CC BY
32
открывающего ворота инфекции. Кроме спор грибов этот вредитель может переносить и некоторые вирусные болезни цветочно-декоративных культур. В связи с тем, что ранее в тепличном хозяйстве клещ не выявлялся, имеются все основания утверждать, что вредитель был завезен в хозяйство с партией посадочного материала от поставщика.
Рисунок 3 - Луковица тюльпана, пораженная пенициллезом с синевато-зеленоватыми подушечками спороношения на чешуйках (слева); луковица, пораженная фузариозом (донце луковицы трухлявое) (справа) (Лаборатория РЦ ФМПА, Курган, 2016)
Заключение
Установлено наличие в посадочном материале корневого луковичного клеща, который является ведущим фактором, определяющим неблагоприятную фитосанитарную ситуацию в отдельных культивационных сооружениях агрофирмы. Инфекции грибного происхождения - пенициллез, фузариоз -имеют в данном случае второстепенное значение. Их развитие связано с распространением клеща. Вероятно, корневой луковичный клещ был завезен в тепличный комплекс с посадочным материалом от поставщика, так как ранее в тепличном комплексе он никогда не обнаруживался.
Фитосанитарный мониторинг почвогрунтов агрофирмы не выявил контаминации субстрата патогенными грибами, имеющими в своем цикле развития склероциальную стадию (ризоктониоз или склероциальная гниль, серая гниль). Однако обследование почвогрунтов показало их высокую заселенность (выше порога вредоносности) грибами из родов Pénicillium и Fusarium - возбудителями пенициллеза и фузариоза тюльпанов.
В связи с тем, что главным патоагентом, определяющим фитосанитарную обстановку в хозяйстве, является вредитель - корневой луковичный клещ, усилия должны быть в первую очередь направлены на подавление популяции вредителя.
Список литературы
1 Геельхаар Х. Тюльпаны в саду /пер с нем. С.О. Эбель ; под ред. И. К. Артамоновой. - Москва : Агропромиздат, 1988. -138 с.
2 Евсеев В. В. Фитосанитарный мониторинг : учебное пособие. - Saarbrücken, Deutschland: Verlag Palmarium Academic Publishing, 2015. - 88 с.
3 Терезникова Е. М., Чумак П. Я. Защита цветочно-декоративных растений от вредителей : справочник. - Москва :
Агропромиздат, 1989. - 127 с.
4 Трейвас Л. Ю. Болезни и вредители декоративных садовых растений: Атлас-определитель. - Москва : Фитон XXI, 2013. - 192 с.
5 Шипилова Н. П., Иващенко В. Г. Систематика и диагностика грибов рода Fusarium на зерновых культурах. -Санкт-Петербург : ВИЗР, 2008. - 84 с.
Региональный центр фитосанитарного мониторинга по Курганской области имеет возможность по договоренности с хозяйствами проводить фитосанитарный мониторинг тепличных грунтов и культивационных сооружений.
УДК 504.064 : 628.3/4 Евсеев В.В., Кириллов А.Е. Курганский государственный университет, Курган
биоэкология и практическое значение железо-марганцевых бактерий сточных ВОД И системы водоснабжения промышленных предприятий
Аннотация. Представлена программа исследований крупной эколого-трофической группировки железо-марганцевых бактерий, имеющих большое практическое значение в функционировании современных водных природных и техногенных экосистем, в частности как агенты коррозии металлов. Несмотря на всю значимость этих микроорганизмов, отдельные вопросы биоэкологии, а также роль и практическое значение железо-марганцевых бактерий в техногенных системах и процессах до сих пор остаются изученными весьма поверхностно. Все это определяет актуальность, значительный научный и практический интерес исследований биоэкологии железо-марганцевых бактерий в рамках технологических процессов и техногенных систем промышленных предприятий. Впервые для региона исследования будет получена информация о биоэкологии железо-марганцевых бактерий и биопленок (состав и количественные характеристики) крупных техногенных и природных акваэкосистем, дана оценка индикаторной ценности как отдельных видов, так и биопленок железо-марганцевых бактерий, уточнена роль в процессах коррозии металлических изделий и конструкций.
Ключевые слова: биоэкология, железо-марганцевые бактерии, биоиндикация, биокоррозия металлов, система водоснабжения, программа исследований.
