CC BY
21БИОТЕХНОЛОГИЯ
Е.В. Спиридович, Т.И. Фоменко, А.Б. Власова, Т.В. Мазур, А.Н. Юхимук
БИОХИМИЧЕСКИЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МНОГОКОЛОСНИКА МОРЩИНИСТОГО (AGASTACHE RUGOSA (FISCH. ETMEY.) KUNTZE) В КУЛЬТУРЕ IN VITRO
ГНУ «Центральный ботанический сад НАН Беларуси»
Разработана биотехнологическая схема клеточной селекции многоколосника морщинистого (Agastache rugosa (Fisch. et Mey.) Kuntze), способствующая созданию новых сомаклональных генотипов лекарственных растений с повышенным содержанием биологически активных веществ. Биохимический анализ выявил высокую активность синтеза фенольных соединений и флавонолов в отобранных сомакло-нах c максимальными значениями для сомаклона 11. Разработанная маркерная RAPD+ISSR система дифференцирования генотипов A. rugosa позволила оценить дискретность генотипов сомаклонов, а также исходной формы и идентифицировать сомаклон 11 как наиболее генетически удаленный от исходной формы. Предлагается использовать сомаклоны и разработанную маркерную систему в дальнейшей маркер-сопутствующей селекции сортов с повышенным накоплением фенольных соединений и флавонолов.
Ключевые слова: биотехнология, культура in vitro, Agastache rugosa (Fisch. е( Mey.) Kuntze, сомаклоны, полифенольные соединения, молекулярно-генетические маркеры.
ВВЕДЕНИЕ
Одной из характерных особенностей высших растений является их способность к образованию и накоплению веществ вторичного метаболизма, представленных различными группами соединений. Обозначение «вторичный» указывает на то, что рассматриваемые вещества образуются в метаболическом процессе, не связанном непосредственно с обменом веществ, обусловливающим рост растения. Эти соединения придают растениям специфический аромат, запах и цвет, обладают защитными свойствами в отношении вредителей и возбудителей болезней, а также других неблагоприятных воздействий. В современной литературе обсуждается ряд гипотез относительно роли вторичных метаболитов в функционировании ткани и их способности выполнять роль конституционных и индуцибельных защитных соединений [1]. Кроме этого, вторичный метаболизм рассматривается как процесс детоксикации продуктов первичного метаболизма, а также запасания и транспорта веществ, что в конечном итоге представляет их как защитные метаболиты от абиотических и биотических факторов [2].
В медицине вещества вторичного метаболизма называют биологически активными веществами (БАВ) и именно они, обладая лечебным действием, обусловливают ценность лекарственного растительного сырья. Для решения вопросов, связанных с образованием, метаболизмом и функциями БАВ, широко используются культуры клеток и тканей растений: в качестве модельной системы для фундаментальных исследований клеточных процессов, а также для решения прикладных задач создания новых сортов, производства лекарственных средств и др.
К традиционным способам повышения продуктивности клеток и тканей in vitro относятся клеточная селекция, оптимизация сред, элиситация, использование предшественников синтеза, иммобилизация клеток и др. [3, 4]. Некоторые БАВ удается получить только в культуре клеток. Так, в длительно культивируемых каллуссах мака (Papaver bracteatum Lindl.) с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) в сочетании со спектрофотометрическими методами во всех линиях каллусных тканей был идентифицирован бензафенантридиновый алкалоид сангви-нарин, в то время как в органах растений
in vivo, из которых были получены каллус-ные ткани, сангвинарин не был обнаружен [5]. Эти данные указывают на наличие не только количественных, но и качественных изменений синтеза вторичных метаболитов в культуре ткани. Иногда может оказаться эффективным использование культур органов растений, трансформированных корневых волосков (hairy root) [6] или так называемых плотных каллусных масс (compact callus aggregates, CCA), которые проявляют некоторые уровни клеточной или тканевой дифференциации [7]. Для производства вторичных метаболитов на основе ССА, в частности, получены суспензионные культуры радиолы сахалинской (Rhodiola sachalinensis) [8], радиолы розовой (R. rosea) [9], катарантуса розового (Catharanthus roseus) [10]. Однако в ряде случаев ССА не аккумулировали интересующие метаболиты. Например, в лимоннике китайском (Schizandra chinen-sis) ценные лигнаны присутствуют в околоплоднике и семенах, но, несмотря на то, что чешские ученые получили ССА из цветочных почек S. chinensis, накопления лигнанов в ССА не происходило [11]. В подобных ситуациях необходимо использовать дифференцированные ткани или культуры органов, а иногда и микрорастения. Например, финские ученые показали, что антидепрессанты гиперицин, псевдо-гиперицин и гиперфорин накапливались в значительно больших количествах в микрорастениях зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.), чем в культуре ССА [12]. Таким образом, составление схемы культивирования in vitro является стратегическим моментом в биотехнологии, требующим особого внимания.
