CC BY
911
ТОМ 1
НОМЕР 2
АПРЕЛЬ - ИЮНЬ 2008
КЛИНИЧЕСКАЯ
О Н КОгематология
ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ НАУКА — КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ
Белки теплового шока: биологические функции и перспективы применения
К. Д. Никитин
Heat shock proteins: biological functions and perspectives for applica- ------------------------------------------------------------------
tion Ключевые слова
к. d. Nikitin белки теплового шока, иммунотерапия, неходжкинская лимфома, хро-
Keywords: нический миелоидный лейкоз.
heat shock proteins, immunotherapy, non-Hodgkin lym- _____________д д д_______________________________
phoma, chronic myeloid leukemia.
N. N. Blokhin Cancer Research Center, Moscow Контакты: Kirill.d.nikitin@mail.ru Принято в печать: 15 апреля 2008 г.
ВВЕДЕНИЕ
Как и многие другие открытия, белки теплового шока были обнаружены во многом благодаря случайности, когда однажды вечером в одной из итальянских лабораторий кто-то случайно установил слишком высокую температуру в инкубаторе с плодовыми мушками Drosophila. На следующий день при исследовании хромосом из слюнных желез мушек были выявлены интересные изменения, свидетельствующие о необычном характере экспрессии генов [1]. Так было положено начало изучению группы белков, названных белками теплового шока (БТШ).
Название отражает некоторые свойства белков теплового шока, но далеко не все. Во-первых, БТШ синтезируются в некотором количестве постоянно в любых ядерных клетках, во множестве внутриклеточных структур (в цитоплазме, ядре, эндоплазматическом ретикулуме, митохондриях и хлоропластах) у всех многоклеточных организмов, начиная с самых примитивных, как у растений, так и у животных, вне зависимости от воздействия стрессовых факторов [2]. Даже в покоящихся клетках до 2 % всех белков могут составлять представители этого семейства. Во-вторых, повышение внутриклеточного синтеза БТШ происходит отнюдь не только на тепловой шок, но и на любое стрессовое воздействие: внешнее (УФ, тепловой шок, тяжелые металлы, аминокислоты), патологическое (вирусные, бактериальные и паразитарные инфекции, лихорадка, воспаление,
злокачественная трансформация, аутоиммунные реакции) или даже физиологическое (ростовые факторы, клеточная дифференциация, гормональная стимуляция, тканевый рост) [3]. Синтез БТШ является универсальным неспецифическим ответом клетки на стресс, и, по современным данным, нет такого вида клеточного стресса, при котором не происходило бы синтеза БТШ [4]. В некоторых случаях содержание БТШ в клетках, подвергнутых шоку, может достигать 20 % всех растворимых цитоплазматических белков.
Выделяют четыре основных семейства БТШ: 1) БТШ90 (HSP90) — группа высокомолекулярных БТШ, имеющих у млекопитающих молекулярную массу 90 кДа (у дрожжей — 104 кДа, у дрозофил — 83 кДа), наиболее изученным представителем семейства является Grp94 (от англ. glucose-regulated protein — белок, регулируемый глюкозой), или gp96 (от англ. glycoprotein — гликопротеид); 2) БТШ70 (HSP70) — семейство белков с молекулярной массой около 70 кДа, наиболее широко распространенные и лучше всего изученные БТШ млекопитающих; 3) малые БТШ, молекулярная масса которых варьирует от 15 до 30 кДа
[5]; 4) высокомолекулярные БТШ, представителем которых является gp110. Несмотря на общую задачу всех этих белков (обеспечение выживания клетки в условиях стресса), функции и тканеспецифичность БТШ варьируют от группы к группе как в нормальных условиях, так и при стрессе.
РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
125
К. Д. Никитин
Функции белков теплового шока
Функции БТШ невероятно многообразны и, несмотря на 30-летнюю историю интенсивного изучения, до конца не расшифрованы.
Известно, что БТШ являются универсальными молекулярными шаперонами (от англ. chaperon — сопровождать), т. е. белками, связывающимися с другими молекулами и в таком комплексе выполняющими определенные функции [6].
Основной функцией БТШ считается связывание новообразующихся белков и контроль корректного формирования их третичной структуры (фолдинга):
связываясь с растущими пептидными цепями еще на рибосоме, БТШ предотвращают их неспецифическую агрегацию, предохраняют их от преждевременного протеолитического распада и способствуют правильному и своевременному сворачиванию полипептида в трехмерную структуру. БТШ также связывают мутантные белки или белки, чья третичная структура уже сформировалась неверно, и защищают клетку от воздействия таких белков. Некоторые БТШ (представители семейства HSP70) обладают свойствами фермента, исправляющего неправильно сформировавшиеся белки за счет энергии АТФ [7, 8].
При воздействии любого стрессорного фактора из перечисленных выше активность БТШ резко возрастает. БТШ в клетке, подвергнутой стрессу, интенсивно связываются с денатурирующими белками и поддерживают поврежденные белки в состоянии, способном к последующему восстановлению [9, 10]. В норме БТШ присутствуют в цитоплазме в комплексе со специальным транскрипционным фактором HSF (от англ. heat shock factor — фактор теплового шока). При стрессорном воздействии HSF отделяется от БТШ, образует тримеры, приобретает ДНК-связывающую активность и накапливается в ядре, где активирует транскрипцию дополнительных шаперонов и подавляет транскрипцию других генов. По окончании стрессорного воздействия освободившиеся БТШ связывают HSF и переходят в исходное состояние.