Yevsejev V.V., Kirillov A.E. Kurgan State University, Kurgan
THE BIOECOLOGY AND PRACTICAL SIGNIFICANCE OF IRON-MANGANESE BACTERIA OF SEWAGE AND WATER SUPPLY SYSTEMS OF INDUSTRIAL ENTERPRISES
Abstract. The article presents the program of studies of major ecological-trophic groups of iron-manganese bacteria, which are of great importance in the functioning of modern aquatic natural and anthropogenic ecosystems, in particular as agents of metal corrosion. In spite of the significance of these microorganisms, and also the role and practical significance of iron-manganese bacteria in anthropogenic systems and processes, separate questions of bio-ecology have been studies formally. This determines importance, great scientific and practical interest of bioecological research of iron-manganese bacteria in the context of technological processes and anthropogenic systems of industrial enterprises. First, in the history of the region of study there will be information about bio-ecology of iron-manganese bacteria and biofilm (contents and quantitative aspects) of large aquatic anthropogenic and natural ecosystems, the evaluation of indicator value, of separate kinds as well as biofilm of iron-manganese bacteria, the role of corrosion of metal goods and constructions is specified.
Keywords: bio-ecology, iron-manganese bacteria, bioindication, bio-metal corrosion, water supply system, program of research.
Введение. Крупная эколого-трофическая группировка железо-марганцевых бактерий играет ключевую роль в глобальных биогеохимических круговоротах железа и марганца - элементов, которые широко распространены в земной коре и имеют огромное практическое значение в жизни человека - доля потребления железа среди металлов составляет 95%, марганец же используется как незаменимая легирующая добавка при производстве стали. В связи с этим не менее велико практическое значение прокариотических организмов, окисляющих или восстанавливающих железо и марганец. Прокариоты, аэробно окисляющие железо, используются, прежде всего, в гидрометаллургии, в процессе извлечения металлов из природных месторождений. Кроме того, железобактерии играют важную роль в коррозии металлов. Биотехнологический потенциал бактерий, окисляющих или восстанавливающих марганец, с успехом может быть использован в решении таких задач, как разрушение рекальцитрантных субстратов при биоремедиации, предотвращении эвтрофикации путем извлечения растворенного марганца из очищаемых стоков и других водных экосистем [12; 13; 16]. Последнее весьма важно
для акваэкосистем Курганской области, специфика гидрохимии которых как раз связана с высоким содержанием марганца и железа [5].
Несмотря на всю значимость этой группировки микроорганизмов, отдельные вопросы биоэкологии и систематики, а также роль и практическое значение железо-марганцевых бактерий в техногенных системах и процессах остаются недостаточно изученными. Дискуссионным, например, остается вопрос о роли железобактерий в процессе коррозии металлов: дыхательную активность аэробных микроорганизмов, образующих биопленки на поверхности стальных изделий долгое время считали одним из ведущих факторов коррозии, однако сегодня этим взглядам противопоставляется гипотеза хемопротекторной функции биопленок на поверхности стальных изделий, согласно которой такие биопленки не способствуют коррозии, а напротив, защищают от нее [12].
На территории Курганской области никто не занимался изучением биоэкологии этой интересной и практически важной эколого-трофической группы микроорганизмов, в связи с чем до сих пор остается неизвестным их истинная роль в региональных техногенных системах, производствах и процессах, не получила оценки перспектива использования железо-марганцевых бактерий, например, в качестве организмов-биоиндикаторов состояния водных и наземных природных и техногенных экосистем. Все это определяет высокую актуальность, значительный научный и практический интерес исследований биоэкологии железо-марганцевых бактерий в рамках технологических процессов и техногенных систем промышленных предприятий Южного Зауралья.
В связи с этим целью наших исследований было изучить биоэкологию железо-марганцевых бактерий и биопленок (состав и количественные характеристики) техногенных акваэкосистем, дать оценку индикаторной ценности отдельных видов и биопленок железо-марганцевых бактерий в биомониторинге состояния окружающей среды, уточнить роль в процессах коррозии металлических изделий и конструкций.
При этом задачами, которые планировалось решить в рамках поставленной цели, были:
1 Дать оценку численности и биохимической активности железо-марганцевых бактерий в техногенных водотоках, сточных водах и природных акваэкосистемах.
2 Изучить качественный состав железо-марганцевых бактерий сточных вод, водопроводной системы промышленных предприятий, иловых отложений речных экосистем, из которых происходит забор воды и сброс промышленных стоков предприятия, выделить доминирующие формы микроорганизмов.
