CC BY
75
Химия растительного сырья. 2001. №4. С. 69-72.
УДК 630.905
БИОДЕСТРУКЦИЯ ЛИСТВЕННИЧНОЙ ОДУБИНЫ ГРИБАМИ TRICHODERMA ASPERELLUM, TRICHODERMA KONINGI
© Е.Г. Махова, Т.В. Рязанова', Н.А. Чупрова
Сибирский государственный технологический университет, пр. Мира, 82, Красноярск, 660049 (Россия) e-mail [email protected]
Проведена оценка способности аборигенных гифомицетов T. koningi Rifai МК, T. asperellum МГ Samuels et al. к деструкции лигноуглеводных компонентов лиственничной одубины в процессе твердофазной ферментации в чашках Петри. Установлено, что грибы способны быстро колонизировать субстрат и продуктивно спороносить. Одубина является более доступным субстратом для гриба T. koningi МК. Измельчение одубины увеличивает доступность лигниновых веществ для ферментов грибов. Отсутствует корреляция между способностью грибов к деструкции лигноуглеводных веществ и наличием у них фенолоксидаз.
Введение
При производстве дубильных экстрактов из коры лиственницы проэкстрагированная кора (одубина), составляющая около 50% от исходной массы коры, до сих пор не нашла широкого применения на территории Сибири и вывозится на свалки, загрязняя окружающую среду. Однако следует отметить, что Архангельским институтом леса и лесохимии совместно с Вышневолоцким заводом дубильных экстрактов разработана технология приготовления на основе одубины одубиноминеральных и одубинопометных компостов для использования последних в качестве тепличных грунтов и удобрений
[3, 6].
По химическому составу лиственничная одубина, несмотря на извлечение из коры вместе с дубителями целого ряда водорастворимых органических и минеральных веществ, обладает значительным биоэнергетическим и гумусообразующим потенциалом. Основную массу одубины (около 73%) составляют целлюлоза и лигнин, которые играют большую роль в сорбционных и ионообменных процессах. Легкогидролизуемые полисахариды (гемицеллюлозы), на долю которых приходится около 20%, могут быть главным источником углеродного питания растений и стимуляторами биологической активности почвы. Однако из-за низкого содержания в одубине азота и широкого отношения C : N внесение одубины в естественном состоянии в почву не рекомендуется. При внесении такой одубины в почву из-за наличия в ней большого числа углеродсодержащих веществ происходит бурное развитие микроорганизмов в грунте, которые для построения своих клеток вынуждены, ввиду недостатка азота в одубине, поглощать из него минеральные формы азота и тем самым ухудшать питательный режим растений [2].
В Красноярском крае, где мощно развита деревообрабатывающая промышленность, одубина может быть дешевым субстратом для биопрепаратов на основе грибов рода Trichoderma. Предпосылками для использования ее на эти цели являются низкое содержание дубильных веществ, которые, по мнению
* Автор, с которым следует вести переписку.
некоторых исследователей, могут оказать ингибирующее действие на рост растений, микроорганизмов, высокую пористость и сорбционную способность, благоприятный для роста грибов рода Trichoderma фракционный состав.
В настоящее время все большее значение приобретает биологический метод защиты растений, позволяющий воздействовать на патогенные микроорганизмы, снижая численность их популяций с минимальным нарушением структуры биоценозов [5]. Особого внимания заслуживают грибы рода Trichoderma, повсеместно распространенные в почвенных микробиоценозах как сапрофиты и занимающие ведущее место среди агентов биологической борьбы с многими фитопатогенными микроорганизмами. Грибы этого рода известны в основном как эффективные деструкторы целлюлозы и мало изучены как биодеструкторы лигнина.
Экспериментальная часть
В работе использовали аборигенные культуры грибов T. koningi Rifai, T. asperellum Samuels et al., предоставленные кандидатом биологических наук Т.И. Громовых из коллекции микроорганизмов Красноярского государственного университета. Грибы T. koningi Rifai, T. asperellum МГ Samuels et al. активны в отношении фитопатогенов из родов Alternaria, Phyium, Fusarium; характеризуются высокой продуктивностью конидиоспор и способностью быстрого накопления биомассы. Гриб T. koningi МК обладает высокой целлюлолитической активностью. Оптимум для роста этих изолятов - 25-30°С.