Далее, БТШ участвуют в процессах транспортировки белковых молекул через мембраны митохондрий и ядерную оболочку [11], в процессинге (деградации) белков до антигенных пептидов и связывании процессированных пептидов с молекулами МНС I класса [12, 13].
БТШ участвуют в защите клеток от стресс-индуцируемого апоптоза, блокируя пути его активации и стабилизируя клеточные структуры [14]. Известно, что опухолевые клетки синтезируют повышенное количество БТШ [15], что предохраняет их от запуска апоптоза в ответ на стрессорные воздействия [16], а снижение синтеза БТШ в опухолях облегчает индукцию апоптоза и понижает их способность к прогрессированию [17—19].
Предполагается участие БТШ также в процессах некроза и очищения организма от некротизированных клеток. БТШ являются широко распространенными растворимыми внутриклеточными белками, могут служить надежными вестниками некроза, участвовать в межклеточном сигнализировании. В случае некроза клетки БТШ «сообщают» иммунной системе о необходимости утилизации некротических масс: высвобождение внутриклеточных БТШ происходит только в случае гибели клетки путем некроза, но не апоптоза [20].
При столь разнообразных функциях БТШ нет ничего удивительного, что они являются одними из самых консервативных и филогенетически древних белков организма: степень гомологии между БТШ эукариот и прокариот составляет более
50 %, а некоторые домены полностью идентичны [21]; структурное сходство БТШ человека и мыши достигает 95 %.
Иммуногенность белков теплового шока
Более 60 лет назад в экспериментах на животных было показано, что иммунизация сингенных мышей опухолевыми клетками делает их более устойчивыми к последующему повторному заражению этими клетками. Эти и другие эксперименты позволили сформулировать два важнейших принципа онкоиммунологии: 1) опухоли иммуногенны и 2) иммунитет против данной конкретной опухоли строго специфичен, т. е. каждая опухоль высоко индивидуальна по своему антигенному составу. Идентифицированы многочисленные молекулы, как мембранные, так и локализованные в клеточной цитоплазме, более или менее специфичные для различных видов новообразований [22]. Многие из них в настоящее время активно используются в клинической практике для диагностики злокачественных новообразований и определения их прогноза (а-фетопротеин, PSA, мембранные антигены лейкоцитов); попытки применения этих антигенов в качестве противоопухолевых вакцин пока что не увенчались успехом.
Одним из способов поиска опухоль-ассоциированных антигенов является разделение опухолевых гомогенатов на белковые фракции различными хроматографическими методами и иммунизация этими фракциями животных. Фракции, вызывающие протективный иммунитет против опухолевых клеток, из которых они получены, далее разделяются на еще более чистые составляющие и анализируются сходным путем до тех пор, пока не будет получен непосредственно тот белок, который и вызывает иммунитет. В 1980 г. в университете г. Хайдарабада (Индия) молодой ученый-биохимик Прамод Шривастава (Pramod Srivastava) исследовал имму-ногенность химически индуцированных сарком у грызунов, используя описанный выше подход. В итоге был идентифицирован ряд высокоиммуногенных молекул, определенных как белки теплового шока gp96. Опубликованная в 1984 г. работа П. Шриваставы стала первым описанием иммуногенных свойств у БТШ.
Иммуногенность БТШ характеризуется рядом уникальных особенностей. Известно, что БТШ не специфичны для каких-либо видов опухолей или даже для злокачественных новообразований вообще — они могут быть выделены из почти всех нормальных тканей организма. В то же время иммунитет, вызываемый БТШ, строго специфичен и направлен только против той одной-единственной опухоли, из ткани которой они были выделены: БТШ, выделенные из опухоли А, вызывают иммунитет только против опухоли А, но не против опухоли Б, и наоборот. Долгое время механизм, посредством которого БТШ вызывают столь высокоспецифичный иммунитет, оставался неясным.
Предполагалось, что специфичность БТШ в зависимости от опухоли связана с тканевой гетерогенностью БТШ, т. е. их соматическим полиморфизмом: БТШ одного и того же организма отличаются от ткани к ткани, от нормальной ткани к опухолевой, от опухоли к опухоли. Однако изучение последовательности комплементарных ДНК как опухолевых, так и нормальных БТШ не подтвердило эту гипотезу [23].
Поскольку препараты БТШ, использовавшиеся для определения их иммуногенности, были одинаковы по всем критериям, предположили, что за специфическую имму-ногенность разных образцов БТШ отвечают не собственно БТШ, а некие вещества, ассоциированные с БТШ, но не определяемые стандартными методами [24]. Это предположение получило неожиданное подтверждение. Было обнаружено большое количество пептидов, ассоциированных с
126
Клиническая онкогематология
Белки теплового шока
Hsp70 [25], а удаление их из препаратов Hsp70 лишало последних иммуногенных свойств [26]. Позднее была показана способность БТШ связывать фрагменты практически любых белков, как эндогенных, так и экзогенных, как природных, так и модельных. Получено множество убедительных доказательств того, что собственно иммунитет вызывают антигенные пептиды, комплексированные с белками теплового шока.