3 Оценить возможность использования отдельных видов и биопленок железо-марганцевых микроорганизмов для индикации степени эвтро-фирования акваэкосистем и ремедиации (очист-
ки) сточных вод предприятия от катионов железа и марганца.
4 Провести гидрохимическое исследование воды водопроводной системы предприятия, сточных вод и речных экосистем.
5 Изучить роль железо-марганцевых бактерий в процессах биокоррозии металлических изделий и конструкций предприятия (водоводов, трубопроводов и др.).
6 Исследовать биоэкологию доминирующих форм железо-марганцевых бактерий: отношение к основным факторам среды обитания - кислороду, рН, температуре; процессы формирования биопленок на поверхности различных конструкций.
На исследование были выдвинуты рабочие гипотезы: имеющаяся в литературе информация об использовании водных микроорганизмов для биоиндикации и мониторинга состояния водных экосистем [1; 2; 7; 9] позволяет выдвинуть предположение о возможности использования в этих целях железо-марганцевых бактерий, в частности таких показателей, как видовое разнообразие биопленок, доминирование отдельных форм (нитчатых или одноклеточных), соотношение форм железо-марганцевых бактерий, соотношение между различными физиологическими группами водных микроорганизмов, степень их биохимической активности. Для выяснения характера изменения биопленок железо-марганцевых бактерий в техногенных системах и определения индикаторной ценности отдельных видов в различных по трофике и гидрологическим характеристикам акваэкосистемах требуется постановка модельных экспериментов.
Следует отметить, что экологические подходы к анализу водных микроорганизмов, в том числе железо-марганцевых бактерий, не столь разработаны, как при изучении микрофлоры наземных экосистем [10]. Временная и пространственная неоднородность водных экосистем (сезонная динамика, биологические циклы развития и др.), трудности отбора репрезентативных проб воды, недостаток сведений об индикаторной значимости видов в связи с региональными особенностями -все это существенным образом влияет на достоверность информации. В связи с этим существует необходимость в совершенствовании подходов и методов биологического мониторинга, расширения круга тест-объектов и получения их структурных и функциональных характеристик в целях более точного предсказания последствий загрязнения воды железом и марганцем, а также эффективности мероприятий по биоремедиации и защите акваэкосистем от процессов эвтрофикации.
Из литературных источников известно о роли железо-марганцевых бактерий и биопленок этих микроорганизмов, развивающихся на поверхности стальных изделий и конструкций, в процессах биокоррозии металлов [12; 16]. Считается, что железо-марганцевые бактерии выступают активными агентами коррозионных процессов, однако их ассоциации (биопленки) могут выполнять со-СЕРИЯ «ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ», ВЫПУСК 10
вершенно противоположную функцию - протекторную. Изменение функциональной активности может, по-видимому, происходить и в условиях флуктуаций ОВП окружающей среды. Исходя из имеющихся сведений, можно предположить, что участие в процессе коррозии железо-марганцевых бактерий будет зависеть от условий окружающей среды (аэробные или анаэробные), а также от стадии формирования биопленки: на начальной стадии железо-марганцевые бактерии могут выступить в качестве активного агента коррозии металлов, а на конечной стадии формирования биопленки - как биопротекторы. Выяснить истинную роль железо-марганцевых бактерий в процессах коррозии следует путем постановки модельных экспериментов, предусматривающих варьирование окислительно-восстановительного потенциала в зоне коррозионного процесса, а также изучение процесса коррозии в присутствии биопленок, находящихся на различных стадиях формирования.
научная новизна планируемых исследований заключается в том, что впервые в условиях Курганской области будет получена информация о биоэкологии железо-марганцевых бактерий и биопленок (состав и количественные характеристики) крупных техногенных и природных акваэкосистем, дана оценка индикаторной ценности как отдельных видов, так и биопленок железо-марганцевых бактерий в биомониторинге состояния окружающей среды, уточнена роль в процессах коррозии металлических изделий и конструкций. При этом будут предложены доступные для широкого круга специалистов методы оценки состояния техногенных и природных акваэкосистем по реакции отдельных видов или биопленок железо-марганцевых бактерий. Проведение исследований позволит решать практические задачи, связанные с организацией биологического мониторинга за состоянием водных акваэкосистем, защитой водоемов от эвтрофикации, предупреждении биокоррозии металлических изделий и конструкций промышленных предприятий Курганской области. схемы опытов и наблюдений I Наблюдения за общей численностью, биомассой и составом железо-марганцевых бактерий.