Строгой классификации БАВ до настоящего времени не разработано. По химической классификации наиболее значимыми БАВ являются каротиноиды, глюкозинолаты, фитоэстрогены, фитосте-рины, фенольные соединения, ингибиторы протеаз, сапонины, сульфиды, терпены [13]. Фенольные соединения (ФС) - один из важнейших классов вторичных метаболитов, имеющих широкое распространение в растениях. Разнообразие функций ФС в растительной клетке в сочетании с широким спектром биологического действия на живые организмы определяют актуальность и интерес к изучению этого класса соединений [14]. Установлено, что
полифенолы обладают широким спектром протекторных эффектов, включая антиканцерогенное, антимикробное, иммуностимулирующее, антиаллергенное, анти-воспалительное, сосудорасширяющее и антиоксидантное действия. В культивируемых in vitro клетках и тканях растений чайного дерева показана возможность регулировать биосинтез ФС при введении в питательную среду гормоноподобных соединений, которые направленно регулирует синтез определенных типов этих соединений [15]. Ауксины способствуют синтезу растворимых фенольных соединений, в том числе и характерных для чайного растения флавонов, тогда как ци-токинины преимущественно воздействуют на образование лигнина. При этом во всех вариантах происходили лишь количественные изменения в синтезе фенольных соединений, что обусловлено активацией ряда ферментов фенольного метаболизма (фенилаланининаммиаклиазы, оксицин-намоил-КоА-лигазы и др.). Стабильность синтеза вторичных метаболитов неодинакова для различных классов соединений и для различных клеточных культур. Показано, что синтез вторичных соединений значительно изменяется при переходе клеточной культуры к образованию дифференцированных морфогенных структур [16]. В то же время практически отсутствуют данные об изменениях вторичного метаболизма у сомаклонов, полученных при прямом или непрямом морфогенезе в культуре тканей. Немногочисленные литературные данные по этому вопросу противоречивы [17].
При разработке технологий получения лекарственных средств и фармацевтических субстанций растительного происхождения на основе БАВ стоят задачи строгой стандартизации, контроля качества получаемых продуктов с использованием научно-аналитических подходов и методов. Для фармацевтических целей наряду с важной задачей идентификации принадлежности растения к определенному виду перед учеными стоит вопрос предварительной оценки активных фитохимических веществ в сырье. Идентификация/ разработка ДНК-маркеров, которые могут выявлять корреляцию между данными ДНК-генотипирования и количеством селективных фитохимических маркеров у данного вида/сорта/линии растений стано-
вится все более актуальной [17, 18].
На сегодняшний день ДНК-маркеры (AFLP, RAPD, ISSR и др.) были применены для успешного прогнозирования фитохимических свойств у большого числа культивируемых лекарственных растений. Так, с помощью ISSR-маркеров была проведена оценка генетического разнообразия популяций Rhodiola chrysanthemifolia (Crassulaceae), которые позволили выявить высокий полиморфизм (89,7%) генотипами в популяциях [19]. На основе RAPD
- и ISSR - маркеров была выявлена генетическая вариабельность таких культур, как Momordica charantia L. [20], Vanilla planifolia (Orchidaceae) [21]. Генетическое разнообразие - одна из главных характеристик при исследовании и селекции образцов лекарственных растений, которую можно с высокой степенью достоверности оценить с помощью ISSR - маркеров [22].
Род Agastache Horsemint из семейства Яснотковые (Lamiaceae) включает 22 вида, произрастающих в Северной Америке, Мексике, Азии [27]. Два вида: Agastache foeniculum (Pursh.)
O.Kuntze - многоколосник фенхельный (синоним Lophanthus anisatus Benth -лофант анисовый) и Agastache rugosa (Fisch. et Mey.) Kuntze - многоколосник морщинистый используются как пряноароматические и лекарственные растения. Многоколосник морщинистый - многолетнее лекарственное и декоративное растение, распространено в Корее, Китае, Тайване, Вьетнаме и Японии, обнаружено в России на Дальнем Востоке, о. Кунашир (Приморье), входит в 50 фундаментальных растений китайской медицины. Из разных частей многоколосника выделено 71 БАВ, которые обладают широчайшим биологическим действием, от противовоспалительного до противоопухолевого. Agastache rugosa (Fisch. et Mey.) Kuntze является сильнейшим биостимулятором, соперничающим с женьшенем [27-29].
Целью наших исследований являлось получение в условиях in vitro сомаклонов многоколосника морщинистого (Agastache rugosa (Fisch. et Mey.) Kuntze), оценка их по биохимическим признакам - идентификация и изучение состава фенольных соединений, анализ особенностей проявления генетической (сомаклональной и/или эпигеномной) изменчивости с помощью молекулярно-генетических методов.
