [27] создала новую вакцину против вируса Эбола, на основе ре-комбинантной вакцины на основе аденовируса, дефектного по собственному циклу репликации — стратегия «Priming-boosting». Вакцину вводили обезьянам на протяжении 6 месяцев, и все животные выжили, после инфицирования вирусом. Так же наблюдался высокий титр специфических антител после вакцинации и адекватная активация всех звеньев клеточного и гуморального иммунного ответа.
В качестве вектора — носителя вакцины был использован вирус везикулярного стоматита [28]. В вирус были встроены гены рецепторного глико-протеина GP Эбола и Марбург. Рекомбинантные вирусы были способны реплицироваться в организме хозяина, но не обнаруживались в биологических жидкостях. После их введения обезьянам было произведено заражение Эболой и Марбург. Все животные не показали клинических симптомов вирусов, что свидетельствовало об эффективности новых разработок вакцин.
Данная стратегия получила своё развитие в исследованиях русских ученых — Букреева А.А, Волчкова В.Е., Блинова В.М. Методами обратной генетики в полноразмерную копию вируса парагриппа человека 3-го типа были встроены два гена вируса Эбола — NP (белок нуклеотида) и GP (белок-рецептор). Вирус накопили в культуре клеток «invitro» и иммунизировали морских свинок. Все животные выжили, и у них регистрировался высокий титр антител к GP (белки-рецепторы). Необходимы опыты по эффективности и безопасности на обезьянах и людях [30].
Таким образом, на основе полученных новых знаний о молекулярно-биохимических свойствах вируса, за последнее время был получен ряд весьма перспективных рекомбинантных вакцин на основе различных вирусных векторов. В то же время требуется дополнительные исследования для подтверждения безопасности применения у человека таких дефектных по репликации векторов и созданных на их основе вакцин.
ЛИТЕРАТУРА
1. Feldmann H., Geisbt T.W., Yahing P.B. et al. // Virus taxonomy: Vlllth Report of International Committee on Taxonomy of Viruses. - London: Elsevier-Academic press, 2004. - P.645-653.
2. Swanepol R. Studies of reservoir hosts for Marburg viruses / R. Swandepol, S.B. Smit, P.E. Rollin et al. // Energ. Infect. Dis. -2007. - Vol.13, №12. - P.1847-1851.
3. Маркин В.А., Марков В.И. Вирусные и геморрагические лихорадки - эволюция эпидемического потенциала // Журн. микробиол. - 2002. - №1. - С.91-98.
4. Покровский В.И. Инфекционные болезни и эпидемиология. -2007.
5. Борисевич И.В. и др. Неэндемические и экзотические вирусные инфекции: этиология, диагностика, индикация, профилактика / под ред. С.В. Борисевича, Е.Н. Храмова, А.Л. Ковтуна. - 2014.
6. Руководство по вирусологии. Вирусы и вирусные инфекции человека и животных / под ред. академика Д.К. Львова. - М.: МИА. - 2013. - С.805-807.
7. Бутенко А.М. Арбовирусы и арбовирусные инфекции: основные события и открытия последних лет. А.М. Бутенко // Материалы расширенного пленума проблемной комиссии «Арбовирусы» и научно-практической конференции «Арбовирусы и арбовирусные инфекции», Астрахань 17-20 октября 2006 г., Москва 2007.
8. Пирожков А.П., Тимофеев М.А., Борисевич И.В. Эпидемиологические особенности вспышки лихорадки Эбола в западной Африке в 2014 г. // Вклад государств-участников содружества независимых государств в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия населения в современных условиях Материалы XII Межгосударственной научно-практической конференции 25-26 ноября 2014 г., Саратов.
9. Kuhn Y.N., Becker S., Ebihara H. et al. Virus Taxonomy. The Classification and Nomenclature of Virus. // Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of viruses. - Elsevier Acad. Press. - 2012. - P.665-671.
10. Feldmann H., Klenk H.-D. Marburg and Ebola viruses // Adv. Viruses Res. - 1996. - Vol.47. - P.1-52.
11. Muhlberger E. Comparison of the transcription and replication strategies of Marburg virus and Ebola virus by using artificial replication system / E. Muhlberger, M.Welk, V.E. Volchkov, H. Klenk // J. Virolog. - 1999. - Vol. 73, №3. - P.2333-2342.
