CC BY
36ние их, потеря эластичности и изменение в цвете (серый оттенок, особенно, околоушных слюнных желез).
Масса слюнных желез у крыс с атропиновой нагрузкой была значительно выше, нежели у интактных животных (таблица).Отличительные данные по околоушной и подчелюстной слюнной железах - достоверны.
Обработка же полости рта метиловым эфиром метакриловой кислоты привела к уменьшению массы слюнных желез. При этом наиболее выраженное отличие с высокой достоверностью (Р < 0,001) наблюдалось при изучении околоушных слюнных желез.
И самые выраженные отличия, выражавшиеся в уменьшениии массы околоушной слюнной железы (почти в 2 раза по сравнению с интактными крысами), отмечались у животных с токсическим поражением слюнных желез эфиром метакриловой кислоты.
Таким образом, при проведении экспериментальных исследований были смоделированы ситуации уменьшения слюновыделения, которые добились путем длительного введения атропина и обработки полости рта эфиром метакриловой кислоты. Исходя из полученных данных (увеличение объема больших слюнных желез при атропиновой нагрузке и уменьшение - при действии мономера на слизистую оболочку рта), механизм снижения слюноотделения разный.
Можем предположить, что длительное введение атропина привело к активизации ацетилхолина - медиатора парасимпатической нервной системы- с образованием густой и вязкой слюны, выделение которой затруднено. Обработка же полости рта эфиром метак-риловой кислоты вызвала токсическое поражение больших слюнных желез с отмиранием ацинусов-клеток, выделяющих секрет. Слюнная деятельность слюнных желез уменьшилась.
Однако высказанное предположение требует дополнительных исследований, в частности, морфологического изучения слюнных желез.
Выводы. 1.Аппликации атропина на слизистую оболочку полости рта привели к уменьшению слюно-выделения. 2. Разработана экспериментальная модель снижения слюновыделения, основанная на разбалан-сировании иннервации слюнных желез вегетативной нервной системой.
Список литературы
1. Денисов А. Б. Слюнные железы. Слюна. Ч. 2. Методы моделирования физиологических и патологических процессов / А. Б. Денисов. - М., 2000. -59 с.
2. Терешина Т. П. Влияние остаточного мономера акриловых зубных протезов на функциональную активность слюнных желез (экспе-риментальное исследование) / Т. П. Терешина, Р. И. Бабий // Вестник стоматологии. - 2005.- №2. - С. 25-27.
3. Денисов А. Б. Слюнные железы. Слюна / А. Б. Денисов. -М., 2000. - 362 с.
4. Лесовая И. Г. Состояние вегетативной нервной системы и секреторная активность слюнных желез у больных хроническим сиа-лоаденитом / 1нноващйп технологи - в стоматолопчну практику: материалы 111 (Х) з'ъзду Асощацп стоматологов Укра1ни, (Полтава, 1618 жовтня 2008 р.) / М-во охорони здоров'я Укра1ни / И. Г. Лесовая, Т. В. Ткач, Г. Б.Хасанова. - Полтава: «Дивосвгт», 2008. - С. 303.
5. Abert O. A. Xerostomia. Causes and effect/ O. A. Abert // J. Prosthet.Dent.-2006.-Vol.84, N1.-P. 77-81.
Поступила 24.04.12
УДК 616.731-07.23.008+612.045.11
А. И. Фурдычко, О. Э. Кнава
ГУ "Институт стоматологии НАМН" ГУ "Львовский национальный медицинский университет им. Данила Галицкого"
БИОХИМИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ВОСПАЛЕНИЯ
И ДИСБИОЗА ПРИ АППЛИКАЦИИ НА СЛИЗИСТУЮ ПОЛОСТИ РТА КРЫС ГЕЛЯ С ФИТОЛИЗОЦИМОМ, АДСОРБИРОВАННОМ НА ХИТОЗАНЕ
Оральные аппликации 2,5 %-ного геля КМЦ, который содержал 10 % хитозана с адсорбированным фитолизоци-мом, вызывали снижение активности эластазы в десне крыс, что свидетельствовало о противовоспалительном действии препарата, а также существенное снижение активности уреазы в десне и слизистой щеки и языка, что свидетельствует о снижении микробной обсемененности тканей ротовой полости. Как следствие, у крыс, которым делали аппликации препарата, достоверно снижается степень дисбиоза. Оральные аппликации фитолизоцима повышают уровень лизоцима в сыворотке крови. Ключевые слова: лизоцим, хитозан, эластаза, уреаза, дис-биоз, воспаление, десна, слизистая полости рта.