Научные публикации МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культура ткани. Для введения в культуру in vitro были использованы семена Agastache rugosa (Fisch. et Mey.) Kuntze. Стерильные семена проращивали в темноте при температуре 24оС на среде Мураси-ге-Скуга (МС) [23]. После прорастания семян их переносили на свет в люминостат и культивировали при температуре 23-25оС, освещенности 2500-3000 лк и 16-часовом фотопериоде. Морфогенез: Листовые и стеблевые экспланты одинакового размера культивировали на модифицированной питательной среде МС: тиамина гидрохлорид (2 мг/л), пиридоксина гидрохлорид (0,8 мг/л), гидролизат казеина (500 мг/л), сахароза (20 г/л) с добавлением различных концентраций фитогормонов: кинетин в концентрации 1, 2, 3 и 4 мг/л + 0,2 мг/л ин-долилуксусной кислоты (ИУК); 6-бензила-минопурин (6-БАП) - 1, 2, 3 и 4 мг/л + 0,2 мг/л ИУК, рН среды 5,6-5,8. Культивирование проводили в темноте при температуре 24,5±0,5° С.
Приготовление экстрактов. Навеску сухого материала (1 г) измельчали в фарфоровой ступе и помещали в колбу со шлифом, прибавляли 30 мл 96% спирта этилового и оставляли в темном месте на ночь. Полученный экстракт фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл, далее материал заливали 70% спиртом этиловым и нагревали на водяной бане с обратным холодильником. Время экстракции 30 мин. Экстракцию проводили трижды. Затем фракции объединяли и доводили объем 70% спиртом этиловым до 100 мл.
Определение суммы фенольных веществ проводили с использованием реактива Фолина-Чокальтеу [24]. Для построения калибровочного графика была использована галловая кислота. Измерения проводили на фотоколориметре SOLAR при длине волны 765 нм в кювете толщиной 1 см.
Определение суммы флавонолов:
10 мл исследуемых экстрактов центрифугировали 10 мин при 7 тыс. об/мин, по 5 мл надосадочной жидкости переносили в круглодонную колбу и упаривали на роторном испарителе, приливали 2 мл воды очищенной и затем трижды обрабатывали экстракты диэтиловым эфиром для удаления хлорофиллов и других гидрофобных веществ.
ll
Общий объем пробы для анализа составлял 2,5 мл: 1,5 мл 5% ацетата натрия, 0,5 мл 2% водного раствора хлорида алюминия, 0,5 мл исследуемого образца. Контроль - 0,5 мл этанола и 2,0 мл 5% ацетата натрия.
Калибровочный график построен по рутину. Измерение оптической плотности растворов проводили на фотоколориметре SOLAR при длине волны 440 нм в кювете толщиной 1 см.
Идентификация акацетина в экстракте Agastache rugosa (Fisch. et Mey.) Kuntze и сомаклонов проводилась после кислотного гидролиза. Полный гидролиз гликозида акацетина происходил в условиях конечной концентрации кислоты хлористоводородной 1,5Н в течение 4 часов. Количественное определение содержания акацетина в гидролизированных экстрактах определяли по реакции комплексоо-бразования с хлоридом алюминия. Для этих целей был построен калибровочный график изменения оптической плотности раствора от концентрации стандарта ака-цетина.
Общий объем пробы составлял 5 мл:
0,4 мл 2% хлорида алюминия, 0,05% ака-цетин (10, 25, 50, 100, 150 мкл), спирт этиловый до общего объема 5 мл. Время реакции 30 мин. Оптическую плотность измеряли на фотоколориметре SOLAR при длине волны 471 нм в кювете толщиной 1 см. Измерения проводились против контрольного образца, не содержащего акаце-тин.
Гидролизированные экстракты центрифугировали 15 мин при 12,5 тыс. об/ мин. В реакцию брали от 20 до 200 мкл
гидролизата. Условия проведения реакции аналогичны условиям для построения калибровочного графика.
ВЭЖХ-анализ проводили на хроматографе «Agilent 1100» (США) с диодноматричным детектором. Исследование проводили на обращеннофазовой колонке «С-18» фирмы «Диасфер» (Россия) (250^4 мм) с размером частиц 5 мкм, обьем инжекции - 20 мкл Хроматографию проводили в градиенте вода-ацето-нитрил-метанол по методу H.M. Merken [25]. Регистрация разделяемых веществ осуществлялась при двух длинах волн -270 нм и 325 нм. Идентификацию компонентов осуществляли спектрально в диапазоне волн 220-500 нм.
Молекулярно-генетический анализ сомаклонов Agastache rugosa (Fisch. et Mey.) Kuntze. Для проведения мульти-локусного ДНК-маркирования использовали свежие или зафиксированные при температуре -20°С листья сомаклонов многоколосника морщинистого в культуре in vitro и сомаклонов ex vitro в фазе цветения. Для выделения тотальной ДНК использовали навеску растительной ткани в 0,1 г. ДНК выделяли CTAB-методом с модификациями [26]. Для проведения полимеразой цепной реакции использовали предварительно селектированные праймеры, которые выявляли наибольший полиморфизм между сомаклонами (таблица 1).