Так, D. Arnold и соавт. [27] показали, что иммунизация белком gp96, полученным из клеток, трансфецирован-ных геном ^3-галактозидазы, вызывает цитотоксический иммунитет против определенного эпитопа ^3-галактозидазы; аналогично иммунизация белком gp96 из клеток, экспрессирующих определенные антигены малого комплекса гистосовместимости, вызывает цитотоксический иммунитет против этих антигенов. T. J. Nieland и соавт. [28] идентифицировали вирусный эпитоп, ассоциированный с gp96, который был выделен из клеток, инфицированных этим вирусом; данный эпитоп не определялся с БТШ, выделенными из неинфицированных данным вирусом клеток. N. E. Blachere и соавт. [29] воспроизвели in vitro комплексы gp96-пептид и Hsp70-пептид и показали на примере широкого спектра пептидов, что БТШ и пептиды сами по себе не вызывают иммунного ответа, но их комплексы (БТШ-пептидные комплексы — БТШ-ПК) обусловливают пролиферацию цитотоксических СD8( + )-лимфоцитов. Сходные результаты были получены и в других исследованиях [30—32]. Способность БТШ к связыванию пептидов также подтверждается структурными исследованиями, в которых было показано наличие пептидсвязывающих карманов в молекулах Hsp70 и gp96 [33—35]. Предполагается, что наличие пептидсвя-зывающих структур в молекулах БТШ важно как для выполнения ими шаперонных внутриклеточных функций, так и для участия в процессах межклеточного взаимодействия при иммунных реакциях [36]. В то же время, несмотря на значительное число исследований, структурные требования для связывания пептидов с БТШ остаются не до конца понятными, поскольку первичные аминокислотные последовательности пептидов, элюированных из комплексов с БТШ, весьма различны.
Принципиально важным представляется тот факт, что из комплексов БТШ с пептидами, полученных из опухолевых клеток, выделяются и опухолевые антигены: Melan-A/ MART-1 для меланомы, CEA и EpCAM в случае колоректального рака и некоторые другие [37—39].
Каков механизм развития иммунного ответа на БТШ-ПК? Показано, что макрофаги, фибробласты и другие антигенпрезентирующие клетки (АПК) захватывают БТШ-ПК, выделяют из них непосредственно антигенные пептиды и презентируют их на своей поверхности эффекторным клеткам иммунной системы в комплексе с молекулами МНС I и II классов [40—44]. АПК, активированные БТШ-ПК, инициируют клеточный и гуморальный иммунные ответы против антигенов опухолей, из которых эти БТШ-ПК выделены. Этот процесс «репрезентации» (т. е. выделения антигенных детерминант из комплексов с одними молекулами и презентация в комплексах с другими) включает в себя перемещение антигенных пептидов по определенным внутриклеточным структурам и сопровождается также синтезом широкого спектра цитокинов и костимулирующих молекул [45].
На сегодняшний день известно, что взаимодействие БТШ-ПК с АПК осуществляется посредством специфического рецептора (или рецепторов) на поверхности этих клеток. Свидетельства существования рецептора (или рецепторов) БТШ-ПК были получены независимо несколькими группами исследователей [46—49].
Первым из таких рецепторов был идентифицирован CD91, он же рецептор а2-макроглобулина (а2-МГ) [50, 51], и взаимодействие БТШ-ПК с этим рецептором на сегодняшний день остается наиболее изученным. Связывание gp96-ПК с CD91 ведет к погружению (интернализации) комплекса в клетку и через последующие внутриклеточные события к презентации антигенного пептида в комплексе с молекулами МНС I и II классов. Моноклональные антитела к CD91 и а2-МГ ингибируют иммуногенные свойства gp96^^ Кроме того, экспрессия CD91 коррелирует со способностью АПК репрезентировать пептиды из gp96-ПК [52, 53]. В одном из исследований не было получено подтверждения роли CD91 как рецептора БТШ-ПК [54], однако это противоречие позднее было объяснено особенностями использованных экспериментальных методик.
В качестве рецепторов АПК к БТШ рассматриваются также молекулы LOX1 [55], TLR2 и TLR4 [56, 57], CD14 [58]. Возможно, взаимодействие БТШ происходит одновременно с множеством разных рецепторов на поверхности АПК, а разные рецепторы БТШ ответственны за развитие различных иммунных реакций. Например, с помощью CD91 и LOX1 происходит транспорт антигенных пептидов, находящихся в комплексе с БТШ, через межклеточное пространство и клеточные мембраны, а при связывании БТШ-ПК с CD14, TLR2 или TLR4 не происходит их интернализации, но запускается каскад внутриклеточного сигнализирования, в результате которого транскрипционный фактор NF-kB перемещается в ядро и происходит синтез клеткой широкого спектра провоспалительных цитокинов и костимулирующих молекул, способствующих дальнейшему развитию иммунного ответа [59].
Другие детали механизмов активации иммунного ответа при иммунизации БТШ — природа структур макрофагов, участвующих в захвате БТШ-ПК, механизмы транспортировки БТШ-ПК в эндоплазматический ретикулум, зависимость этих процессов от протеасом и, наконец, дальнейшая судьба самого gp96 — по-прежнему остаются неясными. Также остаются не изученными иммуногенность и механизмы действия других БТШ-ПК, хотя в этом направлении ведутся интенсивные исследования.
