CC BY
104
Безопасность и иммуногенность инактивированной гриппозной вакцины с адъювантом совидон производства ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России
A.Н. Никифорова1 (a.n.nikiforova@microgen.ru), А.Н. Миронов1, Д.С. Бушменков1,
B.А. Меркулов2, Н.Н. Степанов2
1ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России, Москва 2Филиал ФГУ «48-й ЦНИИ Минобороны России - ВЦ», Московская область, г. Сергиев Посад
Резюме
В статье приводятся результаты доклинического исследования безопасности и эффективности инактивированной гриппозной вакцины, в состав которой входит адъювант совидон. Полученные данные позволяют говорить о хорошей переносимости, безопасности и высокой иммуногенности данной вакцины.
Ключевые слова: доклинические исследования, безопасность, иммуногенность, инактивированная вакцина, гриппозная вакцина, совидон
Safety and Immunogenicity of Inactivated Influenza Vaccine Associated with Sovidon, Developing by «Microgen»
A.N. Nikiforova1 (a.n.nikiforova@microgen.ru), A.N. Mironov1, D.S. Bushmenkov1, V.A. Merkulov2, N.N. Stepanov2 1Federal State Scientific-Industrial Company for Immunobiological Medicines «Microgen» of the Ministry of Health and Social Devel-oppment of Russia, Moscow
2Filial of the Defense Research Institute № 48, Moscow District, of Sergiev Posad Abstract
This article has been showed the results of evaluation of safety and immunogenicity of inactivated influenza vaccine associated with sovidon. Findings demonstrate a good tolerability, safety and high immunogenicity.
Key words: non-clinical study, safety, immunogenicity, inactivated vaccine, influenza vaccine, sovidon
Введение
Грипп продолжает оставаться одной из главных проблем здравоохранения во всем мире [8]. Особую опасность он представляет для детей, людей старшего возраста и лиц, страдающих онкологическими заболеваниями, диабетом, а также заболеваниями легких, почек и сердца, так как может вызвать серьезное ухудшение течения основного заболевания, развитие пневмонии и в итоге привести к летальному исходу [7, 10, 12].
В отличие от других вирусов, используемых для приготовления вакцин, в вирусах гриппа происходят частые антигенные изменения гемаг-глютинина (НА) и нейраминидазы (ИД) - двух поверхностных гликопротеинов, являющихся основными стимуляторами выработки нейтрализующих антител [1, 3, 6]. Вакцины, при совпадении использованных вакцинных штаммов вируса гриппа с циркулирующими типами и своевременном применении, способны защитить от заболевания до 80% привитых.
Всемирная система надзора за гриппом ВОЗ и Комиссия по гриппозным вакцинным и диагностическим штаммам ежегодно рекомендуют актуальные вакцинные штаммы [5, 11].
Глобальная система мониторинга циркуляции вирусов, современные технологии выделения и
очистки вакцинных штаммов, использование новых субстратов для их выращивания и адъювантов позволяют производить достаточно эффективные и безопасные препараты [9, 14].
Поскольку на фармацевтическом рынке для профилактики гриппа уже существует ряд зарубежных и отечественных вакцинных препаратов, чтобы вывести на рынок новую гриппозную вакцину, необходимо наряду с ее хорошей переносимостью и безопасностью показать и высокую иммунологическую эффективность - по крайней мере, не ниже, чем у существующих вакцин.
Окончательное подтверждение более высокой эффективности каждой новой вакцины получают на основании результатов доклинических и клинических испытаний в сравнении с существующими вакцинами [13].
В ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России была разработана инактивированная вакцина для специфической профилактики сезонного гриппа, в состав которой входит препарат сови-дон, обладающий адъювантными свойствами и потенциально обеспечивающий высокую иммуногенность и протективность.
Совидон - синтетический полимер. При электронно-микроскопическом исследовании была показана способность препарата кооперативно связываться с гемаг-
глютининами вируса гриппа, сохраняя их нативную структуру. Считают, что такие конъюгаты способствуют развитию Т-независимого иммунитета, а также позволяют максимально снизить количество антигена в вакцине, а значит, и возможность побочных явлений [2, 4].
Препаратом сравнения была выбрана отечественная полимер-субъединичная вакцина Грип-пол, широко используемая на территории РФ для профилактики гриппа.
Для утверждения окончательного состава инактивированной вакцины (количество совидо-на - 250 или 500 мкг) необходимо было провести доклиническое исследование, подтверждающее безопасность как нового адъюванта, так и вакцины в целом. Кроме того, в качестве одного из основных критериев выбора дозировки адъюванта выступала степень иммуногенности исследуемых вакцин, то есть их защитного потенциала.