ДНК-маркирование проводили с использованием двух техник: RAPD-ПЦР и ISSR-ПЦР.
RAPD-ПЦР проводили в 25 мкл смеси, содержащей 2,5 мкл 10* PCR-буфера
Таблица 1 — Характеристики праймеров, использованных для ДНК-маркирования сомаклонов многоколосника морщинистого
№ Название 5'^3' nN % GT T m
RAPD
1 OPA-03 AGTCAGCCAC 10 60 32
2 OPC-02 GTGAGGCGTC 10 70 34
3 OPP-19 GGGAAGGACA 10 60 32
ISSR
4 UBC-827 ACACACACACACACACG 17 53 52
5 UBC-856 ACACACACACACACACYA 18 46-48 51-54
Примечание:
У — цитозин или тимин; пЫ — количество нуклеотидов;
% GT — процент G+T оснований;
Тт — температура плавления праймера с учетом концентрации солей.
(ОДО «Праймтех», Беларусь), 2,5 мкл 10* смеси dNTP (ОДО «Праймтех», Беларусь), 20 пМ праймера (ОДО «Праймтех», Беларусь), 0,5 ед. ДНК-полимеразы PrimeTaq
96°C — 5 минут
T a — 30 секунд
72°C — 2 минуты
96°C — 30 секунд
T a — 30 секунд
72°C — 2 минуты
96°C — 30 секунд
T a — 30 секунд
72°C — 10 минут
4°C — хранение
(ОДО «Праймтех», Беларусь) и 20 нг ДНК-матрицы. Реакцию проводили в термоциклере Mastercycle Personal (Eppendorf). Устанавливали следующий режим:
}
}
}
начальная денатурация
35 циклов
финальная элонгация
Как Та (здесь и ниже) обозначена температура отжига, при которой праймер комплиментарно связывается с ДНК-матрицей. Та обычно на 2-3°С ниже температуры плавления (Тт) праймера, которая в свою очередь зависит от его нуклеотидного состава.
ISSR амплификацию выполняли в 25 мкл смеси, содержащей 2,5 мкл 10* PCR-
96°C
Ta
72°C
96°C
Ta
72°C
96°C
Ta
72°C
4°C
5 минут 30 секунд 1 минута 30 секунд 30 секунд 1 минута 30 секунд 30 секунд 10 минут Хранение
}
}
}
Электрофоретическое разделение RAPD и ISSR ампликонов проводили с использованием прибора Bioanalyzer 2100 (Agilent). Расчет молекулярных размеров фрагментов осуществляли с использованием пакета специализированного программного обеспечения 2100 Expert (Agilent), попарное сравнение и кластеризацию данных проводили в программе TREECONfor Windows©.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Органогенез Agastache rugosa (Fisch. et Mey.) Kuntze достигнут варьированием гормонов группы цитокининов и ауксинов.
буфера (ОДО «Праймтех», Беларусь), 2,5 мкл 10х смеси dNTP (ОДО «Праймтех», Беларусь), 30 пМ праймера (ОДО «Праймтех», Беларусь), 0,5 ед. ДН^полимеразы PrimeTaq (ОДО «Праймтех», Беларусь) и 20 нг ДН^матрицы. Реакцию проводили в термоциклере Mastercycle Personal (Eppen-dorf). Для проведения реакции устанавливали следующий режим:
начальная денатурация
30 циклов
финальная элонгация
В зависимости от содержания определенных регуляторов роста на листьях и стеблях многоколосника морщинистого наблюдали каллусогенез, индукцию и формирование адвентивных почек и побегов (рисунок 1), либо ризогенез [30].
На морфогенных средах с добавлением 6-БАП в концентрации 1 мг/л и ИУК 0,2 мг/л получен стабильный стеблевой органогенез из каллусной ткани. Полученные при стеблевом органогенезе побеги переносили на питательную среду МС с половинным составом и добавлением ИУК в концентрации 1 мг/л, которые укоренялись и давали начало целым растениям. В результате проделанной работы в ходе
Рисунок 1 - Индукция непрямого морфогенеза и сомаклоны в культуре in vitro
изучения особенностей морфогенеза и влияния различных факторов на развитие изолированных культур была разработана биотехнологическая схема создания и размножения новых форм многоколосника морщинистого с использованием методов клеточной инженерии (рисунок 2).
Сомаклоны проходили адаптационный период в теплице. В дальнейшем вегетация растений проходила на экспери-
ментальных делянках Центрального ботанического сада НАН Беларуси.
Из 36 полученных сомаклонов для биохимического анализа были отобраны растения, которые имели выраженные отличия от родительской формы по морфофизиологическим показателям - сомаклоны 6, 7, 11, 20, 31, 34, 36. Суммарное содержание ФС отобранных сомаклонов представлено на диаграмме (рисунок 3).