Таким образом, БТШ являются повсеместно распространенными молекулярными шаперонами, выполняющими многочисленные внутриклеточные функции. БТШ образуют комплексы со всеми возможными пептидами, синтезирующимися в клетке, как нормальными, так и чужеродными, мутантными или патологически измененными. В случае гибели клетки, в особенности по некротическому механизму, комплексы БТШ и внутриклеточных пептидов (БТШ-ПК) попадают во внеклеточное пространство и становятся доступными для клеток иммунной системы. На поверхности АПК предполагается наличие нескольких типов специфических рецепторов БТШ-ПК. Одни из них (CD91 и, возможно, LOX-1) опосредуют погружение БТШ-ПК в эндоплазматический ретикулум АПК, где происходит диссоциация БТШ-ПК на БТШ и пептиды. Последние в дальнейшем связываются с молекулами МНС I и, возможно, II классов и репрезентируются на поверхности АПК для распознавания эффекторны-ми клетками иммунной системы — Т-лимфоцитами. Другие рецепторы (предположительно TLR2, TLR4, CD14) связываются с БТШ-ПК, что ведет к запуску каскадов внутриклеточного сигнализирования, к активации АПК и синтезу ими широкого спектра цитокинов, преимущественно провоспалительных. В конечном итоге выход БТШ-ПК во внеклеточное пространство ведет к активации как врожденного (NK-клетки), так и адаптивного (цитотоксические лимфоциты) иммунитета.
www.medprint.ru
127
К. Д. Никитин
Применение белков теплового шока в онкогематологии
Свойства и функции белков теплового шока открывают широкие перспективы для их применения в медицине для производства самых разнообразных вакцин.
В последние годы идентифицировано множество опухоль-ассоциированных антигенов [52]. Многие из них в настоящее время активно используются в клинической практике для диагностики злокачественных новообразований и определения их прогноза (а-фетопротеин, PSA, мембранные антигены лейкоцитов). Однако попытки применения этих антигенов в качестве противоопухолевых вакцин пока что не увенчались успехом по ряду причин. Общая иммуногенность опухоли определяется огромным числом антигенов, в то время как вклад одного антигена в общую иммуногенность опухоли незначителен. Кроме того, слишком мала вероятность обнаружения одного и того же антигенного пептида в большом количестве различных опухолей.
В то же время БТШ, выделенные из опухолевых клеток, находятся в комплексе с широким спектром клеточных пептидов и теоретически могут нести в себе все антигены, присущие данной конкретной опухоли, весь ее антигенный репертуар. Соответственно, становится весьма привлекательной попытка применения противоопухолевых вакцин на основе очищенных БТШ-ПК, в первую очередь аутологичных (когда противоопухолевая вакцина приготавливается из опухолевой ткани самого больного).
Компания Antigenics Inc. (США) разработала коммерческую форму аутологичной противоопухолевой вакцины на основе БТШ-ПК, получившую название Onco-phage. Приготовление вакцины организовано следующим образом: хирургически удаленные метастазы опухоли замораживаются в жидком азоте и отправляются в лабораторию. Желательно получить не менее 3 г для приготовления непосредственно вакцины и, как правило, еще 1—2 г для проведения дополнительных исследований. В лаборатории из полученных образцов выделяются и очищаются БТШ-ПК. После контроля качества вакцина упаковывается и отсылается обратно в клинику.
Первая попытка вакцинации аутологичными БТШ-ПК у людей была проведена S. Janetzki и соавт. [60] на примере небольшой группы различных опухолей. Отмечено клиническое улучшение и активация Т-клеточного противоопухолевого ответа у некоторых больных. Впоследствии проведено значительное количество рандомизированных клинических исследований П—Ш фазы, включавших больных с самыми разнообразными видами опухолей, однако основное внимание было уделено возможностям лечения меланомы [61, 62], рака почки (опухоли, наиболее чувствительные к иммунотерапии вообще) и колоректального рака (опухоль, экспрессирующая значительное число раково-эмбриональных антигенов).
Опыт применения противоопухолевых вакцин на основе аутологичных БТШ у больных с онкогематологическими заболеваниями ограничен. На сегодняшний день опубликованы результаты двух клинических исследований I фазы: одно исследование вакцины на основе БТШ-ПК у больных неходжкинскими лимфомами и одно — у больных хроническим миелолейкозом.
Y. Oki и соавт. [63] исследовали эффективность и безопасность применения аутологичной вакцины на основе gp96, приготовленной из опухолевых образцов больных неход-жкинскими лимфомами. Вакцина вводилась внутрикожно по 25 мкг еженедельно в течение 4 нед., а затем каждые 2 нед. до прогрессирования заболевания или до тех пор, пока запас вакцины не был исчерпан. В исследование было включено
20 больных, из которых 18 имели III или IV стадию заболевания. Приготовить вакцину удалось для 17 больных. Количество полученной вакцины варьировало от 1 до 21 дозы на больного, но в среднем составило 5 доз на больного. У 3 больных количество полученной вакцины оказалось недостаточным для проведения лечения. Среднее количество вакцинаций составило 4 на больного.