Материалы и методы
Исследуемые препараты. Инактивированная гриппозная вакцина с адъювантом совидоном содержит очищенные субъединицы вируса гриппа (гемагглютинин и нейраминидазу) типа А (подтипов Н1И1, Н3И2) и типа В. Вакцина выпускается с консервантом и без него (консервант - мертиолят производства ФГУП «НПО «Микроген»).
Препарат совидон производства ЗАО «Институт фармацевтических технологий» представляет собой белый или желтоватый аморфный порошок со слабым специфическим запахом, электролизуется, гигроскопичен.
Препарат сравнения - вакцина Гриппол, гриппозная трехвалентная полимер-субъединичная жидкая, раствор для внутримышечного и подкожного введения. Вакцина представляет собой поверхностные гликопротеины (гемагглютинин и нейраминидазу), выделенные из очищенных вирусов гриппа типов А и В, в комплексе с водорастворимым высокомолекулярным иммуностимулятором полиоксидонием.
В качестве контрольного вещества использовали 0,9%-ный физиологический раствор для инъекций производства ФГУП «НПО «Микроген». Препарат представляет собой прозрачную бесцветную жидкость без осадка.
Работа осуществлялась на лабораторной базе филиала «48-й ЦНИИ Минобороны России - ВЦ» (г. Сергиев Посад) в соответствии с требованиями нормативных документов, регламентирующих проведение доклинических исследований на территории страны. Изучение препаратов проводилось на беспородных хорьках (возраст - 6 - 12 месяцев, масса тела - от 1100 до 1500 г), серонегативных по отношению к циркулирующим в настоящее время штаммам вируса гриппа типов А и В, рекомендованным ВОЗ и Комиссией по гриппозным вакцинным и диагностическим штаммам на данный
эпидемический сезон. Всего было восемь групп животных, получивших один из следующих препаратов:
• инактивированная вакцина с консервантом (совидон 250 мкг);
• бесконсервантная вакцина (совидон 250 мкг);
• инактивированная вакцина с консервантом (совидон 500 мкг);
• бесконсервантная вакцина (совидон 500 мкг);
• совидон в дозе 500 мкг;
• совидон в дозе 250 мкг;
• вакцина Гриппол;
• физиологический раствор.
В каждой группе было по десять особей (пять самок и пять самцов). Хорькам вводили препараты однократно внутримышечно, наблюдали в течение 21 суток.
Безопасность вакцин оценивали по внешнему виду хорьков, их поведению, динамике веса и температуры тела. На 21-е сутки опыта животных подвергали эвтаназии путем внутримышечного введения раствора препарата Золетил 100 в дозе 120 мг/кг в 0,12 мл до полного угнетения основных функций ЦНС. После этого проводили полную некропсию тел животных. Для проведения гистологических исследований отбирали печень, селезенку, сердце, легкое, головной мозг и тонкий отдел кишечника.
Иммуногенные свойства вакцинных препаратов были изучены путем оценки гуморального иммунитета в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) в пробах сывороток крови хорьков.
Для проведения статистических исследований были использованы статистические программы Statistica 6.0 и SPSS. Для создания базы данных -программа MS Excel. Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием параметрических и непараметрических методов. Критический уровень значимости при проверке гипотез Р = 0,05.
Результаты и обсуждение
За время наблюдения за животными не было выявлено никаких отклонений в их соматическом и неврологическом статусе.
Всех их взвешивали до начала исследования и ежедневно после введения препарата, до завершения исследования. Изменения массы тела животных представлены в таблице 1. Полученные данные свидетельствуют о положительной динамике данного показателя у получивших вакцины и совидон в разных дозировках.
Температуру тела у хорьков регистрировали ежедневно с помощью термометров, проверенных в установленном порядке (табл. 2). Данные, представленные в таблице, подтверждают, что температура тела животных в опытных и контрольных группах в течение срока наблюдения оставалась в пределах нормы.
Таблица 1.
Изменение массы тела хорьков (М ± т), кг
Препараты 1-е сутки 2 - 14-е сутки 15 - 21-е сутки
Вакцина с совидоном (500 мкг) и консервантом 1,4 ± 0,59 1,4 ± 0,58 1,42 ± 0,58
Вакцина с совидоном (250 мкг) и консервантом 1,3 ± 0,16 1,32 ± 0,16 1,32 ± 0,16
Бесконсервантная вакцина с совидоном (500 мкг) 1,3 ± 0,12 1,38 ± 0,09 1,4 ± 0,1
Безконсервантная вакцина с совидоном (250 мкг) 1,3 ± 0,08 1,28 ± 0,08 1,31 ± 0,1
Совидон (500 мкг) 1,3 ± 0,12 1,33 ± 0,13 1,34 ± 0,13
Совидон (250 мкг) 1,3 ± 0,21 1,34 ± 0,08 1,38 ± 0,1
Вакцина Гриппол 1,3 ± 0,06 1,28 ± 0,07 1,31 ± 0,06
Физиологический раствор 1,3 ± 0,13 1,3 ± 0,13 1,19 ± 0,46
Таблица 2.