Рисунок 2 - Биотехнологическая схема получения сомаклонов многоколосника
морщинистого в культуре in vitro
Рисунок 3 - Суммарное содержание ФС в растении многоколосника морщинистого и
полученных сомаклонов
Биохимический анализ показал отличия сомаклонов по суммарному содержанию ФС. Так, сомаклон 11 превышает по сумме фенольных веществ исходное растение на 66,6%, а сомаклон 20 - на 42,8%, у сомаклона 34 - на 26,3%. Имеется и сомаклон, у которого количество фенольных веществ сопоставимо с интактным растением - сомаклон 7.
Данные по исследованию суммы фла-вонолов представлены в виде диаграммы на рисунке 4. Полученные результаты показывают, что и по количественному содержанию флавонолов все сомаклоны превосходят исходную форму Agastache rugosa (Fisch. et Меу.) КиПге, особенно
сомаклон 11, который превосходит контроль в 7 раз, 34 сомаклон - в 4,5 раза и 31 - в 3,7 раза.
Использование ВЭЖХ позволяет эффективно разделить и идентифицировать нелетучие и термолабильные компоненты водноспиртовых экстрактов лекарственных растений, которые невозможно идентифицировать другими методами. В связи с этим проанализирован состав экстрактов Agastache rugosa (Fisch. et Меу.) Kuntze и сомаклонов Agastache rugosa (Fisch. е! Меу.) Kuntze с помощью ВЭЖХ (рисунки 5 и 6) и определен акацетин после кислотного гидролиза. Увеличение площади пика акацетина после проведения гидролиза
Рисунок 4 - Суммарное содержание флавонолов в растении многоколосника морщинистого и полученных сомаклонов
Рисунок 5 - ВЭЖХ водноспиртового экстракта Agastache rugosa (Fisch. et Меу.) Kuntze
свидетельствует о присутствии значительного количества гликозилированной формы этого соединения в экстракте многоко-лосника морщинистого (рисунок 6).
Установлено повышение содержания флавоноидов, в частности акацетина, в гидролизатах экстрактов изученных образцов, по сравнению с аналогичными, которые не подвергались кислотному ги-
дролизу. Такое повышение можно объяснить тем, что указанные соединения, по-видимому, являются агликоновой частью гликозидов, освобожденной в результате гидролиза. Получены данные по количественному содержанию акацетина в исследуемых экстрактах (таблица 2). Сравнительный анализ показал, что количественное содержание данного флавоноида
Рисунок 6 - ВЭЖХ кислотного гидролизата водноспиртового экстракта Agastache rugosa (Fisch. et Меу.) КиПге после гидролиза
Таблица 2 - Содержание акацетина в гидролизатах Agastache rugosa (Fisch. et Меу.) КиПге
Наименование образца Содержание акацетина в экстрактах до гидролиза, мг/ мл Содержание акацетина в гидролизатах экстрактов, мг/ мл
Исходная форма - 1,64±0,09
Сомаклон 6 - 1,28±0,11
Сомаклон 7 - 0,8±0,22
Сомаклон 11 - 1,09±0,15
Сомаклон 20 - 1,74±0,13
Сомаклон 31 - 1,10±0,08
Сомаклон 34 - 0,92±0,07
Сомаклон 36 - 1,15±0,09
в сомаклонах сравнимо с интактным растением и только для клона 20 отмечено незначительное увеличение акацетина.
Таким образом, при индукции непрямого морфогенеза на основе сомаклональ-ной вариабельности получены сомаклоны многоколосника морщинистого, которые проявили полиморфизм по следующим показателям: сумма фенольных соединений, сумма флавонолов.
С целью выяснения возможной генетической природы зафиксированной вариабельности биохимических параметров у отобранных сомаклонов по сравнению с исходной формой A. rugosa было предпринято мультилокусное ДНК-маркирование генотипов с использованием RAPD- и ISSR-техник. После предварительного скрининга 42 праймеров были отобраны три RAPD (ОРА-О3, ОРС-02 и ОРР-19) и два ISSR (иВС-827 и ИВС-856) праймера, выявляющие наибольший полиморфизм между исследованными сомаклонами. В результате ПЦР тотальной ДНК многоколосника морщинистого с отобранными произволь-
ными и микросателлитными праймерами были получены четкие воспроизводимые ампликоны, набор которых для каждого исследуемого сомаклона и исходной формы характеризовался уникальностью, то есть праймеры обнаруживали полиморфизм между образцами и таким образом позволили дифференцировать все исследованные генотипы. На рисунке 7 представлены результаты микрокапиллярного электрофоретического разделения ампликонов, синтезированных в результате ISSR-ПЦР геномной ДНК сомаклонов и исходной формы Agastache rugosa (Fisch. et Mey.) Kuntze с праймером UBC-827, проведенного на приборе Bioanalyzer 2100 (Agilent).