Лечение вакциной теплового шока практически нетоксично. В исследовании Y. Oki и соавт. у больных отмечались преимущественно реакции в месте введения вакцины: зуд II степени у двоих больных, эритема II степени — у троих и I степени — у одного. Во всех случаях реакции развивались только при первом введении вакцины, не потребовали никакого дополнительного лечения и самостоятельно исчезли в течение 24 ч после инъекции. Аналогичная картина наблюдалась и в других исследованиях вакцин на основе БТШ-ПК. Безопасность применения вакцин на основе БТШ-ПК тщательно изучалась в каждом исследовании в связи с теоретической возможностью развития аутоиммунных реакций, однако среди более 900 пролеченных на сегодняшний день больных не было серьезных клинических или лабораторных свидетельств аутоиммунных реакций. Вакцины на основе БТШ-ПК хорошо переносятся, и побочные эффекты от их введения обычно ограничиваются местными реакциями или незначительным повышением температуры тела.
Представляется возможным применение вакцин на основе БТШ-ПК у больных хроническим миелолейкозом (ХМЛ), т. к. при этом заболевании опухолевые клетки синтезируют опухолеспецифический антиген, продукт гена, образующегося при транслокации между длинными плечами хромосом 9 и 22. Z. Li и соавт. [64] провели исследование безопасности применения иматиниба мезилата в сочетании с аутологичной вакциной на основе белков теплового шока Hsp70, выделенных из лейкоцитов больных. Всего в рамках исследования лечение получили 20 больных ХМЛ в хронической фазе. С помощью лейкафереза было получено в среднем 16,7 X 1010 лейкоцитов на больного (от 5 до
39,5 X 1010 клеток). Их этих клеток удалось приготовить в среднем 950 мкг вакцины на больного (от 300 до 1900 мкг). Всего больным проведено 160 инъекций. Токсичность иммунотерапии оказалась сопоставима с наблюдавшейся в других исследованиях. Токсические явления ограничивались реакциями в месте введения и умеренными проявлениями гриппоподобного синдрома (у одного больного), которые не требовали никакого дополнительного лечения и самостоятельно исчезали в течение 24 ч после инъекции. Исследование было спланировано таким образом, чтобы оценить в первую очередь токсичность и безопасность применения БТШ-ПК у больных ХМЛ, однако удалось сделать некоторые интересные наблюдения относительно эффективности данного лечения.
В исследовании оценивался иммунный ответ на лечение методом ELISPOT (определение числа Т-лимфоцитов, реактивных в отношении опухолевых клеток). Показана значительная корреляция между иммунным ответом и наблюдавшимися клиническими улучшениями. Наличие такой корреляции и эффективность применения комбинации БТШ-ПК + иматиниба мезилата у больных с резистентностью к монотерапии иматиниба мезилатом свидетельствуют о некотором терапевтическом эффекте применения БТШ-ПК (а именно, Шр70-ПК) у больных ХМЛ в хронической фазе, однако оценить его на основании результатов неконтролируемого исследования I фазы невозможно.
Следует признать, что практическая целесообразность применения иммунотерапии ХМЛ ограничена. На сегодняшний день иматиниба мезилат позволяет существен-
128
Клиническая онкогематология
Белки теплового шока
но повысить качество жизни и выживаемость при ХМЛ, а для лечения больных с резистентностью к иматиниба ме-зилату предложены препараты нилотиниб и дазатиниб. Тем не менее, результаты многочисленных исследований, включая и работу Z. Li и соавт., демонстрируют принципиальную возможность применения вакцин на основе БТШ-ПК, их высокую переносимость и низкую токсичность. Это создает предпосылку для дальнейшего исследования таких вакцин.
Клиническая эффективность вакцин на основе БТШ-ПК в большинстве проведенных на сегодняшний день исследований I—III фазы оказалась весьма умеренной: общая частота ответов (полные + частичные) у больных солидными опухолями не превышала 10 %. Однако необходимо учитывать, что практически все проведенные на сегодняшний день исследования вакцин на основе БТШ-ПК планировались для оценки в первую очередь безопасности этой новой медицинской технологии и включали больных с поздними стадиями злокачественных опухолей, во многих случаях получавших ранее по несколько различных режимов химиотерапии, т. е. резистентных к любому доступному на сегодняшний день лечению. Дальнейшие исследования помогут выявить группы больных, у которых данный иммунотерапевтический режим будет наиболее эффективен, и определить оптимальные дозы вакцины. Возможно, такие вакцины будут наиболее эффективны на ранних стадиях онкологических заболеваний, в неоадъювантном режиме, для первичной, вторичной или третичной профилактики опухолей. Кроме того, широкие перспективы имеет применение БТШ в качестве адъювантов для создания вакцин против опасных инфекционных заболеваний. Ведутся работы по созданию вакцины против ВИЧ, основанной на БТШ [65]. Разрабатываются новые подходы, которые позволят преодолеть многие недостатки аутологичных вакцин на основе БТШ, например: получение рекомбинантных БТШ [66] или генетическая модификация опухолевых клеток [67], вакцинация БТШ, выделенными из бактериальных клеток или нормальных тканей и связанными с антигенными пептидами in vitro, создание химерных белков путем слияния БТШ и антигенных пептидов [68, 69].