Изменение температуры тела хорьков (М ± т),°С
Препараты 1 - 14-е сутки 15 - 21-е сутки
Вакцина с совидоном (500 мкг) и консервантом 38,6 ± 0,29 38,5 ± 0,26
Вакцина с совидоном (250 мкг) и консервантом 38,7 ± 0,32 38,5 ± 0,28
Бесконсервантная вакцина с совидоном (500 мкг) 38,6 ± 0,3 38,5 ± 0,28
Бесконсервантная вакцина с совидоном (250 мкг) 38,6 ± 0,31 38,5 ± 0,25
Совидон (500 мкг) 38,7 ± 0,37 385 ± 0,27
Совидон (250 мкг) 38,6 ± 0,31 38,5 ± 0,25
Вакцина Гриппол 38,7 ± 0,3 38,5 ± 0,28
Физиологический раствор 38,7 ± 0,3 38,5 ± 0,28
Рисунок 1.
Миокард животного из групп исследования
При осмотре внутренних полостей, органов и тканей животных на 21-е сутки установлено, что их состояние в опытных группах не отличалось от такового в контрольных группах. Масса органов у хорьков из опытных групп также находилась в пределах нормы.
В результате исследований не обнаружено патологических изменений у лабораторных животных, получивших как вакцины, так и только совидон (250 и 500 мкг).
Слизистая кишечника была сохранена на всем его протяжении. Наблюдавшийся умеренный отек
Таблица 3.
Величина титра специфических антител в РТГА
Вакцина Вирус гриппа Количество адъюванта Величина титра антител в РТГА
на 14-е сутки на 21-е сутки
Вакцина с совидоном и консервантом В 250 1:10 1:20
500 1:20 1:40
А(H3N2) 250 1:40 1:160
500 1:80 1:320
А(ЖШ) 250 1:10 1:40
500 1:20 1:160
Бесконсервантная вакцина с совидоном В 250 1:10 1:20
500 1:10 1:40
А(H3N2) 250 1:40 1:320
500 1:80 1:640
А(ЖШ) 250 1:10 1:80
500 1:40 1:320
Гриппол В 500 1:10 1:20
А(H3N2) 1:40 1:320
А(ЖШ) 1:10 1:40
Физиологический раствор В Нет Менее 1:10 Менее 1:10
А(H3N2) Менее 1:10 Менее 1:10
А(ЖШ) Менее 1:10 Менее 1:10
Рисунок 2.
Крупный бронх животного из групп исследования
подслизистого слоя был характерен для всех животных - и в опытных, и в контрольной группах, следовательно, данные изменения не могли быть связаны с введением препаратов.
У хорьков из опытных и контрольной групп наблюдали умеренный перицеллюлярный отек, пол-
нокровие мягкой мозговой оболочки, у некоторых - с периваскулярными кровоизлияниями. Вероятно, подобные изменения были вызваны передозировкой препарата Золетил 100, который применяется при эвтаназии животных и вводится до полного угнетения основных функций ЦНС.
Строение печени во всех исследованных случаях - в пределах возрастных и индивидуальных особенностей животных: у некоторых из них имелась вакуолярная и жировая дистрофия гепато-цитов. Кроме того, у части животных, как в опытных, так и в контрольной группах, в большей или меньшей степени был выражен мускатный рисунок печени, что часто встречается при остром токсическом отравлении, например этиленглико-лем; скорее всего, это изменение также связано с передозировкой препарата Золетил 100.
Во всех исследованных группах животных миокард был нормального строения (рис. 1).
На рисунке 2 представлен крупный бронх, покровный, мерцательный эпителий сохранен, пери-бронхиальное пространство - без особенностей. В легких патология также не обнаружена. Данная гистологическая картина была характерна для всех животных.
Обнаруженная вариабельность в строении зародышевых центров в фолликулах селезенки хорьков отражала не патологические изменения, а лишь индивидуальные иммунологические особенности каждого животного.
Таким образом, было подтверждено, что адъю-вант совидон в обеих дозировках, а также гриппозные вакцины, в состав которых он входил, при однократном внутримышечном введении не токсичны и безопасны для хорьков.