Контроль - стерильная питательная среда (стерильный образец воды) в культивационных сосудах, чашках Петри, лунках серологического планшета (повторность 4-кратная).
Вариант наблюдения - образец воды, отобранной на мониторинговой точке, засеянный в питательную среду в колбах, чашках Петри (посев на агаровую среду), пластиковых культивационных сосудах с поролоновыми блоками и стеклами обрастания (пенопластовыми блоками и стеклами обрастания) (вариант - вода; вариант вода + питательная среда полная и неполная), в лунках серологического планшета (обязательно комбинация с введением в образец воды питательной среды; + железная стружка).
Учеты: подсчет колоний на агаровых питательных средах; подсчет клеток на стеклах обрастания, определение биомассы клеток, определение скорости формирования и стадий развития биопленок железо-марганцевых бактерий, определение числа нитчатых и одноклеточных форм.
II Наблюдения за развитием биопленок железо-марганцевых бактерий.
Контроль - стерильная питательная среда (стерильные образцы воды).
Опыт - лунки серологического планшета засеваются образцами воды (чистыми культурами железо-марганцевых бактерий). Инкубация в течение 10 суток. Далее по классической схеме работы с биопленками бактерий лунки планшета обрабатываются красителем, краситель экстрагируется спиртом, и с помощью спектрофотометра определяется степень развития биопленки, доля и роль планктонных клеток. Постановка опыта может быть проведена в специальных культивационных сосудах (пластиковых чашках Петри).
III Модельные эксперименты по изучению роли биопленок железомарганцевых бактерий в процессах биокоррозии металлических изделий.
Контроль - стерильная питательная среда (стерильные образцы воды).
Опыт в аэробных условиях - в стерильную питательную среду вводится стерильный сегмент металлической проволоки, затем среди инокули-руется культурой железо-марганцевых бактерий. За процессами накопления гидроксида железа ведут наблюдения в аэробных условиях развития биопленок железо-марганцевых бактерий.
Опыт в анаэробных условиях - опыт проводится в культивационных сосудах, в которые стерильная питательная среда наливается высоким слоем, сегмент стальной проволоки помещают на дно сосуда и после инокуляции культурой железо-марганцевых бактерий культивационный сосуд закрывают резиновой пробкой либо помещают в анаэростат.
Методика проведения исследований
1 Методика отбора проб воды и грунтов для микробиологического анализа: пробы воды отбирают в поверхностном и придонном слое водоема при помощи батометра. Пробы воды для бактериологического анализа за исключением прямого счета необходимо отбирать в стерильную посуду. Для глубин, не превышающих 10 м, удобнее всего использовать бутыли Мейера. Пробы илов и грунтов отбирают дночерпателями различных конструкций. Согласно ГОСТа 18963-73 [3] для отбора проб воды используют стерильные флаконы вместимостью 0,5 л с притертой, каучуковой или корковой пробкой. Бумажный пакет или колпачок с флакона снимают вместе с пробкой непосредственно перед отбором пробы, не касаясь пробки руками. Наполняют флаконы с таким расчетом, чтобы при транспортировании не замочить пробку. Объем отбираемой пробы - 500 мл. Проба должна быть исследована не позже чем через 2 часа после 30
ее отбора. Анализ допускается проводить не позже чем через 6 часов после отбора пробы, сохраняя пробу при температуре от 1 до 50С. Пробу воды отбирают с соблюдением правил стерильности: руки перед отбором проб должны быть обеззаражены.
2 Базовая методика учета численности железо-марганцевых бактерий: основных представителей железо-марганцевых бактерий учитывают методом посева образцов исходной воды, ее разведений и разведений образцов грунта (илов) на плотные или жидкие питательные среды. Посев проводят на среду Виноградского (г/л): NH4NO3 -0,5; NaNO3 - 0,5; K2HPO4 - 0,5; MgSO4 - 0,5; CaCl2 - 0,2; аммиачно-железная соль лимонной кислоты - 10 г; агар - 15; вода дистиллированная. Для выделения чистых культур Leptothrix sp. рекомендуется на 1 л воды брать ацетата марганца -1,0 г, агара - 10 г. Базовой средой для учетов может стать ГА (голодный агар) - на основе проб воды, отобранной из мониторинговых точек, с введением ацетата марганца либо аммиачно-желез-ной соли лимонной кислоты [15].