Ф. I. Фурдичко, О. Е. Кнава
ДУ "1нститут стоматологИ НАМН" ДУ "Льв1вський нащональний медичний ушверситет ¿м. Данила Галицького"
Б1ОХ1М1ЧН1 МАРКЕРИ ЗАПАЛЕННЯ I ДИСБ1ОЗУ ПРИ АПЛ1КАЦИ НА СЛИЗОВУ ПОРОЖНИНИ РОТА ЩУР1В ГЕЛЮ З Ф1ТОЛ1ЗОЦИМОМ, АДСОРБОВАНИМ НА Х1ТОЗАН1
Оральт аплжаци 2,5 %-ного гелю КМЦ, який мiстив 10 % хтозану з адсорбованим фiтолiзоцимом, викликали зни-ження активностi еластази в яснах щурiв, що свiдчило про антизапальну дю препарату, а також суттеве зниження активностi уреази в яснах та слизовш щоки i язика, що свi-дчить про зниження мжробного обЫментня тканини ро-товоЧ порожнини. Як на^док, у щурiв, яким робили аплжа-ци препарата, достовiрно знижуеться стутнь дисбiозу. Оральн аплкацп фiтолiзоциму тдвищують рiвень лiзоциму в сироватц кровi.
Ключов1 слова: лiзоцим, хтозан, еластаза, уреаза, дисбюз, запалення, ясна, слизова порожнини рота.
A. I. Furdychko, O. E. Knava
SE "The Institute of Dentistry of the NAMS of Ukraine" SE "Lviv National Medical University named after Danylo Galytskij"
THE BIOCHEMICAL MARKERS OF INFLAMMATION AND DISBIOSIS AT THE APPLICATION OF GEL WITH PHYTOLYSOZYME, EXHAUSTED AT CHITOZANE, AT THE ORAL MUCOUS MEMBRANE OF RATS
The oral application of 2.5% gel KMT, containing 10% of chito-zane with exhausted phytolysozyme, caused the reduction of elastase activity in rats gum. This fact spoke of the anti-inflammatory effect of the preparation. These applications have
© Фурдычко А. И., Кнава О. Э., 2012.
also caused the considerable decrease in urease activity in gum and mucous membrane of cheek and tongue, which speak of the reduction of microbe insemination of oral tissues. As a result, the degree of disbiosis is really reduced in rats that have undergone the applications of the preparation. The oral applications of phytolysozyme raise the level of lysozyme in blood serum. Key words: lysozyme, chitozane, urease, disbiosis, inflammation, gum, oral mucous membrane.
Некоторые растения (капуста, редис, хрен) содержат лизоцим (фитолизоцим [1, 2], который избирательно сорбируется на хитозане [3, 4]). Хитозан представляет собой деацетилированный хитин (главный полисахарид панциря крабов и раков [5]). Хито-зан, кроме способности сорбировать лизоцим, обладает рядом лечебно-профилактических свойств, обусловивших его применение в медицине [6].
Нами была разработана технология получения фи-толизоцима из капусты с использованием хитозана в качестве сорбента. Полученный препарат фитолизоци-ма, адсорбированный на хитозане, был включен в состав мукозального геля и испытан путем аппликаций на слизистую полости рта крыс. Оценку состояния тканей полости рта осуществляли с помощью биохимических маркеров воспаления [7] и дисбиоза [8].