Всего было сгенерировано 118 дискретных ДНК-маркеров, из них 73 RAPD-(в среднем 24,5 маркера на праймер) и 45 ISSR-маркеров (в среднем 22,5 маркера на праймер). Число амплифицированных фрагментов варьировало от 19 (праймер UBC-827) до 26 (UBC-856). Разрешающие характеристики использованных праймеров представлены в таблице 3.
Рисунок 7 - Разделение ампликонов, синтезированных в результате амплификации геномной ДНК сомаклонов и исходной формы Agastache rugosa (Fisch. et Меу.) Kuntze с
праймером ИВС-827 на Віоапа^ег 2100
Таблица 3 - Разрешающие параметры праймеров, использованных для мультилокусного ДНК-маркирования сомаклонов и исходной формы многоколосника морщинистого
Праймер N маркеров Длина фрагментов, bp N фрагментов на образец (min/ max/ среднее) N полиморфных маркеров/% полиморфизма
RAPD
0PA-03 25 210-1260 18/22/20,7 8/32,0
0PC-02 24 205-1565 13/20/17 15/62,5
0PP-19 24 160-1300 18/20/19,2 11/45,8
ISSR
UBC-827 19 345-975 12/16/13,8 9/47,4
UBC-856 26 205-1005 19/22/20,5 12/46,2
Среднее 23,6 11/46,8
Несмотря на сравнительно невысокий уровень выявляемого полиморфизма (от 32% до 62,5%), использованные праймеры ОРА-О3, ОРР-19, иВС-827 и ЦВС-856 позволили различить все генотипы.
Коэффициенты подобия Nei & Li были рассчитаны для пяти сомаклонов и исходной формы Agastache rugosa (Fisch. et Меу.) КиПге на основе ISSR - и RAPD
- анализов, как по отдельности, так и совместно (RAPD+ISSR). Дистанционные матрицы на основе рассчитанных RAPD
- и ISSR - маркеров (данные не представлены) были использованы для построения дендрограмм по методу UPGMA. Дендрограммы, основанные на данных RAPD- и ISSR-анализа, обнаруживали довольно схожую кластеризацию сомаклонов многоколосника морщинистого (данные не
0.1
ч---------
92%
56%
представлены). Далее для получения более детальной кластеризации и степени генетического родства генотипов данные RAPD- и ISSR-анализа были объединены в сводной RAPD+ISSR матрице (данные не представлены), на основе которой, используя UPGMA алгоритм, была сгенерирована консенсусная RAPD+ISSR дендрограмма, представленная на рисунке 8.
Из представленной дендрограммы видно, что для исследованных сомакло-нов характерны два направления генетической изменчивости относительно исходной формы (Р). Одно из этих направлений представляют сомаклоны 31, 36, 20 и 34, сформировавшие на дендрограмме кластер А, который в свою очередь подразделяется еще на два субкластера, состоящих из пары генетически более
клон 31 клон 36 клон 20
клон 34 J -контроль =1р
клон 11 =1в
Примечание: Горизонтальная шкала отражает генетическую дистанцию между сомаклонами. Числа около узлов отражают величины поддержки (в %), основанные на 100 репликах анализа Bootstrap
Рисунок 8 - Консенсусная дендрограмма генотипов Agastache rugosa (Fisch. et Меу.) Kuntze, сгенерированная с использованием UPGMA алгоритма на основе 73 RAPD и
45 ISSR маркеров
близких сомаклонов: A1 - сомаклоны 31 и 36, A2 - сомаклоны 20 и 34. Второе направление генетической изменчивости относительно исходной формы - это кластер B, представленный сомаклоном 11. Как наглядно видно из представленной дендрограммы (рисунок 8), сомаклон 11 генетически наиболее отдален от исходной формы, что согласуется с данными анализа биохимических показателей генотипов: сумме фенольных соединений и сумме флавонолов.
Также можно отметить, что сомаклоны, формирующие кластер A, в генетическом плане менее отличимы между собой и менее удалены от исходной формы мно-гоколосника морщинистого, чем сомаклон
11, формирующий кластер B.
Величины бутстреп - анализа, расположенные около узлов дендрограммы, превышают 50%, что указывает на статистически достоверную топологию ветвей.