Учеты могут также проводиться на стеклах обрастания, которые либо закладываются в специальные пластиковые контейнеры между двумя стерильными поролоновыми блоками, пропитанными исследуемой водой, либо жидкой питательной средой; либо стекла укрепляются в корковые пробки или пенопластовые блоки и погружаются в водоем (пластиковый контейнер) стеклами вниз. Просмотр стекол (иммерсионный объектив) после инкубации в воде водоема или в пластиковом сосуде с образцами водопроводной воды дает возможность выявить и провести количественные учеты нитчатых форм железо-марганцевых бактерий (L. ochracea, L. crassa, перекрученные оже-лезненные нити Gallionella). При обработке стекол 10%-й HCl железо растворяется, а нити обесцвечиваются. Если после обесцвечивания нанести каплю желтой кровяной соли K4[Fe(CN)6], то в присутствии окисного железа образуется темно-синий осадок берлинской лазури [7].
Чистые культуры бактерий, окисляющих органические формы железа (Siderocapsa, Seliberia, Pedomicrobium), получают на среде Прингсхейма в модификации Тиллера: дрожжевой экстракт -0,005%, MnSO44H2O - 0,002%, FeSO47H2O -0,002%, агар Дифко - 1,5%, вода дистиллированная [11; 15].
Рекомендуется определять в пробах воды и грунта общее число сапротрофных бактерий, в том числе содержание споровых форм. Подсчет сапро-трофов производится на МПА на третьи сутки после культивирования при t 200С. На каждую пробу воды засевают не менее 4 чашек [8].
Объем воды для посева выбирают с таким расчетом, чтобы не менее чем на 2 чашках выросло от 20 до 300 колоний. Из каждой пробы должно быть посеяно не менее 2 десятикратных разбавлений в двух повторностях. При исследовании заведомо чистых вод с содержанием сапрофитов до 300 в 1 мл
делают посев проб воды без разбавления по 1 мл в двух повторностях. При исследовании воды неизвестной степени микробного загрязнения производят посев четырех десятикратных разведений [4].
3 Методика проведения микробиологического анализа и учета результатов: после тщательного перемешивания пробы (можно пипеткой) приготовляют разбавления и немедленно вносят по 1 мл воды из пробы или соответствующего разбавления в стерильные чашки Петри, слегка приоткрывая крышки. Сразу же после внесения воды в каждую чашку вливают 5-7 мл расплавленного и остуженного агара после фламбирования края посуды, в которой он содержался. Затем быстро смешивают содержимое чашек, равномерно распределяя по всему дну, избегая образования пузырьков воздуха, попадания агара на края и крышку чашки. Не допускается посев из разбавлений, приготовленных заранее. Тонкий слой агара ограничивает рост расплывчатых колоний, а другие колонии вырастают более крупными. При учете результатов подсчитывают все выросшие на чашке колонии, видимые при увеличении в 2 раза [4].
Подсчитанное число колоний на каждой чашке делят на объем воды в мл, засеянный на те чашки, на которых велся подсчет и вычисляют среднее арифметическое. Результат выражают в числе КОЕ в 1 мл исследуемой воды, округляя до 2-3 значимых чисел. Результаты можно представить на основании подсчета колоний на одной чашке (с обязательной отметкой в протоколе анализа), если на других чашках отмечен рост расплывчатых колоний, охватывающих всю поверхность чашки; если число колоний превышает 300; если при посеве из разбавлений выросло менее 20 колоний. В протоколе анализа отмечают особые обстоятельства, могущие повлиять на результат - превышение срока хранения пробы, изменение температуры и времени инкубации посевов, отклонение от правила при учете результатов и т.п.
4 Методика получения и исследования биопленок железо-марганцевых бактерий: осуществляется параллельный высев проб воды с мониторинговых точек с помощью микропипетки -дозатора или обычной пипетки на 96-луночные планшеты и в пластиковые чашки Петри. Для инокуляции лунок планшета можно использовать следующую схему (рисунок 1).