Материалы и методы исследования. Фитоли-зоцим получали из белокочанной капусты путем измельчения до частиц размером 5-10 мм, прессования в полотняном мешке под механическим прессом, отделения капустного сока [9], встряхивания последнего с хитозаном в соотношении 5 г хитозана на 1 л сока, отделения хитозана с адсорбированным фитолизоци-мом и промывки водой, сушки в токе теплого воздуха (не выше +60 °С).
Хитозан получали из хитина (100 г) путем кипячения с 1 л 45 %-ного NaOH в течение 5 часов; после промывки водой до нейтральной реакции и последующей сушки при температуре не более +80 °С получали порошкообразный препарат.
Гель фитолизоцима, адсорбированный на хитозане, готовили на 2,5%-ном КМЦ (карбоксиметилцел-люлозе Na-соль) из расчета 100 мг/мл.
В опыте было использовано 10 белых крыс линии Вистар (самцы, 4 месяца, средняя масса 240±10 г), разделенных на 2 группы: 1 группа - контроль, аппликации на слизистую полости рта осуществляли основой геля, содержащего 2,5% КМЦ; 2 группа -крысы получали аппликации геля, содержащего фи-толизоцим, адсорбированный на хитозане. Аппликации осуществляли ежедневно за 1 час до еды в течение 10 дней в дозе 0,5 мл геля на крысу.
Эвтаназию животных осуществляли под тиопен-таловым наркозом (20 мг/кг) путем тотального кровопускания из сердца. Иссекали десну, слизистую языка, щеки и получали сыворотку крови. Гомогенаты тканей готовили на 0,05М трис-HCl буфере рН 7,5 из расчета 20 мг/мл. В гомогенатах определяли уровень маркеров воспаления: концентрацию малонового ди-альдегида (МДА) [10] и активность эластазы [11], активность уреазы (показатель микробной обсеменен-ности) [12], лизоцима (показатель неспецифического иммунитета) [2], каталазы (антиоксидантный фер-
мент) [13]. По соотношению относительных активностей уреазы и лизоцима рассчитывали степень дисбиоза [8], а по соотношению активности каталазы и концентрации МДА - антиоксидантно - прооксидант-ный индекс АПИ [7]. В сыворотке крови определяли активность эластазы, уреазы и лизоцима и рассчитывали степень дисбиоза.
Результаты и их обсуждение. В табл. 1 представлены результаты определения биохимических маркеров в десне крыс, которым делали аппликации геля, содержащего фитолизоцим, адсорбированный на хито-зане. Из этих данных видно, что препарат фитолизоци-ма достоверно снизил уровень одного из маркеров воспаления - эластазы и весьма значительно (в 1,8 раза) активность уреазы, что свидетельствует об антимикробном и противовоспалительном действии препарата. Остальные биохимические показатели десны не изменились после аппликаций фитолизоцима.
Таблица 1
Влияние фитолизоцима, адсорбированного на хитозане, на биохимические показатели десны крыс
Показатели Группа № 1, контроль Группа № 2, фитолизоцим + хитозан
МДА, ммоль/кг 15,06±0,41 15,81±0,57 p>0,3
Эластаза, мк-кат/кг 43±2 39±1 p<0,05
Уреаза, мк-кат/кг 3,73±0,37 2,08±0,28 p<0,01
Лизоцим, ед/кг 350±22 340±12 p>0,3
Каталаза, мкат/кг 7,52±0,52 7,67±0,66 p>0,6
АПИ, ед. 4,99±0,36 4,65±0,41 p>0,5
В табл. 2 представлены результаты определения биохимических показателей в слизистой оболочке языка. Из этих данных видно, что под влиянием фи-толизоцима достоверно (в 1,5 раза) снижается активность уреазы и проявляется тенденция к снижению уровня маркеров воспаления: МДА и эластазы.
Аналогичные данные для слизистой оболочки щеки представлены в табл. 3. В этой ткани фитолизо-цим оказал лишь антимикробное действие, о чем свидетельствует достоверное (в 1,8 раза) снижение активности уреазы. Остальные биохимические показатели существенно не изменились.