12. Noda T., Sagara H., Suzuki E. et al. Ebola virus VP40 drives the formation of virus-like filamentous particles along with GP // J. Virolog. - 2002. - Vol. 76, №10. - P.4855-4865.
13. Bukreyeo A.A., Volchkov V.E., Blinov V.M. et al. The complete nucleotide sequence ofthe Popp (1967) strain of Marburg virus a comparison with the Musoke (1980) strain // Arch. Virol. - 1995. -Vol.140, №9. - P.1589-1600.
14. Борисевич И.В., Борисевич С.В., Грабарев П.А., Ковальчук А.В., Кононова М.С. Неэндемические и экзотические вирусные инфекции: этиология, диагностика, индикация, профилактика. - М.:Комментарий. - 2014.
15. Субботина Е.Л., Чепурнов А.А. Молекулярные механизмы репродукции вируса Эбола // Вопросы вирусологию - 2007. -№1. - С.16.
16. Hensley L.E., Jones S.M., Feldman H. et al. Ebola and Marburg viruses: pathogenesis and development of countermeasures // Curr. Mol. Med. - 2005. - Vol.5, №8. - Р.761-762.
17. Feldmann H., Muhlberger E., Randolf A. et al. Marburg virus, a filovirus: messenger RNAs, gene order, and regulatory elements of the replication cycle // Virus Res. - 1992. - Vol.24, №1. -P.1-19.
18. Feldmann H., Kiley M.P. Classification, structure and replication offiloviruses // Curr. Top. Microbiol. Immunol. - 1999. - Vol.235. -P.1-21.
19. Goodborn S., Didcock L., Randall R.E. Interferons: cell signaling, immune modulation, antiviral response and virus countermeasures // J. gen. virol. - 2000. - Vol.81.- P.2341-2364.
20. Guo J.T., Hayashi J., Suger C. West Nile virus inhibits the signal transduction pathways of alpha interferon // J. virol. - 2005. -Vol.79(3). - P.1343-1350.
21. Samual C.E. Antiviral action of interferons // Clin. Microb. Rev. -2001. - Vol.14(4) - P.778-809.
22. Samuel M.A., Dimond. Alpha-beta interferon protects against lethal WNV infection by restricting cellular tropism amd enhancing neuronal survival // J. Virol. - 2005. - Vol.79(21). -P.13350-13361.
23. Paragas J., Geisbert T.W. Development of treatment strategies to Combat Ebola and Marburg viruses // Exp. Rev. Antiinfect. Ther. -2006. - Vol.4, №1. - Р.67-76.
24. Пирожков А.П., Тимофеев М.А., Борисевич И.В. Эпидемиологические особенности вспышки лихорадки Эбола в западной Африке в 2014 г. // Материалы XII межгосударственной научно-практической конференции 25-26 ноября 2014 г., Саратов.
25. Ignatyev G.M., Agafonov A.P., Streltsova M.A., Kashentseva E.A. Inactivated Marburg virus elicits a nonprotective immune response in Rhesus monkeys // J. Biotechnol. - 1996. - Vol.44, №1-3. - Р.111-118.
26. Pushko P., Parker M., Zudwig G.V. et al. Replikon-helper systems from attenuated Venezuelan equine encephalitis virus: expression of heterologous genes in vitro and immunization against heterologous pathogenesis in vivo // Virology. - 1997. -Vol.239, №2. - Р.389-401.
27. Sullivan N.J., Sanchez A. Rollin P.E. et al. Development of a preventive vaccine for Ebola virus infection in primates // Nature. - 2000. Vol.408, №6812. - Р.605-609.
28. Jones S.M., Feldman H., Stroher U. et al. Live attenuated recombinant vaccine protects nonhuman primates against Ebola and Marburg viruses // Nat. Med. - 2005. - Vol.7. - P.786-790.
29. Bukreev A., Yang L., Zaki S.R. et al. A single intranasal inoculation with a paramyxovirus-vectored vaccine protects guinea pigs against a lethal-dose Ebola virus challenge // J.Virol. -2006. - Vol.80, №5. - Р.2267-2279.
30. Bukreyev A., Yang L., Zaki S.R. et al. A single internosal inoculation with a paraneyrovirus-vectred vaccine protects guinea pigs against a lethal -dose Ebola virus challenge // J.Virol. - 2006. -Vol.80, №5. - Р.2267-2279.