На 1 планшету высевают необходимое количество образцов (штаммов), каждый образец (штамм) в 4 повторностях, кроме того 4 лунки для контроля фона (среда для культивирования железо-марганцевых бактерий) культивирования. После инокуляции лунок планшету закрывают крышкой и инкубируют при 270С в течение недели, после чего планшету извлекают и измеряют ОП выросших микробных взвесей + контрольных лунок. Затем суспензия из лунок отсасывается пипеткой, осуществляется промывание физиологическим раствором, чтобы удалить планктонные клетки. Одну из четырех лунок оставляют для измерения СЕРИЯ «ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ», ВЫПУСК 10
КОЕ путем высева на плотную питательную среду, три других подвергают дальнейшей обработке. Выросшие в них биопленки окрашивают генциан-виолетом (160 мкл/лунку, 45 мин, комнатная температура), дважды промывают физиологическим раствором, для экстракции краски из пленки добавляют 96%-й этиловый спирт (200 мкл/лунку, 45 мин). Затем оценивают интенсивность окрашивания спирта в лунках планшет на фотометре при 630 нм ОП выросших микробных взвесей, а также ОП экстрагированного с помощью спирта красителя определяют для того, чтобы пронаблюдать скорость размножения железо-марганцевых бактерий и определить, как протекает их развитие: в планктоне или в составе прикрепленных к поверхности сообществ - биопленок [8].
1 1Л Ш>, и ч м
-' и\ " : " ■ £
р )( Ф 01 1 И 3 з N
\ч);ч [ ч: а? и , и
X )( 1 * *
Рисунок 1 - Схема инокулирования лунок планшета для культивирования биопленок железо-марганцевых бактерий
Получение биопленок на покровных стеклах в чашках Петри - параллельно с высевом на планшеты проводят выращивание биопленок в пластиковых чашках Петри для дальнейшей визуализации. Для каждого образца воды необходимо 4 чашки Петри. Выращивание биопленок ведут 10 дней. На дно чашек опускают при помощи пинцета стерильные обезжиренные покровные стекла. Вносим в образец воды 0,2 мл питательной среды (суспензии микроорганизма). Далее инкубируют 4 ч при температуре 270С и добавляют свежую питательную среду до 2 мл. Учет результатов производят через 10 суток инкубирования из первых чашек Петри (визуализируем биопленку в световой микроскоп).
По уровню адсорбции красителя этанолом, измеренному в единицах оптической плотности ^630) на фотометре ELx808 (ВюТек, США), при длине волны 630 нм оценивают активность формирования биопленки. Для интерпретации полученных данных определяют способность железо-марганцевых бактерий формировать биопленки в соответствии со следующими критериями: при значениях OD630 ниже 0,090 принято считать, что штаммы не обладают способностью к образованию биопленки; при 0,090 < OD630 < 0,180 -штаммы обладают слабой; при 0,180 < OD630 < 0,360 - средней; при OD630 > 0,360 - высокой способностью к образованию биопленки.
Ассоциации железо-марганцевых бактерий in vitro получают путем смешивания суточных культур штаммов в соотношении 1:1 в лунках планшетов.
5 Методика выделения и культивирования железобактерий на минеральных средах, содержащих соли железа: среда Лиске (для Gallionella) -(NH4)2SO4 - 1,5; KCl - 1,05; MgSO47H2O - 0,05; K2HPO4 - 0,05; Ca(NO3)24H2O - 0,01; дистиллированная вода - 1 л. Отдельно стерилизуют измельченную железную проволоку. Перед посевом ее вносят в колбочки (50 мг на 1 колбочку) и засевают образцами воды. Среду Лиске разливают в колбочки тонким слоем и стерилизуют при 1,5 атм. Культивирование ведут при комнатной температуре (или при температуре 10-150С). Бактерии Gallionella образуют на дне колбочки охряные хлопья. Для получения культуры Leptothrix применяют агаризован-ную среду Виноградского с железоаммониевой солью лимонной кислоты. Колонии Leptothrix имеют на этой среде коричневую окраску [14].
6 Методика изучения «микробного пейзажа» на стеклах обрастания: для прямого микроскопи-рования стекло обрастания обрабатывают слабым раствором соляной кислоты, промывают водой, сушат, фиксируют и красят генциановым фиолетовым (эритрозином). На препарат наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют, используя иммерсионный объектив и окуляр 10х. При просмотре препарата обнаруживают ярко окрашенные клетки или цепочки клеток, расположенные внутри бесцветных нитей или вышедшие из них. Подсчитывают клетки в поле зрения микроскопа. Каждое стекло обрастания микроскопируют в трех секторах: левом, среднем и правом по 30 полей зрения в каждом. Общее число полей зрения должно быть не менее 400. Пересчитывают количество объектов на площадь поверхности стекла (определяют плотность популяции) по формуле: С = S * N / S0 , где S - площадь, на которую проводится пересчет, см2; N - среднее количество объектов в поле зрения микроскопа; S0 - площадь поля зрения, см2.