В табл. 4 представлены результаты определения биохимических показателей сыворотки крови. Достоверным явилось увеличение в сыворотке активности лизоцима, что может свидетельствовать о возможном проникновении фитолизоцима из геля в общий кровоток. Что касается маркера воспаления эластазы, то при оральной аппликации фитолизоцима в сыворотке наблюдается лишь тенденция к снижению его уровня. Кстати, в сыворотке, как и ожидалось, наблюдается самая низкая активность уреазы - в 25 раз ниже, чем в десне.
Таблица 2
Влияние фитолизоцима, адсорбированного на хитозане, на биохимические показатели слизистой оболочки языка крыс
Показатели Группа № 1, контроль Группа № 2, фитолизоцим + хитозан
МДА, ммоль/кг 6,30±0,31 5,79±0,22 p>0,1
Эластаза, мк-кат/кг 53±2 48±2 p>0,05
Уреаза, мк-кат/кг 0,98±0,09 0,63±0,10 p<0,05
Лизоцим, ед/кг 97±15 99±19 p>0,8
Каталаза, мкат/кг 2,93±0,13 2,93±0,10 p=1
АПИ, ед. 4,65±0,32 5,06±0,38 p>0,3
Таблица 3 Влияние фитолизоцима, адсорбированного на хитозане, на биохимические показатели слизистой оболочки щеки крыс
Показатели Группа № 1, контроль Группа № 2, фитолизоцим + хитозан
МДА, ммоль/кг 26,28±1,11 26,92±0,97 p>0,5
Эластаза, мк-кат/кг 35±3 34±1 p>0,5
Уреаза, мк-кат/кг 1,80±0,28 1,06±0,11 p<0,05
Лизоцим, ед/кг 295±13 258±17 p>0,05
Каталаза, мкат/кг 5,16±0,43 5,55±0,35 p>0,5
АПИ, ед. 1,96±0,18 2,06±0,19 p>0,5
Таблица 4 Влияние фитолизоцима, адсорбированного на хитозане, на биохимические показатели сыворотки крови крыс
Показатели Группа № 1, контроль Группа № 2, фитолизоцим + хитозан
Эластаза, мк-кат/л 271,2±11,1 255,1±12,8 p>0,3
Уреаза, мк-кат/л 0,154±0,015 0,151±0,015 p>0,8
Лизоцим, ед/кг 68±4 81±2 p<0,05
исследованных тканях полости рта крыс, получавших аппликации фитолизоцима, наблюдается достоверное снижение степени дисбиоза (за счет снижения микробной обсемененности). В сыворотке обнаружена лишь тенденция к снижению степени дисбиоза, наблюдаемая у контрольных животных (р>0,1).
1,2 -|
1
На рисунке представлены результаты определения степени дисбиоза в исследованных биообъектах крыс, получавших фитолизоцим. Как видно, во всех
Рис. Степень дисбиоза в десне (а), слизистой языка (б), щеки (в) и в сыворотке крови (г) крыс после аппликаций геля с фитолизоцимом, адсорбированного на хитозане (1 - группа № 1, 2 - группа № 2).
Таким образом, препарат фитолизоцима, адсорбированного на хитозане в виде 10 %-ного геля на 2,5%-ный КМЦ, обладает четко выраженной антимикробной и антидисбиотической активностью, что дает основание надеяться на наличие у него лечебно-профилактических свойств при стоматологической патологии.
Список литературы
1. Бухарин О. В. Лизоцим и его роль в биологии и медицине / О. В. Бухарин, Н. В. Васильев. - Томск, 1974. - 120 с.
2. Левицкий А. П. Лизоцим вместо антибиотиков / А.П. Левицкий. - Одесса: КП ОГТ, 2005. - 74 с.
3. Черкасов И. А. Усовершенствованный способ выделения лизоцимов методом фермент-субстратной хроматографии / И.А. Черкасов, Н.А. Кравченко // Биохимия. - 1969. - Т. 34, № 5. - С. 1089-1091.