Грибы рода Trichoderma выращивали на средах А, В, С, отличающихся по минеральному составу и степени помола (табл. 1). Среды А и В дополнительно измельчали в аппарате гидродинамического размола, работающего по типу «струя - преграда» до 33, 60° ШР (Шоперра-Риглера). В связи с низким содержанием в исходной одубине зольных веществ - 2,4%, для роста грибов вносили минеральное питание в размере 1, 3, 5% на абсолютно сухую массу (а.с.м.) сырья в виде солей NaNO3, MgSO4, FeSO4, KH2PO4, КС1 (стандартная синтетическая среда Чапека).
Подготовленные таким образом среды увлажняли до 80%, pH=5, помещали в чашки Петри (4 г а.с.м.) и стерилизовали в автоклаве в течение 30 мин при 100°С. Субстрат засевали споровой суспензией гриба из расчета 1-107 спор на 1 грамм а.с.м. среды. Грибы инкубировали в термостате при температуре 25°С.
Химический состав одубины анализировали по методикам, принятым в химии растительного сырья [4]. Содержание веществ лигниновой природы определяли по методу Кенинга с 72%-й серной кислотой. Количество полисахаридов определяли эбулиостатическим методом, основанным на принципе прямого титрования. Титр спор рассчитывали с использованием камеры Горяева.
Обсуждение результатов
При изучении роста грибов на среде В уже на 4-е сутки культивирования наблюдали сплошной слой спор грибов на всей поверхности субстрата (споры, окрашенные в зеленый цвет, придавали зеленую окраску всей поверхности субстрата), а на 15-е сутки в результате глубокого проникновения гиф в субстрат первоначально рыхлая одубина приобрела комковатую структуру. Очаги спороношений грибов на среде С были визуально заметны на 8-е сутки культивирования. На среде А на 4-е сутки эксперимента хорошо виден поверхностный мицелий грибов. Следует отметить, что при 80%-й влажности и степени помола 60° ШР происходит адгезия частиц субстрата, что препятствует глубокому проникновению гиф и ингибирует конидиогенез грибов рода Trichoderma. Таким образом, на среде А конидиогенез грибов замедлен: микроорганизмы в первую очередь накапливали биомассу мицелия.
Нами установлено, что в зависимости от режима подготовки сырья исследуемые грибы рода Trichoderma в разной степени деструктируют лигноуглеводный комплекс одубины. Однако в целом лиственничная одубина является более доступным субстратом для гриба T. koningi МК, чем для T. asperellum МГ, что подтверждается данными, представленными в таблицах 2, 3 и 4.
Таблица 1. Выход конидий грибов рода Тпскоёегша на лиственничной одубине
Среда Минеральная добавка, % Степень помола, °ШР Продолжительность культивирования Выход конидий, споры/г
Т. копіщі Т. азрегеїіиш
А 5 60 35 5,6 -108 3,9•108
В 3 33 15 1,8 -109 6,1- 108
С 1 6 25 2,4 -108 1,2 • 108
Таблица 2. Химический состав среды А до и после микробной деструкции
Показатели, % а. с. м. До биодеструкции После биодеструкции
Т. копіщі Т. азрегеїіиш
Легкогидролизуемые 20,5 12,5 13,0
полисахариды 11,0 11,8
Трудногидролизуемые 34,5 33,0 38,5
28,3 33,9
полисахариды
Негидролизуемые 72%-й 40,7 35,2 36,2
Н2В04 (лигнин и др.) 30,9 32,9
Убыль массы образца 0,0 12,0 9,3
Примечание. В числителе представлены данные без учета убыли массы образца; в знаменателе - с учетом убыли массы образца.
Таблица 3. Химический состав среды В до и после микробной деструкции
Показатели, % а.с.м. До биодеструкции После биодеструкции
Т. копіщі Т. азрегеїіиш
Легкогидролизуемые 19,7 16,4 12,3 16,4 13,3
полисахариды
Трудногидролизуемые 30,9 33,4 25,0 34,0 27,7
полисахариды
Негидролизуемые 72%-й 41,8 23,2 32,8
Н2Б04 (лигнин и др.) 17,3 26,7
Убыль массы образца 0,0 25,0 18,5
Примечание. В числителе представлены данные без учета убыли массы образца, в знаменателе - с учетом убыли массы образца.