Аутологичные вакцины на основе БТШ представляют огромный интерес для онкологии. Безусловно, они не лишены недостатков. Во-первых, для приготовления вакцины требуется достаточно большой образец опухоли, по меньшей мере 2 г опухолевой ткани. Однако такая масса ткани требуется в настоящее время, и не исключено, что в дальнейшем будет разработана технология получения вакцины из небольших опухолей или микроскопических образцов ткани (например, полученных при тонкоигольной биопсии). Кроме того, остается неизвестным, зависит ли эффективность лечения от дозы препарата; возможно, эффективными окажутся совершенно незначительные количества вакцины. Во-вторых, приготовление вакцины занимает 4—6 нед. (даже при условии быстрого и бесперебойного транспорта опухолевых образцов из клиники в лабораторию). Основные недостатки вакцин на основе БТШ-ПК могут быть преодолены при дальнейшем развитии технологии их изготовления. Главным же преимуществом такого подхода служит то, что вакцинация аутологичными БТШ-ПК может вести к развитию иммунного ответа против множества антигенных эпитопов опухоли, при этом идентификации каждого из них не требуется.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, белки теплового шока представляются уникальным биологическим явлением, естественным адъювантом, многократно повышающим иммуногенность любого связанного с ними пептида. БТШ-ПК, полученные из опухолей, содержат не только нормальные пептиды, присущие всем тканям данного больного, но и все уникальные опухолеспецифические антигены, присущие данной опухоли. Это служит предпосылкой для исследования возможности создания аутологичных противоопухолевых вакцин на основе комплексов БТШ и внутриклеточных пептидов (БТШ-ПК). Можно надеяться, что в течение ближайших лет будут разработаны новые методы лечения, основанные на иммунных свойствах белков теплового шока, что позволит увеличить выживаемость больных с различными злокачественными новообразованиями.
ЛИТЕРАТУРА
1. Tissieres A., Mitchell H. K., Tracy U. M. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: Relation to chromosome puffs. J. Mol. Biol. 1974; 84: 389-98.
2. Craig E. A., Gross C. A. Trends. Biochem. Sci.1991; 16: 135-40.
3. Lindquist S, Craig E. The heat-shock proteins. Annu. Rev. Genet. 1988; 22: 631-77.
4. Feder M. E., Parsell D. A., Lindquist S. The stress response and stress proteins Cell Biology of Trauma. — Boca Raton: CRC Press, 1995. — P. 177-91.
5. Arrigo A.-P., Landry J. Expression and function of the low-molecular-weight heat shock proteins. In: The Biology of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones / R. I. Mo-rimoto, A. Tissieres, C. Georgopulos (eds.). — Cold Spring Harbor: Lab. Press, 1994. — P. 335-78.
6. Hartl F. U. Molecular chaperones in cellular protein folding. Nature 1996; 381: 571-9.
7. Freeman B. C.,Morimoto R. I. The human cytosolic molecular chaperones in hsp90, hsp70 (hsc70) and hdj-1 have distinct roles in recognition of a non-native protein and protein refolding. EMBO J. 1996; 15: 2969-79.
8. Hohfeld J., Hard F.-U. Posttranslational protein import and folding. Curr. Opin. Cell. Biol. 1994; 6: 499-509.
www.medprint.ru
9. Li Z., Srivastava P. K. Tumor rejection antigen gp96/grp94 is an ATPase: implications for protein folding and antigen presentation. EMBO J. 1993; 12: 3143-51.
10. Miyata Y., Yahara I. The 90 kDa heat shock protein Hsp90 binds and protects casein kinase II from self-aggregation and enhances its kinase activity. J. Biol. Chem. 1992; 267: 7042-7.
11. Horst M., Opplige W, Rospert S. et al. Sequence action of two hsp70 complexes during protein import into mitochondria. EMBO J. 1997; 16: 1842-9.
12. B erwin B., Rosser M. F., Brinker K. G., Nicchitta C. V. Transfer of GRP94(gp96)-associ-ated peptides onto endosomal MHC class I molecules. Traffic 2002; 3: 358-66.
13. Menoret A., Li Z., Niswonger M. L. et al. An Endoplasmic Reticulum Protein Implicated in Chaperoning Peptides to Major Histocompatibility of Class I is an Aminopeptidase. J. Biol. Chem. 2001; 276(36): 33313-8.
14. Mosser D. D., Caron A. W., Bourget L. et al. Role of the human heat shock protein hsp70 in protection against stress-induced apoptosis. Mol. Cell. Biol. 1997; 17: 5317-27.
15. Heike M., Frenzel C., Meier D., Galle P. R. Expression of stress protein gp96, a tumor rejection antigen, in human colorectal cancer. Int. J. Cancer 2000; 86: 489-93.
16. Jaattela M. Escaping cell death: survival proteins in cancer. Exp. Cell Res. 1999; 248: 30-43.
17. Kaur J., Ralhan R. Induction of apoptosis by abrogation of HSP70 expression in human oral cancer cells. Int. J. Cancer 2000; 85: 1-5.
18. Gurbuxani S., Bruey J. M., Fromentin A. et al. Selective depletion of inducible HSP70 enhances immunogenicity of rat colon cancer cells. Oncogene 2001; 20: 7478-85.
19. Jamora C., Dennert G., Lee A. S. Inhibition of tumor progression by suppression of stress protein GRP78/BiP induction in fibrosarcoma B/C10ME. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 7690-4.
20. Basu S., Binder R. J., Suto R. et al. Necrotic but not apoptotic cell death releases heat shock proteins, which deliver a partial maturation signal to dendritic cells and activate the NKkB pathway. Intl. Immunol. 2000; 12(11): 1539-46.