Сегодня применение новейших современных подходов к исследованию генома и метаболома лекарственных растений позволяет углубить фундаментальные знания о биосинтетических циклах и механизмах, ответственных за продукцию БАВ в растениях. При использовании комбинации этих подходов может быть дана детальная характеристика биохимического статуса целого организма или отдельной ткани [32]. Разработанная нами система идентификации и ДНК-паспортизации сомаклонов Agastache rugosa (Fisch. et Mey.) Kuntze основана на использовании RAPD-и ISSR-маркеров. Метод позволяет проводить идентификацию отдельных генотипов с помощью анализа ДНК из любых органов растений на различных стадиях онтогенеза.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Впервые для многоколосника морщинистого Agastache rugosa (Fisch. et Mey.) Kuntze была разработана биотехнологическая схема создания новых форм лекарственных растений с повышенным содержанием БАВ на основе клеточной селекции. В качестве заключительного этапа предлагается микроклональное размножение, которое позволяет быстро размножить полученные и отобранные сомаклоны, представляющие собой самостоятельный способ клонирования ценных
образцов - кандидатов на сорт. Проведен их первичный биохимический анализ. Полученные результаты свидетельствуют о более высокой активности синтеза фенольных соединений и флавонолов в отобранных сомаклонах, максимальные отличия характерны для сомаклона 11. Для дифференцировки генотипов Agastache rugosa (Fisch. et Mey.) Kuntze разработана эффективная RAPD+ISSR маркерная система: комплекс из трех RAPD и двух ISSR праймеров позволил констатировать наличие генетических различий между анализируемыми сомаклонами, вычислить генетические дистанции между ними и исходной формой, сертифицировать все генотипы.
Данные генотипирования полученных сомаклонов на основе комплексного использования набора произвольных и микросателлитных праймеров коррелируют с результатами измеренных биохимических показателей растений, что позволяет рекомендовать предложенную систему для проведения дальнейшей направленной селекции желаемых физиологических признаков культуры на внутривидовом уровне. Поскольку маркер - основанная селекция является инструментом, существенно ускоряющим эффективную селекцию сортов/линий растений с повышенным биосинтезом желаемых вторичных метаболитов, то SCAR - маркеры могут быть разработаны на основе полученных RAPD - и ISSR - маркеров и далее помочь при функциональном анализе целевых генов.
SUMMARY
E.V. Spiridovich, T.I. Fomenko,
A.B. Vlasova, T.V. Mazur, A.N. Yukhimuk BIOCHEMICAL AND MOLECULAR-GENETIC ANALYSIS OF AGASTACHE RUGOSA (FISCH. ET MEY.) KUNTZE IN THE CULTURE IN VITRO
Biotechnology cell selection scheme for the creation of new somaclonal genotypes of giant-hyssop (Agastache rugosa (Fisch. et Mey.) Kuntze with a high content of biologically active substances was developed. Biochemical analysis revealed a high activity of synthesis of phenolic compounds and flavo-noids in selected somaclones, with maximum characteristic at somaclones 11. Developed RAPD+ISSR marker system of differentia-
tion of A. rugosa genotypes made possible to assess the discreteness of somaclones’ genotypes between each other and the original form, and identify somaclone 11 as the most genetically distinct from the original form. Somaclones and developed a marker system are proposed to use for further marker-assisted selection of cultivars with increased accumulation of phenolic compounds and flavo-noids.
Keywords: biotechnology, culture in vitro, Agastache rugosa (Fisch. et Mey.) Kuntze, somaclones, qualitative structure, polyphenolic connections, molecular-genetic markers.
ЛИТЕРАТУРА
1. Носов, А.М. Функции вторичных метаболитов растений in vivo и in vitro / А.М. Носов // Физиология растений. -1994. - Том 41, № 6. - С.873-878.
2. Stapleton, A.E. Ultraviolet Radiation and Plants: Burning Questions / A.E. Stapleton // Plant Cell. - 1992. - V.4. - P. 1353-1358.
3. Бутенко, Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе: учебное пособие / Р.Г. Бутенко.
- М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. - 160 с.
4. Feher, A. Transition of somatic plant cells to an embryogenic state / A. Feher, T.P Pasternak., D. Dudits // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. - 2003. - V.74. - P. 201-228.
5. Рабинович, С.А. Алкалоиды кал-лусных тканей Papaver bracteatum Lindl. / С.А. Рабинович, А.М. Смирнов // Культура клеток растений и биотехнология. Тезисы докладов IV всесоюзной конференции. -Кишинев, 1983. - С. 63-64.
6. Флавоны генетически трансформированных корней шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi) и индукция их образования при элиситации метилжас-монатом / И.Н. Кузовкина [и др.] // Физиология растений. - 2005. - Т.52. - С. 90-96.
7. Karuppusamy, S. A review on trends in production of secondary metabolites from higher plants by in vitro tissue, organ and cell cultures / S. Karuppusamy // Journal of Medicinal Plants Research. - 2009. - Vol.3, №13. - P.1222-1239.
8. Xu, J. Suspension culture of compact callus aggregate of Rhodiola sachalinensis for improved salidroside production / J. Xu, Z. Su, P. Feng // Enzyme Microb. Tech. - 1998.
- Vol. 23. - P. 20-27.
9. Gyorgy, Z. Production of cinnamyl
glycosides in compact callus aggregate cultures of Rhodiola rosea through biotransformation of cinnamyl alcohol / Z. Gyorgy, A. Hohtola // Methods Mol Biol. -
2009. - Vol. 547. - P.305-312.