4. Slcjak-Braen G. Chitin and chitosan Sources, Chemistry, Biochemistry, Physical Properties and Application / G. Slcjak-Braen, T. An-thonsen, P. Sanford. - London, New-York: Elsevier, 1989. - 315 p.
5. Хитозан: структура и свойства. Использование в медицине / Ю.А. Петрович, Л. А. Григорьянц, А.Н. Гурин [и др.] // Стоматология. - 2008. - № 4. - С. 72-77.
6. Повышение хитозаном неспецифической резистентности организма при интоксикации липополисахаридом E. ^li / Э.И. Ха-сина, М.Н. Сгребнева, В.Н. Давыдова [и др.] // Эфферентная терапия. - 2006. - Т. 12, № 4. - С. 32-35.
7. Биохимические маркеры воспаления тканей ротовой полости (метод. рекомендации) / А. П. Левицкий, О. В. Деньга, О. А. Макаренко [и др.] - Одесса, 2010. - 16 с.
8. Пат. 43140 Украша, МПК (2009) G01N 33/48. Споаб ощн-ки ступеня дисбюзу (дисбактерюзу) оргашв i тканин / Левицький А.П., Деньга О.В., Селiванська 1.О. [та ш.]. - 2009. - Бюл. № 15.
9. Левицкий А. П. Кормовая ценность капустной выжимки / А.П. Левицкий, В.С. Миронов, И.В. Ходаков // Зержта продукти i комбкорми. - 2011. - № 4 (44). - С. 29-30.
10. Стальная И. Д. Метод определения малонового диальде-гида с помощью тиобарбитуровой кислоты / И.Д. Стальная, Т. Г. Гаришвили // Современные методы в биохимии. - М. : Медицина, 1977. - С. 66-68.
11. Левицкий А. П. Методы определения активности эласта-зы и ее ингибиторов (метод. рекомендации) / А. П. Левицкий, А. В. Стефанов. - Киев: ГФЦ, 2002. - 15 с.
12. Гаврикова Л. М. Уреазная активность ротовой жидкости у больных с острой одонтогенной инфекцией челюстно-лицевой
б
а
в
г
2
2
2
2
области / Л.М. Гаврикова, И.Т. Сегень // Стоматология. - 1996. -Спец. вып. - С. 49-50.
13. Гирин С. В. Модификация метода определения активности каталазы в биологических субстратах / С. В. Гирин // Лабораторная диагностика. - 1999. - № 4. - С. 45-46.
Поступила 22.02.12
УДК 616.36-102.2-07:616-078.33
Е. Н. Кушнир, И. В. Ходаков
Одесский национальный медицинский университет ГУ «Институт стоматологии НАМН Украины»
АНТИДИСБИОТИЧЕСКОЕ И ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ ФИТОГЕЛЯ «ВИНОГРАДНЫЙ» НА СЛИЗИСТУЮ ПОЛОСТИ РТА КРЫС С ГЕНЕРАЛИЗОВАННЫМ ДИСБИОЗОМ
В эксперименте на крысах, у которых вызвали генерализованный дисбиоз введением с питьевой водой линкомицина, показано лечебно-профилактическое действие фитогеля, содержащего экстракт из листьев винограда. Антидис-биотическое действие оценивали по активности ферментов уреазы и лизоцима, а противовоспалительное — по уровню МДА и активности эластазы.
Ключевые слова: дисбиоз, слизистая полости рта, фито-гели, виноградные листья, воспаление, ферменты
€. М. Куштр, I. В. Ходаков
Одеський нащональний медичний утверсигет ДУ «1нститут стоматологИ НАМН Украши»
АНТИДИСБ1ОТИЧНА I ПРОТИЗАПАЛЬНА
Д1Я Ф1ТОГЕЛЮ „ВИНОГРАДНИЙ" НА СЛИЗОВУ ПОРОЖНИНИ РОТА ЩУР1В З ГЕНЕРАЛ1ЗОВАНИМ ДИСБ1ОЗОМ
В експериментi на щурах, у яких вiдтворювали генералiзо-ваний дисбiоз шляхом введення з питною водою лткомщи-на, показали л^вально-профтактичну дю фтогелю, який мiстить екстракт з листя винограду. Антидисбiотичную дю оцтювали за рiвнем активностi ферментiв уреази i л^ зоцима, протизапальну — за рiвнем МДА та активностi еластази.