21. Yura Т., Nagai H., Mori H. Regulation of the heat-shock response in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 1993; 47: 321-50.
22. Novellino L., Parmiani G., Castelli C. A listing of human tumor antigens: March 2004 update. Cancer Immunol. Immunother. 2004, Aug 7.
23. Srivastava P. K. Peptide-binding heat shock proteins in the endoplasmic reticulum: role in immune response to cancer and in antigen presentation. Adv. Cancer. Res. 1993; 62: 153-77.
129
К. Д. Никитин
24. Srivastava P. K., Maki R. G. Stress induced proteins in immune response to cancer. Curr. Top Microbiol. Immunol. 1991; 167: 109-23.
25. Ishii T. et al. Isolation of MHC Class I-Re-stricted Tumor Antigen Peptide and Its Precursors Associated with Heat Shock Proteins hsp70, hsp90, and gp96. J. Immunol. 1999; 162: 1303-9.
26. Udono H., Srivastava P. K. Heat shock protein 70-associated peptides elicit specific cancer immunity. J. Exp. Med. 1993; 178: 1391-6.
27. Arnold D., Wahl C., Faath S. et al. Influences of transporter associated with antigen processing (TAP) on the repertoire of peptides associated with the endoplasmic reticulum-resident stress protein gp96. J. Exp. Med. 1997; 186: 461-6.
28. Nieland T. J., Tan M. C., Monne-van Mui-jen M. et al. Isolation of an immunodominant viral peptide that is endogenously bound to the stress protein GP96/GRP94. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 6135-9.
29. Blachere N. E., Li Z., Chandawarkar R. Y. et al. Heat shock protein-peptide complexes, reconstituted in vitro, elicit peptide-specific cytotoxic T lymphocyte response and tumor immunity. J. Exp. Med. 1997; 186: 1315-22.
30. Ciupitu A., Peterson M., O’Donnell C. et al. Immunization with a lymphocytic choriomeningitis virus peptide mixed with heat shock protein 70 results in protective antiviral immunity specific cytotoxic T lymphocytes. J. Exp. Med. 1998; 187: 685.
31. Navaratnam M., Deshpande M. S., Hari-haran M. J. et al. Heat shock protein-peptide complexes elicit cytotoxic T-lymphocyte and antibody responses specific for bovine herpesvirus 1. Vaccine 2001; 19: 1425-34.
32. Wells A., Rai S., Salvato M. et al. Hsp 72-mediated augmentation of MHC class I surface expression and endogenous antigen presentation. Int. Immunol. 1998; 10: 609.
33. Vogen S., Gidalevitz T., Biswas C. et al. Radicicol-sensitive peptide binding to the N-ter-minal portion of GRP94. J. Biol. Chem. 2002; 277: 40742-50.
34. Linderoth N. A., Popowicz A., Sastry S. Identification of the peptide-binding site in the heat shock chaperone/tumor rejection antigen gp96 (Grp94). J. Biol. Chem. 2000; 275: 5472-7.
35. Zhu X., Zhao X., Burkholder W. F. et al. Structural analysis of substrate binding by the molecular chaperone DnaK. Science 1996; 272: 1606-14.
36. S rivastava P. K., Menoret A., Basu S. et al. Heat shock proteins come of age: primitive functions acquire new roles in an adaptive world. Immunity 1998; 8: 657-65.
37. Castelli C., Ciupitu A. M., Rini F. et al. Human heat shock protein 70 peptide complexes specifically activate anti-melanoma T cells. Cancer Res. 2001; 61: 222-7.
38. Noessner E., Gastpar R., Milani V. et al. Tumor-derived heat shock protein 70 peptide complexes are cross-presented by human dendritic cells. J. Immunol. 2002; 169: 5424-32.
39. Ri voltini L., Castelli C., Carrabba M. et al. Human tumor-derived heat shock protein gp96 me-
diates in vitro activation and in vivo expansion of melanoma- and colon carcinoma-specific T cells. J. Immunol. 2003; 171: 3467-74.
40. Castellino F., Boucher P. E., Eichel-bergK. et al. Receptor-mediated uptake of antigen/ heat shock protein complexes results in major histocompatibility complex class I antigen presentation via two distinct processing pathways. J. Exp. Med. 2000; 191: 1957-64.
41. Hilf N., Singh-Jasuja H., Schild H. J. The heat shock protein gp96 links innate and specific immunity. Int. J. Hyperthermia. 2002; 18: 521-33.
42. S rivastava P. K., Udono H., Blach-ere N. E., Li Z. Heat shock proteins transfer peptides during antigen processing and CTL priming. Immunogenetics 1994; 39: 93-8.
43. Staib F., Distler M., Bethke K. et al. Crosspresentation of human melanoma peptide antigen MART-1 to CTLs from in vitro reconstituted gp96/ MART-1 complexes. Cancer Immun. 2004; 4: 3-17.
44. Srivastava P. Interaction of heat shock proteins with peptides and antigen presenting cells: chaperoning of the innate and adaptive immune responses. Annu. Rev. Immunol. 2002; 20: 395.
45. Berwin B., Hart J. P., Pizzo S. V., Nicchi-tta C. V. Cutting Edge: CD91-Independent CrossPresentation of GRP94(gp96)-Associated Peptides J. Immunol. 2002; 168: 4282-6.