Площадь поля зрения микроскопа при данном сочетании объектива и окуляра определяют с помощью объект-микрометра. Для этого объект-микрометр помещают на предметный столик микроскопа, наносят на него каплю иммерсионного масла и определяют вначале диаметр, а затем радиус поля зрения. Найденное значение радиуса подставляют в формулу S = p R2. (Например, одно деление объект-микрометра равно 0,01 мм. В поле зрения микроскопа поместилось 10 делений, т.е. диаметр равен 0,1 мм, значит, R будет равно 0,05 мм, а S - 0,0078 мм2 (3,14 * 0,052)).
7 Методика статистической обработки данных модельных экспериментов: метод «хи-квадрат» (Х2) - для расчёта методом Х2 необходимо построить четырёхпольную решётку количества наблюдений за наличием и отсутствием на стёклах обрастания железо- и серобактерий.
Далее рассчитывают индекс ассоциативности (r4).
Г4 =
| axd-bxc |-п/2
(а + Ь) (с+ d) (а +с) (Ь + йГ)
где а - число полей зрения, где встречаются железо-и серобактерии;
Ь - число полей зрения, где нет серобактерий и есть железобактерии;
с - число полей зрения, где нет железобактерий и есть серобактерии;
d - число полей зрения, где нет железо- и серобактерий;
п - число полей зрения. Затем находим X2. у2 _ _ у
л и ^ г ^ , где п - число полей зрения; г4 - индекс ассоциативности. Полученные результаты необходимы для оценки взаимосвязи между ассоциациями железо- и серобактерий [6].
Список литературы
1 Биоиндикация экологического состояния равнинных рек /под ред. О. В. Бухарина, Г. С. Розенберга. - Москва : Наука, 2007. - 403 с.
2 Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование / под ред. О. П. Мелеховой,
Е. И. Егоровой. - Москва : Издательский центр «Академия», 2007. - 288 с.
3 ГОСТ 18963-73 Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа / Санитарно-экологические нормативы качества воды (Сборник материалов). - Москва : Промэкознание, 1992. - 239 с.
4 Евсеев В. В. Лабораторный практикум по экологии микроорганизмов. - Курган : Изд-во КГУ, 2007. - 128 с.
5 Закарян Э. Л. Виссарионова М. Е, Бородина Т. Ю, Митрофанов П. Г., Мамонтов Ю. И. К вопросу о качестве питьевой воды в студгородке Лесники // Экология и здоровье: материалы научно-практической конференции. -Курган : ИПП «Зауралье», 1996. - С. 87-89.
6 Кожевин П. А. Микробные популяции в природе. -Москва : Изд-во Моск. ун-та, 1989. - 175 с.
7 Козлов М. Н, Дорофеев А. Г., Асеева. В. Г. Микробиологический контроль активного ила биореакторов очистки сточных вод от биогенных элементов. -Москва : Наука, 2012. - 80 с.
8 Методические указания по санитарно-микробиологи-ческому анализу воды поверхностных водоемов (1981 г.) // Санитарно-экологические нормативы качества воды (Сборник материалов). - Москва : Промэкознание, 1992. -239 с.
9 Методы биоиндикации и биотестирования природных вод. - Ленинград : Гидрометеоиздат, 1989. - 279 с.
10 Никитина З. И. Микробиологический мониторинг наземных экосистем. - Новосибирск : Наука. Сиб. отд-ние, 1991. - 222 с.
11 Определитель бактерий Берджи : в 2 т. - Москва : Мир, 1997. - Т 2. - 329 с.
12 Пиневич А. В. Микробиология железа и марганца. -Санкт-Петербург : Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2005. - 374 с.
13 Самоочищение и биоиндикация загрязненных вод. -Москва : Изд-во «Наука», 1980. - 240 с.
14 Сэги Й. Методы почвенной микробиологии / под ред. Г. С. Муромцева. - Москва, 1983.
15 Теппер Е. З., Шильникова В. К., Переверзева. Практикум по микробиологии : учебное пособие для вузов / под ред. Шильниковой В. К. - 5-е изд., перераб. и доп. - Москва : Дрофа, 2004. - 256 с.
16. Экология микроорганизмов / под ред.А. И. Нетрусова. -Москва : Издательский центр «Академия», 2004. - 272 с.