Ключов1 слова: дисбюз, слизова порожнини рота, фiтогелi, виноградн листя, запалення, ферменти
E. N. Kushnir, I. V. Khodakov
Odessa State Medical University SE "The Institute of Dentistry of the NAMS of Ukraine"
THE ANTIDISBIOTIC AND ANTIINFLAMMATORY INFLUENCE OF PHYTOGEL "VINOGRADNYJ" ON THE ORAL MUCOUS MEMBRANE OF RATS WITH GENERALIZED DISBIOSIS
At the experiment with rats, in which the generalized disbiosis was caused by the introduction of lincomycin with table water, the treatment and preventive effect of phytogel, containing the extract of vine leaves, was shown. The antidisbiotic influence
was estimated by the activity of enzymes of urease and lysozyme, the anti-inflammatory one — by the level of MDA and elastase activity. Key words: disbiosis, oral cavity, phytogels, vine leaves, inflammation, enzymes.
Генерализованный дисбиоз, развивающийся в результате нарушения видового и количественного состава микрофлоры основных биотопов организма (толстая кишка, полость рта, кожа и др.), сопровождается системной эндотоксинемией, при которой микробный эндотоксин липополисахарид поступает в больших количествах в системный кровоток, оказывая провоспалительное действие на многие органы и ткани [1—2].
Целью настоящего исследования стало изучение влияния фитогеля «Виноградный» на состояние слизистой оболочки полости рта крыс при моделировании генерализованного дисбиоза с использованием антибиотика путём определения уровня биологических маркеров воспаления и дисбиоза.
Материалы и методы исследования. Эксперименты были проведены на 28 крысах линии Вистар (самки, 11 месяцев, массой 306 ± 15 г), которые были разделены на 4 группы: 1-ая - контроль (интактные); 2-ая - дисбиоз (Д); 3-я - дисбиоз + фитогель «Виноградный»; 4-ая - дисбиоз + фитогель «Инулин». Фи-тогели готовили в соответствии с ТУ У 20.413903778-032:2012 на КМЦ-Na. Для фитогеля «Виноградный» использовали водно-спиртовый экстракт из листьев винограда (концентрация спирта 50 %, концентрация экстрактивных веществ 4-5 %), из расчёта 300 мг экстрактивных веществ на 1 крысу. Инулин (препарат "Fibruline Instant", Бельгия) использовали в дозе 75 мг на крысу также в составе геля КМЦ-Na.
Дисбиоз воспроизводили в помощью антибиотика линкомицина путём введения с питьевой водой в течение 5 дней в дозе 70 мг/кг [4]. Аппликации гелей на слизистую полости рта осуществляли ежедневно с первого и до последнего дня опыта (15 дней). Эвтаназию животных проводили под тиопенталовым наркозом (20 мг/кг) путём тотального кровопускания из сердца. Иссекали слизистую щеки и языка, в гомоге-натах которых определяли активность уреазы (маркер микробной обсеменённости) [5], лизоцима (показатель неспецифического иммунитета) [6] и степень дисбиоза по соотношению относительных активностей уреазы и лизоцима [7]. Кроме того, в гомогена-тах слизистых определяли уровень маркеров воспаления [8]: концентрацию малонового диальдегида (МДА) и активность эластазы.
Результаты исследования и их обсуждение. В табл. 1 представлены результаты определения активности уреазы и лизоцима, а также степень дисбиоза в слизистой щеки и языка крыс с генерализованным дисбиозом и влияния на эти показатели аппликаций фитогеля, содержащего экстракт из листьев винограда. Как видно из представленных данных, при дис-биозе увеличивается активность уреазы (p < 0,05) и резко снижается активность лизоцима (p < 0,001). Применение аппликаций фитогеля достоверно снижа-
© Кушнир Е. Н, Ходаков И. В.,2012.