На момент вакцинации у всех хорьков титр специфических антител к вирусу гриппа типов А и В в РТГА не превышал 1:10, что говорит об их серо-негативности. Иммуногенность гриппозных вакцин определяли в РТГА на 14-е и 21-е сутки после иммунизации. Результаты определения титра вирус-
специфических антител у лабораторных животных представлены в таблице 3.
Наиболее высокие титры специфических антител были достигнуты на 21-е сутки при иммунизации хорьков гриппозной инактивирован-ной вакциной без мертиолята: для вируса гриппа А(Н1И1) - 1:320, для Д(Н3И2) - 1:320 и для гриппа типа В - 1:40, что даже выше, чем у препарата сравнения Гриппол, - 1:40, 1:320, 1:20 соответственно.
В целом иммуногенность гриппозной инакти-вированной вакцины была выше при содержании 500 мкг адъюванта совидон в дозе, поэтому именно эта дозировка была выбрана для дальнейшего изучения вакцины.
Выводы
Таким образом, в ходе доклинических исследований был подтвержден высокий уровень безопасности совидона и инактивированных гриппозных вакцин, в состав которых он входил. При изучении иммуногенности гриппозных вакцин в РТГА была показана потенциально высокая иммуногенность вакцины с совидоном - как с консервантом, так и без него - и определена оптимальная доза нового адъюванта в составе вакцинного препарата. При этом уровень специфических антител при иммунизации животных вакцинами против сезонного гриппа, содержащими совидон в дозе 500 мкг, был выше, чем у животных, привитых вакциной Гриппол. Все это позволяет рекомендовать инактивиро-ванную гриппозную вакцину с совидоном без мертиолята и с мертиолятом к проведению дальнейших доклинических и клинических исследований на ограниченном контингенте добровольцев. ш
Литература
1. Гринбаум Е.Б., Литвинова О.М., Банников А.И. и др. Полиморфизм популяции современных вирусов гриппа А и В человека // Вестник РАМН. 1994. № 9. С. 36 - 40.
2. Петров РВ., Хаитов Р.М. Конъюгированные полимер-субъединичные иммуногены и вакцины // Вестник РАМН. 2003. № 1. С. 10 - 14.
3. Слепушкин А.Н., Львов Д.К., Маринич И.Г. и др. Эпидемиологические особенности гриппа последних лет // Вопр. вирусологии. 1998. № 2. С. 59 - 62.
4. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В. Современные иммуномодуляторы: основные принципы их применения // Иммунология. 2000. № 5. С. 4 - 8.
5. Bridges C.B., Fukuda K., Uyeki T.M. et al. Prevention and control of influenza: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP) // MMWR Recomm. Rep. 2002. V. 51. P 1 - 31.
6. Сох N.J., Fukuda К. Influenza // Infect. Dis. Clin. N. Amer. 1998. V. 12. P. 7 - 37.
7. Dip R.M., Cabrera M.A. Influenza vaccination in non-institutionalized elderly: a population-based study in a medium-sized city in Southern Brazil // Cad. Saúde Pública, Rio de Janeiro. 2010. V. 26 (5). P 1035 - 1044.
8. Gasparlni R., Pozzi T., Cuneo-Crovari P. et al. Evaluation of safety, tolerability and immunogenicity of 6 licensed influenza vaccines // J. Preventive Medicine and Hygiene. 1998. V. 39. P. 23 - 27.
9. Jefferson T.O., Rivetti D., Di Pietrantoni C. et al. Vaccines for preventing influenza in healthy adults / In: The Cochrane Library: Issue 2, 2007. Chichester, UK: John Wiley & Sons, Ltd.
10. Nicholson K.G., Kent J., Hammersley V. et al. Acute viral infections of upper respiratory tract in elderly people living in the community: comparative, prospective, population based study of disease burden // BMJ. 1997. V. 315. P 1060 - 1064.
11. Ohmit S.E., Victor J.C., Rotthoff J.R. et al. Prevention of antigenically drifted influenza by inactivated and live attenuated vaccines // N. Engl. J. Med. 2006. V. 355. P. 2513 - 2522.
12. Rothberg M.B., Haessler S.D. Complications of seasonal and pandemic influenza // Crit. Care Med. 2010. V. 38 (4). P 91 - 97.
13. Wilschut J.C., McElhaney J.E., Palache A.M. Influenza. 2nd ed. - ELSEVIR, 2006. - 240 p.
14. World Health Organisation (WHO). Recommendations on the use of rapid testing for influenza diagnosis. - Geneva, WHO, 2005.