10. Zhao, J. Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites / J. Zhao, L. C. Davis, R. Verpoorte // Biotechnology Advances. - 2005. - V. 23, Issue 4. - P. 283-333.
11. In vitro culture establishment of Schizandra chinensis (turz.) Baill. and Rhodiola rosea L., two adaptogenic compounds producing plants / J. Martin [et al.] // Journal of Phytology. Tissue Culture. -
2010. - V. 2, №11. - P. 80-87.
12. Identification of a common polymorphism in the TopBP1 gene associated with hereditary susceptibility to breast and ovarian cancer / S.M. Karppinen [et al.] // Eur. J. Cancer. - 2006. - V. 42. - P. 2647-2652.
13. IUPAC. Nomenclature of cyclitols // Biochem.J. - 1976. - V. 153. - P. 21-31.
14. Запрометов, М.Н. Фенольные соединения и их роль в жизни растения / М.Н. Запрометов. - М., 1996. - 45 с.
15. Загоскина, Н.В. Культура ткани чайного растения: некоторые аспекты образования полифенолов/ Н.В. Загоскина, М.Н. Запрометов // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. -М.: Наука, 1991. - С. 32-35.
16. Rolph, C.E. Phosphatidylcholine Biosynthesis in Celery Cell Suspension Cultures with Altered Sterol Compositions / C.E. Rolph, L.J. Coad // Physiol. Plantarum. -1991. - V.83. - №4. - P. 605.
17. Molecular markers in herbal drug technology / J. Kalpana [et all] // Current Science. - 2004. - V 87. - №2. - P. 159-165.
18. O’Connor, S. Methods for molecular identification of biosynthetic enzymes in plants / S. O’Connor // Plant-derived natural products; eds.: A.E. Osbourn, V. Lanzotti. -Springer Science + Business Media, LLC, 2009. - 598 p.
19. ISSR analysis of genetic diversity of the Qinghai-Tibet Plateau endemic Rhodiola chrysanthemifolia (Crassulaceae) / Xia Tao [et al.] // Biochemical Systematics and Ecology. -2007. - V. 35. - P. 209-214.
20. Behera, K. Comparative analysis of genetic diversity in Indian bitter gourd (Momordica charantia L.) using RAPD and ISSR markers for developing crop improvement strategies/ K. Behera, A.K.
Singh, Jack.E. Staub// Scientia Horticulturae.
- 2008. - V.115. - P. 209-217.
21. Verma, Praveen C. The extent of genetic diversity among Vanilla species: Comparative results for RAPD and ISSR / Praveen C. Verma [et al.] // Industrial crops and products. - 2009. - V.29. - P. 581-589.
22. Kurane, J. Application of ISSR marker in pharmacognosy: current update / J. Kurane, V. Shinde, A. Harsulkar // Phcog. Rev. - 2009. - V.3. - Issue 6. - P. 216-228.
23. Murashige, Т., Skoog, F. // Physiol. Plant. - 1962. - V.15. - №13. - P. 473-497.
24. Riedl, K.M. Tannin-protein complexes as radical scavengers and radical sinks/ K.M. Riedl, A.E. Hagermann // J. Agric. and Food Chem. - 2001.- Vol. 49, № 10. - P. 49174923.
25. Merken, H.M. Liquid chromatographic method for the separation and quantification of prominent flavonoid aglycones / H.M. Merken, G.R. Beecher // Journal of chromatography. - 2000. - № 897. - Р. 177-184.
26. Rapid DNA extraction from ferns for PCR-based analyses / E.L. Dempster [et al.] // Biotechniques. - 1999. - V 27(1). - P. 66-68.
27. Vogelmann, J.E. Flavonoids of Agastache section Agastache / J.E. Vogelmann // Biochemical Systematic and Ecology. -1984. - V.12. - №4. - P. 363-366.
28. Inhidition of cytokine-induced IkappaB kinaseactivation as a mechanism
contributing // Atherosclerosis. - 2005. -V.180. - №1. - P. 27-35.
29. Биологически активные вещества растительного происхождения: в 3-х томах. - М., 2001. - С. 740-760.
30. Мазур, Т.В. Культивирование мно-гоколосника морщинистого (Agastache rugosa (Fisch. et Mey.) Kuntze) in vitro / Т.В. Мазур, В.Н. Решетников // Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия биологических наук. - Минск, 2005. - №3.
- С. 5-9.
31. Nei, M. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases / M. Nei, W.H. Li // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1979. -V.76. - P. 5269-5273.
32. Resent advances in medical plant biotechnology / M.V. Khan [et all] // Indian journal of biotechnology. - 2009. - V.8. - P. 9-22.
Адрес для корреспонденции:
220012, Республика Беларусь, г. Минск, ул. Сурганова, 2в,
ГНУ ЦБС НАН Беларуси, лаборатория прикладной биохимии, тел.:(+375-17) 284-14-73, эл. почта: [email protected]. Спиридович Е.В.
Поступила 09.11.2012 г.