Таблица 4. Химический состав среды С до и после микробной деструкции
Показатели, % а.с.м. До биодеструкции После биодеструкции
Т. копіщі Т. азрегеїіиш
Легкогидролизуемые 15.4 12.6 14.0
полисахариды 11.8 13.4
Трудногидролизуемые 32.8 31.5 29.6 34.1 32.7
полисахариды
Негидролизуемые 72%-й 42.9 35.5 38.1
Н2Б04 (лигнин и др.) 33.3 36.5
Убыль массы образца 0.0 6.4 3.7
Примечание. В числителе представлены данные без учета убыли массы образца, в знаменателе - с учетом убыли массы образца
На среде С грибы действуют в первую очередь на гемицеллюлозы и в равной степени деструктируют как лигнин, так и целлюлозу - в 1,2 раза. Гриб Т. квп^г МК обладает высокой целлюлолитической активностью - утилизировал целлюлозу в 1,2 раза при росте на средах. Гриб Т. а8рете11ыт МГ утилизировал целлюлозу в 1,1 раза на среде В, не затрагивал целлюлозу при росте на среде С. Важно
отметить, что в образцах среды В содержание лигниновых веществ уменьшилось в 2,4 раза (табл. 3). По приведенным данным можно видеть, что дополнительное измельчение одубины влияет, главным образом, на доступность лигниновых веществ для ферментов грибов.
Можно предположить, что первичное воздействие при разрушении лигнина осуществляют экзоферменты. Поскольку грибы, разрушающие лигнин, обычно выделяют фенолоксидазы, считают, что именно эти ферменты ответственны за отщепление ароматических соединений. До сих пор, однако, не удалось доказать эту функцию фенолооксидаз при разрушении лигнина; в особенности это касается разрыва углерод-углеродных и эфирных связей [7]. Поэтому наряду с оценкой степени утилизации лигниновых веществ изучали и наличие у грибов фенолоксидазной активности по Бавендамму [8]. Нами установлено, что исследуемые грибы не обладают фенолоксидазной активностью. Таким образом, можно сделать вывод об отсутствии корреляции между способностью грибов разрушать лигниновые вещества и наличием у них фенолоксидаз. В связи с этим отметим, что Л. А. Головлева и др. (1982) из различных природных источников выделели 24 культуры грибов, в том числе рода Trichoderma, способных расти на средах с нативным лигнином (лигнин березы, подготовленный по Бъеркману). Исследователи установили, что основная масса грибов хотя и росла на среде с лигнином, фенолооксидазной активностью не обладала.
Одновременно с процессами деструкции в одубине происходит накопление гуминовых веществ. Гриб T. asperellum МГ Samuels et al., несмотря на более низкую по сравнению с T. koningi МК Rifai способность к деструкции целлюлозы и лигниновых веществ обладает большей активностью в отношении накопления гуминовых кислот - при утилизации лиственничной одубины (среда В) на 18,5% накопление гуминовых кислот в субстрате составляет 14,3%.
Таким образом, результаты исследований показали возможность использования грибов рода Trichoderma для первичного этапа биоконверсии лиственничной одубины. Деструктированный остаток может вноситься в почву для улучшения ее структуры и снижения инфекционного фона микробиоценозов.
Список литературы
1. Головлева Л. А., Ганбаров Х.Г., Скрябин Г.К. Разложение лигнина грибными культурами // Микробиология. 1982. Т. 51. Вып. 4. С. 543-547.
2. Гриорьева Г.В., Калугина З.С., Рыбинская А.П. Безотходная переработка еловой и ивовой коры в дубильноэкстрактовом производстве // Труды ЦНИИМЭ. 1988. С. 543.
3. Калугина З.С., Варфоломеев Л.А., Мошкова Т.Б. Рекомендации по приготовлению органических удобрений на основе древесных отходов и куриного помета. Архангельск, 1987. 13 с.
4. Рязанова Т.В., Чупрова Н.А., Исаева Е.В. Химия древесины. Красноярск, 1996. 358 с.
5. Сидорова И.И. Биологические методы борьбы с фитопатогенными грибами // Итоги науки итехники. защита
растений. Вирусные и грибные болезни растений и борьба с ними / Под ред. Г.А. Дьяковой. Т. 2. М., 1988. С. 116-157.
6. Синников А.С., Калугина З.С. Рекомендации по использованию древесной коры в качестве тепличного грунта в лесном и сельском хозяйстве. Архангельск, 1984. 12 с.
7. Шлегель Г. Общая микробиология / Пер. с нем. М., 1987. С. 415.
8. Bawendamm W.Z., Pflanzenkrankh, 1982. B. 38. P. 257.
Поступило в редакцию 24 августа 2001 г.