46. Arnold-Schild D., Hanau D., Spehner D. et al. Cutting edge: receptor-mediated endocytosis of heat shock proteins by professional antigen-presenting cells. J. Immunol. 1999; 162: 3757-60.
47. B inder R. J., Harris M. L., Menoret A., Srivastava P. K. Saturation, competition and specificity in interaction of heat shock proteins (hsp) gp96, hsp90 and hsp70 with CD11b+ cells. J. Immunol. 2000; 165: 2582-7.
48. Singh-Jasuja H., Toes R. E., Spee P. et al. Cross-presentation of glycoprotein 96-associated antigens on major histocompatibility complex class I molecules requires receptor-mediated endocyto-sis. J. Exp. Med. 2000; 191: 1965-74.
49. Wassenberg J. J., Dezfulian C., Nicchit-ta C. V. Receptor mediated and fluid phase pathways for internalization of the ER Hsp90 chaperone GRP94 in murine macrophages. J. Cell. Sci. 1999; 12(pt. 13): 2167-75.
50. B inder R. J., Han D. K., Srivastava P. K. CD91: a receptor for heat shock protein gp96. Nat. Immunol. 2000; 1: 151.
51. Mazzaferro V., Coppa J., Carabba M. et al. Vaccination with autologous tumor-derived heat-shock protein gp96 after liver resection for metastatic colorectal cancer. Clin. Cancer. Res. 2003; 9: 3235-45.
52. Basu S., Binder R. J., Ramalingam T., Srivastava P. K. Immunity 2001; 14: 303-13.
53. Binder R. J., Srivastava P. K. Essential role of CD91 in re-presentation of gp96-chaperoned peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004; 101: 6128-33.
54. Berwin B., Hart J. P., Pizzo S. V., Nicchi-tta C. V. Cutting Edge: CD91-Independent CrossPresentation of GRP94(gp96)-Associated Peptides J. Immunol. 2002; 168: 4282-6.
55. Doody A. D. H., Kovalchin J. T., Mihalyo M. A. et al. Glycoprotein 96 can chaperone both MHC class I- and class II-restricted epitopes for in vivo presentation, but selectively primes CD8 + T cell effector function. J. Immunol. 2004; 172: 6087.
56. Asea A., Rehli M., Kabingu E. et al Novel signal transduction pathway utilized by extracellular HSP70: role of toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4. J. Biol. Chem. 2002; 277: 15028-34.
57. Roman E., Moreno C. Synthetic peptides non-covalently bound to bacterial hsp70 elicit peptide-specific T-cell responses in vivo. Immunology 1996; 88: 487-92.
58. Asea A., Kraeft S. K., Kurt-Jones E. A. et al. Hsp70 stimulates cytokine production through a CD14-dependent pathway, demonstrating its dual role as a chaperone and cytokine. Nat. Med. 2000; 6: 435-442.
59. B asu S., Suto R., Binder R. J., Srivastava P. K. Heat shock proteins as novel mediators of cytokine secretion by macrophages. Cell Stress Chaperones 1998; 3: 11.
60. Janetzki S., Polla D., Rosenhauer et al. Immunization of cancer patients with autologous cancer-derived heat shock protein gp96: a pilot study. Intl. J. Cancer 1996; 88: 232-8.
61. Eton O., East M., Ross M. I. et al. Autologous tumor-derived heat-shock protein peptide complex-96 (HSPPC-96) in patients with metastatic melanoma [abstract]. Proc Annu Meet Am Assoc Cancer Res. 2000; 41: 543. Abstract 3463.
62. Belli F., Testori A., Rivoltini L. et al. Vaccination of metastatic melanoma patients with autologous tumor-derived heat shock protein gp96-pep-tide complexes: clinical and immunologic findings. J Clin Oncol. 2002; 20: 4169-80.
63. Oki Y. et al. Experience with heat shock protein-peptide complex 96 vaccine therapy in patients with indolent non-Hodgkin lymphoma. Cancer 2007; 109: 77-83.
64. Li Z. et al. Combination of imatinib mesylate with autologous leukocyte-derived heat shock protein and chronic myelogenous leukemia. Clin. Cancer Res. 2005; 11(12).
65. Levey D. L., Brander C., Srivastava P. K. The potential of heat chock protein-peptide complexes as a therapeutic vaccine. J. HIV Ther. 2005; 10(3): 56-9.
66. Manjili M. H., Henderson R., Wang X.-Y. et al. Development of a recombinant HSP110-HER-2/ neu vaccine using the chaperoning properties of HSP110. Cancer Res. 2002; 62: 1737-42.
67. Massa C., Guiducci C., Arioli I. et al. Enhanced efficacy of tumor cell vaccines transfected with secretable hsp70. Cancer Res. 2004; 64: 1502-8.
68. Cho B. K., Palliser D., Guillen E. et al. A proposed mechanism for the induction of cytotoxic T lymphocyte production by heat shock fusion proteins. Immunity 2000; 12: 263-72.
69. Suzue K., Zhou X., Eisen H. N., Young R. A. Heat shock fusion proteins as vehicles for antigen delivery into the major histocompatibility complex class I presentation pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997; 94: 13146-51.
130
Клиническая онкогематология
